Wykład 22.02.2011r.

• Kwasy nukleinowe składają się z jednostek zwanych nukleotydami

• Nukleotyd złożony jest z grupy fosforanowej, zasady azotowej oraz pięciowęglowego cukru (nukleozyd, w którym alkoholowa grupa cząsteczki cukru została zestryfikowana kwasem fosforowym (V))

• Nukleozyd złożony jest z zasady azotowej oraz pięciowęglowego cukru

• Na zewnątrz L-helisy panuje środowisko hydrofilowe (wodolubne), wewnątrz zaś- środowisko hydrofobowe

• Na jeden skręt helisy (w konformacji B) składa się 10, 5 par zasad azotowych

• Deoksyryboza- brak tlenu przy drugim węglu, zamiast- dwucząsteczkowy wodór. Deoksy, znaczy zredukowana, czyli pozbawiona tlenu. Ryboza nie jest cukrem zredukowanym, zawiera, bowiem przy drugim węglu atom tlenu, co w połączeniu z wodorem daje grupę hydroksylową.

• Źródło informacji genetycznej (kwasy nukleinowe) musi być stabilne, czego powodem jest występowanie różnego rodzaju wiązań. Wiązania estrowe, N- glikozydowe, wodorowe.

• Wiązanie estrowe występuje pomiędzy resztą kwasu fosforowego (V), a pentozą

• Wiązanie N-glikozydowe- silne wiązania kowalencyjne występujące pomiędzy cukrem, a zasadą

• Pomiędzy Adeniną i Tyminą- 2 mostki wodorowe, pomiędzy Guaniną i Cytozyną 3 mostki wodorowe. Wiązania wodorowe występujące pojedynczo są stosunkowo słabe, jednakże ich ogromna ilość w DNA powoduje, że są doskonałymi stabilizatorami

• Cząsteczka ATP to trzy reszty fosforanowe dołączone do cukru i zasada połączona z cukrem

• RNA dzięki obecności grupy hydroksylowej posiada więcej właściwości niż DNA.

• Zasady azotowe mogą przyłączać protony, gdy znajdują się w odpowiednich roztworach fizjologicznych.

• Pirymidyny to zasady o pojedynczym pierścieniu węglowo- azotowym (C, T, U), Puryny to zasady o podwójnym pierścieniu (A, G)

• Kwasy nukleinowe odkrył Fryderyk Michelle, Watson i Crick przedstawili model cząsteczki DNA

• Zasada Chargaffa mówi, iż ilość zasad purynowych jest równa ilości zasad pirymidynowych [A]+[G]=[C]+[T] . Zasada ta mogła zostać opracowana dzięki chromatografii, dokładnie bibułowej. Kompozycja zasad w DNA definiowana jest, jako procent [G]+[C] i różni się wśród gatunków, ale jest stała w jądrach komórkowych danego organizmu.

• Na końcu 5’ występuje funkcjonalna grupa fosforanowa. PO₄ nadaje RNA i DNA właściwości kwasów w fizjologicznych warunkach pH. Grupa ta połączona jest z pentozą wiązaniem estrowym, bardzo stabilnym. Po uformowaniu wiązania estrowego jeden atom tlenu z grupy fosforanowej jest ciągle najonizowany ujemnie. Ujemnie naładowany fosforan jest prawie zupełnie nierozpuszczalny w lipidach, co zapewnia zatrzymanie kwasów nukleinowych w błonie jądrowej.

• Przy 3’ występuje funkcjonalna grupa hydroksylowa, która umożliwia syntezę nowego łańcucha nukleotydowego.

• RNA ma zróżnicowaną długość, od mniej niż 100 do tysięcy nukleotydów, którą mierzymy w nt (nukleotyd)

• Komórkowy DNA może mieć długość setki milionów nukleotydów, mierzy się to w parach zasad (pz)

DRUGORZĘDOWA STRUKTURA DNA

• Struktury pierwszorzędowe DNA i RNA są na ogół podobne, jednak ich konformacje znacznie różnią się od siebie

• DNA może występować w formie pojedynczego polinukleotydowego łańcucha oraz w formie dwułańcuchowej helisy (dwułańcuchowy heliks)

• Chemiczną stabilność dla heliksu DNA dostarczają niepolarne, hydrofobowe stosy zasad azotowych. Zasady te tworzą stos poprzez skręt helikalny; eliminuje to możliwość powstania przerwy pomiędzy zasadami i wyklucza maksymalnie obecność wody z wnętrza podwójnego heliksu. Można stwierdzić, że cząsteczka DNA na swoisty rdzeń hydrofobowy.

• Szkielety cukrowo- fosforanowe nie są dokładnie rozmieszczone i w efekcie tworzy się główny i mniejszy rowek DNA. Główny rowek ma znaczenie w interakcji białko- DNA (sekwencyjna specyfika)

• Struktury drugorzędowe DNA to:

• Forma zapinki do włosów

• Struktura krzyżowa

• Struktura pętlowa

• Trójniciowe DNA

KONFORMACJE B, A i Z

• Konformacja B jest powszechna, opracowana została przez Watsona i Cricka. DNA przyjmuje postać prawoskrętnej helisy, na jeden skręt przypada 10,5 pz. Większy rowek jest szeroki i umiarkowanie głęboki, mniejszy natomiast wąski i również umiarkowanie głęboki. Występuje w warunkach wysokiego uwodnienia i stosunkowo niskiego stężenia soli. Takie warunki panują np. w komórce organizmów żywych (zwierzęta, rośliny)

• Konformacja A pojawia się, gdy środowisko jest mniej uwodnione, a stężenie soli jest z kolei wysokie. DNA przyjmuje postać prawoskrętnej helisy, gdzie na jeden skręt przypada 11 pz. Główny rowek jest trochę węższy niż w konformacji B, jest też głęboki. Rowek mniejszy jest płytki i szeroki.

• Konformacja Z- DNA występuje w momencie dużej zawartości alkoholu w organizmie i podczas wysokiego stężenia w nim soli. Jest to helisa lewoskrętna, na jeden skręt przypada 12 par zasad. Główny rowek jest płytki i w pewnych punktach zanika, mniejszy natomiast wąski i głęboki. Konformacja Z po ustaniu pewnych warunków (stężenie soli i alkoholu) wraca z powrotem do konformacji B.

