Biologia molekularna wykład z dn. 18.05.2011
Rekombinacja homologiczna
3. Ligacja nici
4. Miejsce skrzyżowania nici ulega migracji – jest to równoznaczne z wymianą nici pomiędzy rekombinującymi cząsteczkami i formowaniem odcinka hetero dupleksu, w obrębie którego nici są trochę różne (homologia zwykle nie oznacza identyczności) (RuvA i RuvB)
5. Cząsteczki z migrującym miejscem skrzyżowania nici ulegają izomeryzacji do tzw. struktury Holliday'a, wymaga to przestrzennej rotacji rekombinujących cząsteczek
6. Struktura ta jest rozkładana na 2 –niciowe cząsteczki DNA poprzez 2 nacięcia endonukleolityczne (RuvC) oraz następującą po nich ligację (ligaza DNA ). Nacięcia te mogą występować w dwóch alternatywnych płaszczyznach. Zachodzą one z jednakowym prawdopodobieństwem.
Trawienie w płaszczyźnie nr 2 zachodzi w obrębie nici rekombinantowych. W jego rezultacie (i następującej potem ligacji) powstają 2-niciowe cząsteczki rekombinantowe z odcinkami heterodupleksu.
Niezależnie od tego czy powstają cząsteczki rekombinantowe czy nierekombinantowe , zawsze zawieraja one odcinek heterodupleksu – w obrębie tej samej cząsteczki występują allele B i b.
Formowanie hetero dupleksu prowadzi do zjawiska tzw. Konwersacji genów- polega ono na przeniesieniu informacji genetycznej z jednej cząsteczki DNA do drugiej.
W rejonie heterodupleksu występują niedopasowane nici, które podlegają tzw. reparacji . Reparacja zachodzi losowo - raz jedna, raz druga nić jest wykorzystywana jako wzorzec, prowadząc do zmian b ->B (BB) lub B -> b (bb). Konwersacja może zmieniać stosunek liczbowy alleli wśród komórek będących produktami pojedynczej mejozy (odstępstwo od dziedziczenia mendlowskiego).
Rekombinacja miejscowo-specyficzna- integracja genomu faga X do chromosomu E. coli. Zdarzenie rekombinacyjne zachodzi w obrębie miejsc attP faga i Attu bakterii, które same w sobie wykazują homologię sekwencyjną, ale indukują rekombinację cząsteczek różniących się w obrębie powstałych rejonów DNA.
Proces integracji katalizuje fagowa integraza (Int.) Do wycięcia potrzebna jest dodatkowa fagowa wycinaza (Excisionase –Xis). Oba procesy wymagają udziału bakteryjnego białka IHF.
Rekombinacja miejscowo-specyficzna- tworzenie funkcjonalnych genów kodujących łańcuchy ciężkie i lekkie immunoglobulin.
Reorganizacja genów kodujących łańcuch(y) ciężkie.
W komórkach B pierwsza rekombinacja zachodzi pomiędzy wybranym segmentem D i J (odcinek DNA pomiędzy nimi ulega delecji). Druga rekombinacja łączy kompleks DJ z wybranym segmentem V (odcinek pomiędzy nimi ulega delecji). Odcinek sekwencji spomiędzy kompleksu VDJ i segmentu kodującego cześć stałą łańcucha ciężkiego jest usuwany na etapie składania RNA
Reorganizacja łańcuchów lekkich
Źródła zmienności i przeciwciał
Dobór segmentów V, D i J w czasie rekombinacji
Dobór łancuchów H i L w cząsteczce przeciwciała
Różnorodnośc złączy pomiędzy segmentami V, D i J
Mutacje w obrębie sekwencji kodujących rejony nadzmienne
Liczba możliwych kombinacji segmentów V, D i J wynosi 15 000 000. Różnorodność złączy (nieprecyzyjna rekombinacja) i mutacje zwiększają tą liczbę do miliardów.
Biologiczna rola rekombinacji DNA:
Generuje nowe kombinacje alleliczne (crossing over w czasie mejozy)
Generuje nowe geny (np. geny dla łańcuchów L i H immunoglobulin)
Odpowiada za integrację cząsteczek DNA w genomie
Bierze udział w naprawie DNA
Praktyczne wykorzystywanie rekombinacji DNA:
Konstrukcja map genetycznych (częstość rekombinacji jest poporcjowana do fizycznej odległości pomiędzy genami)
Otrzymywanie organizmów transgenicznych
KLASA I : Retrotranspozony (retropozony)
Ich oryginalne kopie są przepisywane na RNA w procesie odwrotnej transkrypcji (często w retrotranspozonie znajduje się gen kodujący odwrotna transkryptazę)
C DNA ulega insercji w nowej lokalizacji genomowej (mechanizm copy and paste, zwany też transkrypcją replikatywną)
Transkrypcja – rezultat aktywności transkrypcyjnej komórki
Odwrotna transkrypcja– proces przepisania jednoniciowego RNA (ssRNA) przez enzym odwrotną transkryptazę (RT) na dwuniciowy DNA.
Retrotranspozony: - wirusowe- przypominają retrowirusy (możliwe iż dały im początek), posiadają dlugie, terminalne powtórzenia (LTRs), kodują odwrotna transkryptazę, zajmują ok. 8% ludzkiego genomu.
LTRs- powtórzenie proste, o długości od 100 do 5000 bp
Na podstawie różnic w sekwencji oraz układzie sekwencji kodujących wyróżniono grupy retrotranspoznów wirusowych:
-Ty 1-copia-like
-Ty 3-gypsy-like
-Pao-BEL-like