UPAKOWANIE DNA W JĄDRZE KOMÓRKOWYM

• Wynika z konieczności usytuowania w ściśle wyznaczonym miejscu

• Całkowita długość DNA jest większa niż średnica jądra komórkowego. Pakowanie DNA w jądrze możliwe jest dzięki połączeniu go z białkami histonowymi i niehistonowymi. Współczynnik upakowania= długość całkowitego DNA/ max. upakowanie DNA

Najkrótszy chromosom ludzki ma długość 4,6 x 10^-2 pz DNA, co równa się 14 tys. Mikrometrów wolnego DNA. W stanie maksymalnej kondensacji chromosom ma 2 mikrometry. Wskaźnik upakowania wynosi, więc 14000:2= 7000 razy

• Upakowanie DNA polega na owinięciu nici wokół białka, histonowego:

• Nukleonom (nić DNA z H2A, H2B, H3, H4)

• Pętla

• Zrąb

• Domeny

• Chromosom metafazowy

• W jądrze komórek eukariotycznych DNA występuje w połączeniu z histonami i nie histonami. Te trzy elementy tworzą chromatynę, która jest środowiskiem epigenetycznej kontroli aktywności genów.

UPAKOWANIE DNA U BAKTERII

• U bakterii (E. coli) występują białka histonopodobne, organizują DNA bakteryjny w odpowiednie struktury. Wyróżniamy cztery białka histonopodobne: HU, IHF, FIS, H-NS.

HU wykazuje podobieństwo do H2B. Białko to występuje, jako tetramer, wokół którego owija się DNA w liczbie 60 pz i tworzy się struktura nukleosomopodobna. Nie wiadomo, czy tetramery są rozmieszczone regularnie wzdłuż DNA. W jądrze e. coli występuje 60 tys. tego białka.

STRUKTURA I FUNKCJE RNA

• Drugorzędowa

• Większa różnorodność strukturalna i funkcjonalna niż u DNA

• Występują moduły strukturalne (motywy drugo i czwartorzędowe), dzięki temu, RNA może działać jak białko

• Łańcuch RNA zawija się w unikatowe struktury trójwymiarowe, tworzy pętle

• RNA jest zaangażowany w wiele procesów komórkowych, tworzy kompleksy z białkami, są zaangażowane w replikację i procesy naprawcze

Struktury drugorzędowe RNA obejmują:

• Uwypuklenie (bul ges)

• Helisa par zasad albo rdzeń

• Jednoniciowe zapinki

• Wewnętrzne pętle

• Łączniki

RNA to zbiór stosunkowo sztywnych rdzeni złożonych z par zasad Watsona i Cricka i jednoniciowych pętli ograniczonych przez rdzenie.

• tRNA

• po transkrypcji łańcuch tRNA jest dwa razy dłuższy od dojrzałej cząsteczki RNA

• po obróbce potranskrypcyjnej tRNA ma 76 nukleotydów

• tRNA zawijają się uzyskując ten sam kształt w komórce

• dalsza modyfikacja zasad (dotyczy 50 nukleotydów) odbywa się poprzez metylację, kompletną restrukturyzację pierścienia purynowego

• WSPÓLNE CECHY DLA KAŻDEGO RNA

• Motyw pseudowęzła- typowy dla telomerazy

• A- minor motyw

• Tetra pętle

• Zamek rybozowy

• Skręt „druciany”

Wykład 01.03.2011r.

GENOMOWY DNA

Genomowy DNA jest niejednorodny sekwencyjnie. Wyróżnia się w nim odrębne, cztery główne typy sekwencji nukleotydowych:

• Odwrócone powtórki - palindromy 1-2% całej ilości DNA

• Sekwencje te występują w obszarze regulatorowych genów, w górę od sekwencji kodujących- w kierunku 5’

• Tworzą różne formy przestrzenne, np. trójwymiarowe

• Występują zapinki

• Wysoce powtarzalne sekwencje ok. 10% całego DNA

• Zbudowane są w większości z powtórek zorganizowanych tandemowo

• Każda powtórka składa się z ok. 100 pz

• Występują w obszarach telomerów i centromerów (w postaci chromatyny zespiralizowanej)

• Umiarkowanie powtarzalne sekwencje 20-30% całego DNA

• Frakcja ta jest bardzo zmienna

• Powtarzalne są geny rRNA oraz globiny- tworzą rodziny w typie umiarkowanie powtarzalnych

• Stanowią 3% całkowitego DNA

• Składają się z 300 000 do 500 000 kopii motywu 300 pz

• Unikatowe sekwencje nukleotydowe 50% DNA (u prokaryota prawie całe DNA)

• Są to sekwencje kodujące białka

• Występuje kilkanaście sekwencji tworzących rodziny

• Rozmieszczenie sekwencji kodujących białka występuje wewnątrz sekwencji wysoko powtarzalnych

GENOM BAKTERYJNY

Bakterie to organizmy bezjądrowe, gdzie cała informacja genetyczna upakowana jest w nukleoidzie oraz w wolnych odcinkach plazmidach (nie integrują się z chromosomem bakteryjnym). U BAKTERII NIE MA WYSOCE POWTARZALNYCH SEKWENCJI- JEDYNIE BEZPOŚREDNIO UNIKATOWE!

Wszystkie prokariota muszą umieścić w komórce DNA, które jest 1000 razy większe od całej komórki. Modelowym organizmem do opisu genomu bakteryjnego jest E. coli.

• Genom E. coli to dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA o wielkości 4700000 pz.

• Brak wolnych końców 5’ i 3’

• Cząsteczka DNA jest bardzo skondensowana, czyli superzwinięta- tworzy jajowatą strukturę- nukleoid

• Upakowanie DNA jest efektem działania białek HU, HNS, SMC

• Białka HU i HNS są w genomie E. coli reprezentowane w obfitości, łączą się z DNA tworząc superzwinięte domeny ( 20000- 100000 pz). Połowa z tych domen nigdy się nie rozwija, zwinięcie to jest negatywne, czyli niezgodne z ruchem wskazówek zegara.

• Negatywne superzwoje są utrzymywane przez topoizomerazy.

• Szczególnym rodzajem topoizomeraz jest enzym gyraza, który usuwa pozytywne superzwoje, powstające podczas replikacji DNA oraz transkrypcji.

Genom bakteryjny, jako całość zorganizowany jest od 50 do 100 wielkich pętli lub domen. Wielkość domen (50000- 100000 pz). Końce tych domen łączą się z kompleksem białek błonowych tworząc macierz nukleoidową, swoiste rusztowanie dla genomu bakteryjnego.

Genom jest ujemnie zwiniętą superhelisą. Domeny mogą być niezależne od siebie pod względem położenia- mogą utrzymywać różny poziom superhelikalności.

PLAZMIDY (WYSTĘPUJĄ U WSZYSTKICH BAKTERII!!!)

• Forma dwuniciowego DNA

• Stanowi od 0, 1 do 5% ilości całego DNA w nukleoidzie, występuje w cytoplazmie bakteryjnej

• Wielkość plazmidu waha się od 2 000 do 100 000 pz.

• Wyróżnia się także rzadziej spotykane plazmidy liniowe

• Plazmidy są autonomiczne- same replikują swoje DNA, w czasie podziału komórkowego jedna kopia informacji zawartej w plazmidzie trafia do komórki potomnej

• Plazmidy mają wiele genów posiadających odporność na antybiotyki, stąd stanowią nośniki w technologii

• Plazmidy w stosunku do komórki gospodarza mogą mieć charakter pasożytniczy lub symbiotyczny

• Oprócz plazmidów w komórce bakteryjnej występują episomy. Są one również autonomiczne, jednakże mogą integrować z bakteryjnym chromosomem. Przykładem episomu jest czynnik F, który kontroluje koniugację bakterii oraz wymianę pomiędzy nimi genów.

BAKTERIOFAGI- GENOM

• Zróżnicowane genomowo organizmy- ich genom może stanowić: Jednoniciowe, dwuniciowa, kolisty lub liniowy DNA

• Cząsteczka DNAu bakteriofagów jest naga, ochronę dla niej stanowi jedynie białkowy płaszcz faga

• Wirus lambda- genom to dwuniciowe, liniowe DNA o długości 17 mikrometrów. Średnica kapsydu tego wirusa wynosi jedynie 0,1 mikrometra, co świadczy o konieczności precyzyjnego upakowania cząsteczki DNA- odpowiedzialny jest za to enzym- terminaza.

• Wszystkie fagi mają kapsyd, a wewnątrz niego długie DNA. Po upakowaniu DNA do wnętrza wirusa pojawia się ogon wiralny.

SSACZE WIRUSY DNA- GENOM

• „Chytre” wirusy, atakujące komórki ssaków. Wnikając do ssaczej komórki przestawiają jej metabolizm i podporządkowują go swoim procesom, głównie namnażania.

• Do ssaczych wirusów zaliczamy papovavirusy- ich genomy są bardzo zróżnicowane.

• Wirus papilloma (brodawczak ludzki)- dwuniciowe, koliste DNA- wywołuje raka szyjki macicy

• Wirus małp Rezus- dwuniciowe, koliste DNA

• Adenowirusy- dwuniciowe, liniowe DNA

• Wirusy te wykorzystują własne białka zasadowe do upakowania swojego DNA, bądź białka gospodarza (rozpoznanie ułatwia brak frakcji H1)

EUKARIOTYCZNE WIRUSY RNA- GENOM

• Ten typ wirusów infekcyjnych posiada, jako materiał genetyczny RNA

• Wirusy RNA są niezwykle trudne do zwalczenia, gdyż często mutują, zmieniając tym samym swoje białka. Z tego powodu umykają one białkom odpornościowym gospodarza oraz antybiotykom.

• Wirusy te mają różną wielkość i kształt, mogą, ale nie muszą posiadać płaszcza białkowego.

• Po wniknięciu do komórki gospodarza wirusy RNA namnażają swój materiał genetyczny bez udziału DNA (samo replikacja).

• Wyróżniamy 3 rodzaje eukariotycznych wirusów RNA:

• WIRUSY O NICI (+)

Kodują białka w sposób bezpośredni, gdyż ich materiał genetyczny jest matrycą do syntezy białek. Wirusy to: polio, zapalenia wątroby typu A, pryszczycy. Wywołują choroby racic i pyska bydła, wirusowe zapalenie wątroby typu A, przeziębienia, choroby układu pokarmowego i nerwowego, błon śluzowych, paraliż dziecięcy- Heinego i Medina.

• WIRUSY O NICI (-)

Najpierw muszą zsyntetyzować nić (+), która ma charakter mRNA, aby móc syntetyzować białka. Są to wirusy wywołujące bardzo poważne choroby, np. wirus grypy, ebola, śpiączka, odra.

• WIRUSY O DWUNICIOWYM RNA

Do tej grupy należą wirusy rodziny reowirusów, tj. rotawirusy. Występują rzadko, powodują biegunki u dzieci i niemowląt. Oddzielne cząsteczki dwuniciowego RNA, kodują białko wiralne.

RETROWIRUSY I WIROIDY- GENOM

• Retrowirusy to wirusy RNA guzów, są rakotwórcze. Ich genom stanowi Jednoniciowe RNA. Replikują za pomocą DNA na drodze odwrotnej transkryptazy. Następuje konwersja RNA do dwuniciowego DNA i to właśnie to DNA wstawiane jest do DNA gospodarza. Pozostaje w nim na zawsze, najczęściej w formie uśpionej. Do tej grupy należy wirus HIV1.

• Wiroidy są to małe cząsteczki patogenne, wywołujące choroby u roślin wyższych. Ich genom to kolista cząsteczka RNA, liczy od 250 do 400 nukleotydów.

WYKŁAD 8.03.2011r.

TOPOIZOMERAZY

• Enzymy biorące udział w upakowaniu DNA w jądrze komórkowym, replikacji i transkrypcji. Są celem ataku antybiotykowego oraz rakowego.

• Regulują stopień negatywnego superzwinięcia cząsteczki DNA (doprowadzają do tego, że nić DNA jest luźniej zwinięta). Żeby zmienić liczbę nawinięć DNA, topoizomerazy muszą przeciąć nici DNA- jedną lub dwie. Oddziałują one na tyrozynę w rdzeniu cukrowo- fosforanowym DNA i łączą się kowalencyjnie jednym końcem DNA przez wiązanie fosfotyrozynowe.

• Wyróżniamy 2 klasy topoizomeraz:

  • TOPOIZOMERAZA I- przecina jedną nić, zmienia liczbę nawinięć o +/- 1 , co umożliwia przejście jednej nici przez powstałą przerwę. Tak tworzy się m.in. oczko replikacyjne.

  • TOPOIZOMERAZA II- do działania wymaga hydrolizy ATP, przecina dwie nici DNA i pozwala na przejście odcinka dwóch nici przez przerwę, co powoduje zmianę o +/- 2 owinięcia. Zastosowanie w zjawisku c.o.

• U E. coli topoizomeraza II to gyraza. Używa ona hydrolizy ATP, usuwa dodatnie superzwoje, powstające podczas replikacji.

• Topoizomeraza II rozłącza cząst. DNA, które powstają w czasie replikacji- u bakterii funkcję tą pełni topoizomeraza IV.

• Topoizomerazy I i II są wrażliwe na leki przeciwbakteryjne, u ludzi są podatne na działanie leków przeciwnowotworowych.

• Topoizomerazy mogą relaksować cząsteczkę DNA bez nakładu energii, gdyż regulują automatycznie liczbę superzwojów- 1 superzwój na 200 pz. Jest to tzw. mechanizm automatyczny DNA, równoważący aktywność dwóch topoizomeraz.

Jeżeli negatywne superzwijanie jest większe niż 1 superzwój na 200 pz, to topoizomeraza indukująca jest blokowana, a stymulująca topoizomeraza uwalniająca superzwoje. Mechanizm ten jest regulowany genetycznie.

MAŁE GENOMY

Bakterie

• Wielkość genomu > 0,05 pikograma= 1 x 10⁹ pz DNA (najmniejszy u Mykoplazm)

• U bakterii liczba par zasad waha się od 5 x 10⁷ dla większych organizmów, a np. dla wirusa phi XA4 tylko 5386 pz w jednoniciowym DNA.

• U e. coli genom ma ok. 1100 mikrometrów długości, składa się z ok. 3,4 x 10⁶ pz i zawiera ok. 1800 genów. DNA nie jest połączony z histonami, w związku z tym nie ma chromatyny.

Charakterystyczne dla e. coli są:

• Geny kodujące pewne szlaki metaboliczne mają wspólne operatory, promotory i regulatory. Tworzą jednostki transkrypcyjne zwane operonami.

• Operony nie są równomiernie rozmieszczone w genomie.

• Jedne miejsce inicjacji replikacji- ori.

Od niego rozpoczyna się replikacja DNA, która postępuje w obu kierunkach kolistej cząst. DNA, aż do momentu, w którym obie zsyntetyzowane nici się spotykają.

GENETYCZNE ELEMENTY RUCHOME U PROCARYOTA

Transpozony

• Każdy z tych elementów ma liczne sygnały stop, kodony oraz terminalne, odwrócone powtórki sekwencyjne. Nazwano je sekwencjami „wstawkowymi”- IS, które tworzą jeden z licznych typów sekwencji transpozycyjnych- transpozonów, znalezionych w genomie bakterii, a ich wielkość waha się od ok. 800 pz do ok. 1400 pz. Każdy element ma gen kodujący enzym transpozazę.

• Transpozaza rozpoznaje sekwencje powtórzone na końcach elementu i wycina go.

• Końcowe, proste, odwracalne powtórki są miejscami ułatwiającymi integrację elementu ruchomego z genomem bakterii.

• Wiele plazmidów w komórce bakteryjnej zawiera zintegrowane transpozony i to one zapewniają po części zachowanie przez plazmid autonomii.

• U bakterii elementy ruchome dzielą się na 3 klasy:

I klasa- sekwencje wstawkowe- IS, zbudowane z centralnego odcinka DNA, ograniczonego dwoma kopiami SI, w których jest zawarta informacja o transpozycji. IS są zdolne do przemieszczania się.

II klasa- duże, złożone transpozony, np. plazmid Tn3

III klasa- transpozycyjne bakteriofagi

Istnieją też elementy, które nie mogą być zaliczone do żadnej klasy: Tn7, Tn916.

• Stres wpływa na uruchomienie elementów ruchomych i wbudowanie ich do genomu.

• Proces transpozycji nie wymaga obecności odcinków homologicznych do sekwencji w chromosomie. Krytycznym momentem jest integracja końców transpozony z genomem. Włączeniu elementu do tarczy DNA towarzyszy duplikacja sekwencji DNA w miejscu włączenia.

• Pewne transpozony wykazują preferencję do miejsc szczególnych, podczas gdy inne włączają się w losowo wybrane miejsca.

• Wyróżniamy dwa modele transpozycji (analogia do Eukariota):

• REPLIKATYWNA

Charakteryzuje się tym, że następuje precyzyjne łączenie się sekwencji transpozonów

z sekwencjami DNA tarczy. Element przenoszony ulega replikacji. Jedna kopia elementu pozostaje w miejscu powstania cząst. DNA donora, a druga kopia integruje w miejscu „tarczy”

• KONSERWATYWNA

W tym modelu element transpozycyjny jest wycinany z donorowego DNA w miejscach na obu końcach elementu i na obu niciach DNA, po czym włączany jest do cząst. tarczy. Nie ma syntezy DNA, za wyjątkiem DNA potrzebnego do uzupełniania przerw w miejscach włączania elementu. Pozostałości donorowego replikonu są usuwane z komórek gospodarza.

GENETYCZNE ELEMENTY RUCHOME U EUCARYOTA

• Genetyczne elementy ruchome należą do klasy sekwencji powtarzalnych DNA.

• Ich cechą unikatową jest to, że są ruchome- skaczące geny, elementy transpozycyjne.

• Odkryła je Barbara McClintock w latach 1940 w czasie badania mutacji niestabilnego zabarwienia ziarniaków kukurydzy.

• Transpozony są wszechobecne. Elementy te mogą wywoływać zmiany mutacyjne w genomie, jednak ich sposób działania różni się od działania poznanych czynników mutagennych.

• Są zdolne do włączania się w różnych miejscach w genomie, nie wymagają do tego sekwencji homologicznych DNA dla rekombinacji. Wpływają na funkcje genów, w których są włączone.

• Można je odróżnić od mutacji tym, że ich działanie ma charakter komórkowy oraz na podst. Niezwykle częstego powrotu fenotypu zmutowanego do jego postaci pierwotnej.

• Jeżeli element zostanie włączony w obszar genu warunkującego kolor czerwony, to wtedy zabarwienie danej partii rośliny będzie białe. Jeżeli jednak w określonych komórkach nastąpi wycofanie się elementu z obszaru tego genu to w tym miejscu pojawi się czerwony barwnik na białym tle. Powstanie fenotyp mozaikowy.

• Bezwzględnym warunkiem poruszania się transpozonów jest obecność sekwencji kodującej enzym- transpozazę. Poruszanie jest także możliwe dzięki enzymom kodującym duplikacją, wycinaniem, integracją i sposobem transkrypcji.

• Wyróżniamy dwie klasy transpozonów:

• TRANSPOZONY- replikują się za pośrednictwem DNA, zawierają sekwencje kodujące enzym- transpozazę i tak jak wszystkie elementy ruchome sekwencje nukleotydowe na końcach transpozonów mają charakter odwróconych powtórek.

• RETROTRANSPOZONY- pozostałości infekcji wirusowych. Replikują za pośrednictwem RNA, przy pomocy enzymu- odwrotnej transkryptazy. Ruch tych elementów jest realizowany poprzez wytwarzanie kopii RNA, którą odwrotna transkryptazy przepisuje na DNA. Dopiero DNA może integrować w losowym miejscu w genomowym DNA.

Mogą być pochodzenia wirusowego (spokrewnione z retrowirusami). Wszystkie kodują własną, odwrotną transkryptazy. Mogą pochodzić z genów komórkowych RNA.

Wykład 15.03.2011r.

RESTRYKCJA I MODYFIKACJE-

reakcja bakterii na niekorzystne warunki (antybiotyki, bakteriofagi)- obrona przed obcym DNA

• Bakterie rozporządzają specjalnymi enzymami metylującymi, które przyłączają grupy metylowe do zasad w określonych miejscach na DNA.

• Oprócz nich są też enzymy hydrolizujące DNA- nukleazy, które atakują DNA niezawierający zmetylowanych zasad w odpowiedni sposób.

• Enzymy metylujące nazywamy modyfikującymi, a sam proces modyfikacją DNA.

• Nukleazy nazywają się enzymami restrykcyjnymi.

• Obcy DNA, który dostanie się do komórki bakterii jest znakowany w inny sposób i jest traktowany przez system obronny, jako obcy DNA. Własny DNA, natychmiast po replikacji jest w odpowiedni sposób metylowany, czyli modyfikowany.

• Enzymy restrykcyjne rozpoznają na nici DNA specyficzne, krótkie sekwencje nukleotydowe. Enzym restrykcyjny w E. coli z plazmidem R, nazywany EcoRI rozpoznaje sekwencję

G AAT C

C TTA G

Są to białka o specyficznych domenach. Enzym ten rozpoznają tą sekwencję na każdym DNA niezależnie od źródła jego pochodzenia.

Na długich niciach, które występują u organizmów wyższych, takie sekwencje występują wiele razy. Toteż EcoRI będzie ciął rozmaite DNA w tych miejscach na odcinki, których liczba zależy od liczby specyficznych sekwencji w danym DNA. Jeżeli w takiej sekwencji nastąpi właściwa i specyficzna metylacja to enzym restrykcyjny nie będzie mógł połączyć się w tym miejscu i nie nastąpi cięcie.

• Enzymy umożliwiają łączenie DNA z różnych organizmów, co prowadzi do powstawania nowych struktur- restryktazy i ligazy manipulacja genetyczna.

ENZYMY RESTRYKCYJNE

• Wyróżniamy 3 podstawowe klasy enzymów restrykcyjnych, które różnią się strukturą, wymaganiami kofaktorów, mechanizmami cięcia DNA. Wyodrębniono i opisano ok. 500 różnych, endonukleaz restrykcyjnych, gł. u Prokaryota.

• KLASA I i III- by przeciąć DNA enzymy restrykcyjne muszą pierw zhydrolizować ATP. Aktywność modyfikacyjna DNA jest, zatem zależna od ATP. Oba typy klas rozpoznają sekwencje niemetylowane w DNA, z tym, że typ I enzymów tnie DNA w miejscu losowym, a typ III tnie precyzyjnie w specyficznym miejscu. (Jeden enzym ma możliwość zarazem sprawdzenia i cięcia!!)

• KLASA II- obejmuje system modyfikacyjno/ restrykcyjny, w którym są oddzielnie, endonukleaz i metylazy i one są wykorzystywane głównie w inżynierii genetycznej. Enzymy te tną wewnątrz sekwencji docelowych lub blisko nich- oczywiście, niemetylowanych.

ENZYMY TNĄCE W OBU NICIACH- dają tępe końce powstałych fragmentów

INNE ENZYMY TNĄ JEDNĄ NIĆ NA PRZEMIAN- produkują zygzakowate- lepki nacięcia, powstają wówczas końce Jednoniciowe, wystające z fragmentów po obu końcach 5’ i 3’.

NIEKTÓRE RESTRYKTAZY ROZPOZNAJĄ UNIKATOWE PALINDROMY IINE WIELE PALINDROMÓW.

MODYFIKACJA GENU ≠ MODYFIKACJA GENOMU

• Enzymy restrykcyjne zostały wyizolowane z różnych gatunków bakterii, ale niektóre z nich rozpoznają te same sekwencje i są nazywane- izoschizomery!

• Niektóre restryktazy produkują lepkie końce, które mogą łączyć się z identycznymi końcami utworzonymi przez inne enzymy.

• Restryktazy mogą być używane pojedynczo lub w kombinacji do cięcia DNA.

• Restryktazy tną dany DNA na tyle fragmentów ile napotkają miejsc restrykcyjnych. Fragmenty te są różnej długości.

• Różne genomy cięte przez ten sam enzym będą miały różne wzory restrykcyjne- podst. do opracowania RFLP- markerów molekularnych. (służą do badania przynależności organizmów do danej jednostki taksonomicznej lub do miary zmienności molekularnej organizmów.

• Analiza restrykcyjna- analiza fragmentu DNA przeciętego przez odpowiednie enzymy.

• Produkty trawienia nukleazami są rozdzielane na drodze elektroforezy w żelu agarozowym. Fragmenty migrują w kierunku katody, gdyż DNA jest naładowany ujemnie, z szybkością zależną od ich kształtu i wielkości. Dodany barwnik pozwala na śledzenie przebiegu elektroforezy na żelu. Można je wyodrębnić z żeli za pomocą techniki bottingu na specjalny papier filtracyjny i katody z fragmentów można dalej identyfikować przez hybrydyzację DNA lub na drodze analizy sekwencyjnej. Analiza restrykcyjna pozwala na zbadanie struktury genomu.

Wykład 22.03.2011r.

• U eukariotów i prokariotów replikacja DNA zawsze poprzedza podział komórkowy i ma miejsce w fazie s cyklu komórkowego.

• Replikacja jest procesem enzymatycznym, który jest prowadzone przez różne białka enzymatyczne i czynniki niezbędne do działania tych enzymów i procesu replikacji zwane czynnikami replikacyjnymi.

• Proces replikacji DNA składa się z fazy: startu, elongacji i zakończenia.

CHEMIZM SYNTEZY DNA

1-dGTP, DTP, dATP, dTTP, mają one 3 grupy fosforowe połączone z 5’ OH 2’- deoksyrybozy; fosforowa grupa najbliższa deoksyrybozy nazywa się grupą alfa fosforową, środkowo- beta, zewnętrza- gamma

2- połączenie starter- wzór DNA, wzór dostarcza jednoniciowy ssDNA, kieruje dodawaniem komplementarnych deoksynukleotydów. Starterem jest RNA, krótszy niż wzorzec i musi mieć ekspozycję 3’ OH przyległego do obszaru ssDNA

Chemia syntezy DN wymaga, aby nowy łańcuch rósł od końca 3’ startera.

Wiązanie fosfodiestrowe powstaje wskutek ataku grupy PH na alfa- fosforanową grupę przechodzącego trójfosforanu- nukleozydu, uwalniane są grupy fosforanowe beta i gamma w postaci pyro fosforanu.

Pryrofosforan ulega hydrolizie i uwalniana jest energia o wysokiej wartości i jest wykorzystywana w tym procesie. , jest to proces sprzężony, a to oznacza, że reakcja syntezy DNA jest efektywnie nieodwracalna.

MODEL INICJACJI REPLIKACJI

W 1963 roku Francis Jacob, Sydney Brenner i Jacues Cuzin zaproponowali model startu replikacji dla bakterii. Określili oni, że cały DA zreplikowany od punktu startu replikacji nazywa się replikonem. U bakterii cały nukleoid jest kolistym chromosomem z jednym punktem ori to wtedy jest tez on replikonem. Natomiast, gdy jest wiele punktów startu replikacja to wtedy jest wiele repliko nów, każdy ma własny punkt ori (u Eucaryota).

Model startu replikacji proponuje istnienie dwóch składników: replika tor i inicjator, które kontrolują start replikacja. Replikatorem są sekwencje DNA wystarczające do kierowania inicjacją replikacji. Ori jest zawsze częścią replikatora, a czasami szczególnie w kom eukariotycznych, ori jest tylko frakcją sekwencji nukleotydowych koniecznych do kierowania startem replikacji. Inicjatorem jest białko, które rozpoznaje specyficzne sekwencje DNA w replika torze, czyli w punktach ori. Aktywuje replikacji. To inicjatorowe białko występuje we wszystkich organizmach.

U bakterii punkt startu replikacji nazywa się ori C. W tym punkcie są dwa motywy powtórek nukleotydowych bardzo ważnych do funkcjonowania tego miejsca ori- cztery powtórki sekwencji 9 pz, które są miejscami łączenia białka DnaA, 3 powtórki 13 pz, które inicjują powstanie ssDNA w czasie inicjacji. Punkt ten ma długość 245 pz.

U drożdży punkt nosi nazwę ARS i jest długości 100 pz. Składa się z 3 elementów A i B1, które są miejscem łączenia białek inicjatorowych, trzecie element B2 ułatwia rozwijanie się DNA i przyłączanie innych czynników replikacyjnych.

U wirusa SV40 ori jest złożony z 4 pentamerowych miejsc łączenia P dla białka inicjatorowego, który jest nazywany antygenem T, oprócz tego ma palindrom o 20 pz, w nim następuje rozwijanie Dna. Cały punkt ori u wirusa liczy tylko 65 pz.

U człowieka istnieje obszar, (jako ori), o 8 tys. par zasad, który zawsze inicjuje replikację DNA. Brak konkretnych motywów sekwencji, które można byłoby określić, jako specyficzne.

Przyłączenie białek i rozwijanie DNA, białka inicjatorowe mają 3 ważne cechy:

1- przyłączają się do specyficznych sekwencji DNA w replika torze, (ori)

2- po przyłączeniu się do DNA zakłócają jego strukturę lub rozwijają obszar DNA przyległy do miejsca przyłączenia się tych białek

3- reagują z innym białkami wymaganymi do startu replikacji i przyciągają je do replikatora

(powstaje duży kompleks białkowy, który przystosowuje DNA do replikacji DNA)

U E. coli

Do elementów o 9 pz i do jednego o 13 pz przyłącza się DnaA z ATP w liczbie ok. 30 cząsteczek. Jest ono wspomagane przez białko HU strukturalne chromatyny bakteryjnej. Białka te wpływają w sposób fizyczny na DNA, w miejscu, do którego się przyłączają. Pod wpływem napięcia powodowanego przez te białka następuje rozdzielenie DNA na obszarze 20 pz i powstaje bąbel- oczko replikacyjne.

Do tak powstałego oczka przyłączają się białka DnaB-DnaC i powstaje kompleks preinicjacyjny. DnaC jest przenośnikiem dla DnaB i po przyłączeniu DnaB jest uwalniane.

Białko DnaB jest helikazą, która otwiera dwuniciowy DNS i umożliwia przyłączenie się enzymów replikacyjnych.

DnaB- helikazą DNA i helikazowy ładowacz- DnaC są obecne w 6 kopiach. Helikaza DNA jest utrzymywana w nieaktywnym stanie w kompleksie DnaB- DnaC. Po przyłączeniu się do ssDNA helikazowy ładowacz kieruje przyłączenie helikazy DnaB wokół ssDNA, podobnie jak ślizgająca się klamra DNA wokół połączenia: starter- wzorzec.

Załadowana helikaza przyciąga primazę(polimeraza RNA) i następuje synteza RNA startowego na każdej nici ori.

Następnie jest przyciągana polimeraza III- holoenzym poprzez primer- wzorzec połączenie i przez helikazę. Kiedy jest już przyłączona PoIII razem z nią jest załadowana klamra ślizgowa na starterze RNA.

KOMPLEKS PRE- REPLIKACYJNY U EUCARYOTA

Inicjacja replikacja DNA u Eukariota wymaga dwóch etapów występujących w danym czasie cyklu komórkowego: selekcja replikatora, aktywacja ori.

Selekcja replikatora jest procesem identyfikacji sekwencji, które kierują inicjacją replikacji i która pojawia się w fazie G1. Ten proces prowadzi do zgromadzenia wielobiałkowego kompleksu w każdym repliaktorze w genomie. Natomiast aktywacja ori następuje wtedy, gdy komórka wejdzie w fazę S i zostanie wyzwolone rozwijanie DNA i rekrutacja polimerazy DNA, przez białka przyłączone do replikatora.

U Eukariontów inicjatorowym kompleksem jest 6 białek- ORC, którego funkcjonowanie najlepiej poznano u drożdży. ORC rozpoznaje element A i mniej konserwatywny element B1. Podobnie jak DnaA ORC łączy się z ATP i hydrolizuje go a jest to potrzebne do specyficznego połączenia się z sekwencjami DNA. ORC przyłącza się do replikatora i rekrutuje inne replikacyjne białka do replikatora.

Z syntezą DNA odbywa się synteza histonów!!!

Czasowe rozdzielenie tych dwóch procesów- selekcji i aktywacji w komórkach eukariotycznych zapewnia, że każdy chromosom jest replikowany tylko raz w danym cyklu komórkowym. Duża kontrola cyklu, istnieją białka blokujące niepożądane etapy replikacji.

Selekcja replikatora jest dokonywana przez kompleks pre- inicjacyjny – pre-RCs. Jest on złożony z 4 białek, które łączą się w uporządkowany sposób w każdym replikatorze. Pierwszy etap tworzenia tego kompleksu jest dokonywany przez rozpoznanie replikatora przez ORC. Po przyłączeniu preRCs do ORC przyciągane są dwa białka ładowaczy helikazy Cdc6 i Cdt1. Razem ORC i ładowacze przyciągają białko, które jest uważane za helikazę widełek replikacyjnych- Mem 2-7 kompleks.

Uformowanie pre- RC nie prowadzi bezpośrednio do rozwinięcia DNA czy też do rekrutacji polimerazy DNA. Pre- Rc formowane w G1 jest aktywowane tylko do inicjowania replikacji po tym jak komórka wyjdzie z fazy G1 do S.

Aktywacja pre- RC jest dokonywana przez dwie kinazy Cdk i Ddk, które kowalencyjnie dołączają reszty fosforowe do białek tego kompleksu i innych czynników replikacyjnych. Po tym mogą inicjować replikację DNA.

Każda z tych kinaz jest nieaktywna w G1 i aktywuje się dopiero po wejściu komórki do fazy S.

U eukariontów są 3 polimerazy DNA, głównie uczestniczą one w replikacji, a także inne białka. Są to polimerazy eta i gamma i polimeraza alfa/ primazę. Dodatkowo do tych polimeraz wymagany jest kompleks Mcm białek- helikazowych i czynników wymaganych przez polimerazy.

2 FAZA REPLIKACJI DNA- ELONGACJA- WYDŁUŻANIE

Po utworzeniu kompleksu inicjacyjnego następuje rozdzielenie nici DNA i powstają widełki replikacyjne, zostają załadowane enzymy replikacyjne razem z czynnikami replikacyjnymi i zaczyna się synteza DNA.

Pojedyncze nici DNA są zabezpieczone przez połączenie ze specjalnymi białkami zwanymi ssb.

Nić DNA 3’ jest nicią wiodącą, a nić 5’ nicią opóźnioną.

U bakterii: syntezę prowadzi dimer polimerazy III DNA na obu niciach równocześnie. Na nici opóźnionej jest syntetyzowany krótki RNA- starte przez primazę, następnie PoIII tworzy wypętlenie nici wzorcowej DNA i syntetyzuje fragmenty Okazaki. Po utworzeniu go polimeraza jest uwalniana, lecz pozostaje związana z Pol III syntetyzującą nić wiodącą i może rozpocząć nową syntezę fragmentu Okazaki w miejscu starte- wzorzec.

SCHEMATYCZNA BUDOWA POIII DNA:

-Dwa rodzaje polimeraz, każdy składa się z 3 podjednostek: alfa (aktywne miejsce polimeryzacji), eta (aktywność egzonukleazową i podjednostkę hi.

-Poza tym są dwie podjednostki „tau” łączące dwa rdzenie PoIII.

-Jedna lub więcej beta klamr, każda z identycznymi podjednostkami.

-Gamma klamra ładowacz, jako kompleks 5 różnych podjednostek.

Primaza (dna G) polimeraza RNA, która syntetyzuje odcinek od 9 do 12 nukleotydów; primazę jest połączona z helikazą i tworzy primosom.

Po tym do widełek załadowana jest PoIII i wykorzystuje, RNA jako starter do syntezy DNA. Postępuje replikacja na nici wiodącej, na nici opóźnionej tworzy się pętla ssDNA i PoIII może kontynuować syntezę fragmentów Okazaki, zgodnie kierunkiem syntezy na nici wiodącej. Po zsyntetyzowaniu DNA w pętli, pętla jest likwidowana, wykorzystywany kolejny starter.

U EUKARIOTÓW

Replikacja wymaga wiele polimeraz, najważniejsze to: alfa, sigma i eta.

1) Polimeraza alfa zaczyna syntezę nowej nici DNA, najpierw syntetyzuje starterowy, 10- nukleotydowy RNA i od niego syntetyzuje 30- nukleotydowy odcinek DNA, potem zostaje zmieniona z polimerazą sigma.

2) Polimeraza sigma współdziała z klamrą PCNA i syntetyzuje nić opóźnioną a eta też z PCNA- nić wiodącą.

Starterowy RNA jest usuwany za pomocą endonuklezay FEN1, które łączą się z kompleksem Pol sigma na końcu 3’ okazaki i usuwa starter RNA z końca 5’ sąsiedniego fragmentu Okazaki. Fragmenty Okazaki są łączone za pomocą ligazy w nić ciągłą.

Wykład 29.03.2011r.

ZAKOŃCZENIE REPLIKACJI U EUKARIOTA

U Eukariota nie ma sekwencji kończących replikację- brak sekwencji terminacyjnych. DNA jest replikowany w kompleksach replikacyjnych i każdy kompleks replikuje określony fragment DNA w uporządkowanej strukturze. U Eukariota DNA jest upakowany w chromosomach. Każdy chromosom zawiera jedną cząsteczkę DNA. Końce takiej cząsteczki i chromosomu nazywają się telomery. Replikacja DNA telomerowego prowadzona jest przez telomerazę. Enzym telomeraza zawiera cząsteczkę RNA, która służy za matrycę do syntezy DNA.

ZAKOŃCZENIE REPLIKACJI U BAKTERII

Sekwencje DNA terminatorowe u E. coli- jest ich 7. Do nich przyłącza się białko, Tus, które pozwala na przejście widełek replikacyjnych tylko w jednym kierunku, a zatrzymuje przejście widełek w kierunku przeciwnym. Zatrzymuje działanie helikazy odpowiadającej za ruch widełek.

Po replikacji kolistej cząsteczki DNA, potomna cząsteczka jest połączona ze starą- ogniwem- katenanem. Rozdzielenie tych cząsteczek odbywa się za pomocą topoizomerazy II. Aby cząsteczki mogły segregować topoizomeraza rozłącza je.

Cząsteczka liniowa kończy replikację na nici opóźnionej w ten sposób, że dla ostatniego fragmentu Okazaki używa, jako startera białko z grupą –OH przy C5’. Takie białko występuje w liniowych chromosomach niektórych wirusów i bakterii zwierzęcych.

RÓŻNICE W WIDEŁKACH REPLIKACYJNYCH MIĘDZY BAKTERIAMI A EUKARIOTAMI

• U bakterii dwie polimerazy III replikują razem, jako dimer

• U eukariontów nie ma struktury dimerowej a polimerazy sigma i eta replikują oddzielnie nić wiodącą i opóźnioną. Nad tym czuwa kompleks białkowy- czynnik replikacyjny C, który kontroluje odłączanie się i włączanie się enzymu na nici opóźnionej.

• W kom. eukariotycznych nie ma replisomu. Są natomiast liczne kompleksy białkowe replikacyjne na stałe związane z macierzą jądrową tworzące tzw. fabryki replikacyjne.

• Eukariotyczna polimeraza alfa zawiera aktywność prymazową i może budować startery na początku nici wiodącej jak i na początku fragmentów Okazaki.

• Usuwanie starterowego RNA odbywa się za pomocą endonukleaz FEM1, a u bakterii czyni to polimeraza z aktywnością egzonukleazy 5’ > 3’

• U eukariotów nie ma sekwencji DNA kończących replikację DNA.

POLIMERAZY DNA

BIAŁKA REPLIKACYJNE

• Oprócz polimeraz DNA w replikacji biorą udział inne białka

• W przygotowaniu DNA do replikacji udział biorą trzy topoizomerazy: IA, IB i II

• Topo IA nacina jeden łańcuch DNA i przeprowadza drugi łańcuch przez powstałą przerwę, zmniejszając liczbę skrętów podwójnego heliksu, a końce przerwanego łańcucha ulegają ligacji

• Topo IB działają tak jak Topo IA ale według innego mechanizmu- tworzą przed widełkami przerwę w jednej nici DNA

• Topo II przecina oba łańcuchy tworząc przejścia dla całego sąsiedniego segmentu DNA- zmniejsza się liczba skrętów DNA o dwa skręty.

• Topoizomerazy likwidują napięcia torsyjne spowodowane przejściem widełek replikacyjnych.

• Helikazy rozwijają podwójną helisę.

POLIMERAZY

• Polimeraza DNA używa pojedynczego miejsca aktywnego do katalizowania syntezy DNA.

• Większość enzymów używa jednego miejsca aktywnego do katalizowania jednej reakcji, a polimeraza DNA używa go do łączenia czterech nukleotydów: A, T, G, C.

• Polimeraza DA monitoruje czy jest zgodność łączenia A z T i C z G- homologia par azotowych. Właściwa para jest utworzona, gdy jest 3’ OH primerowy i alfa fosforan przychodzącego trójfosforanu nukleozydu pojawia się w optymalnej pozycji. Niewłaściwie zbudowana para prowadzi do dramatycznego obniżenia poziomu dodawania nukleotydów do rosnącego łańcucha DNA. Jest to przykład kinetycznej wybiorczości.

• Polimeraza DNA rozróżnia rybonukleotydy od deoksyrybonukleotydów. Ta dyskryminacja jest utrzymywana przez steryczne wykluczenie rNTP z miejsca aktywnego polimerazy. W tym miejscu kieszeń łącząca nukleotydy jest zbyt mała na pomieszczenie 3’ OH nukleotydu rNTP przechodzącego. Miejsce to zajmują dwa aminokwasy, które łączą się z pierścieniem cukrowym, za pomocą sił van der Waals’a. Zamiana tych aminokwasów na inne znacznie

obniża dyskryminację polimerazy pomiędzy dNTP i rNTP.

• Polimeraza przypomina dłoń, która obejmuje połączenie starter- wzorzec.

Miejsce substratowe DNA znajduje się w dużym zagłębieniu przypominającym częściowo zamkniętą prawą rękę. Wyróżnia się trzy domeny polimerazy: dłoń, kciuk i place.

• Domena kciuka jest zbudowana z beta arkuszy i zawiera pierwotne elementy miejsca katalitycznego. Ten obszar polimerazy DNA łączy dwa jony metali dwuwartościowych, które zmieniają środowisko chemiczne wokół prawidłowych par nukleotydów i 3’ OH startera.

Jeden jon metalu redukuje powinowactwo 3’ OH (Mg, Zn) dla jednego wodoru. Powstaje wtedy 3’ O^-, który jest starterem dla reakcji z alfa fosforanem przychodzącego nukleotydu. Jony tych metali oddziaływają na przyjście aktualnego nukleozydu w ten sposób. Drugi jon metali koordynuje negatywne ładunki beta i gamma fosforanów DTP i stabilizuje pirofosforan powstały na skutek połączenia startera i przychodzącego nukleotydu.

• Domena dłoni monitoruje dokładność tworzenia par nukleotydowych. Ten obszar polimerazy tworzy rozległe połączenia wodorowe łączące pary zasad w mniejszym rowku nowozsyntetyzowanego DNA. Błędne połączenia w tym obszarze bardzo obniżają częstość reakcji syntezy i obniżają powinowactwo do substratu, a to z kolei powoduje uwolnienie startera: wzorzec połączonego z polimerazą i przyłączenie do innego miejsca w polimerazie sprawdzającego czy połączenie jest dobre.

• Domena palców przybliża do dłoni przychodzącego nukleotydy i stymuluje katalizę przesuwając przychodzącego nukleotydy do kontaktu z jonami metali. Powoduje zwrot o 90 stopni szkielet fosforo- cukrowy wzorcowej nici bezpośrednio za miejscem aktywnym. To zakrzywienie eksponuje tylko pierwszą zasadę wzorca za starterem w miejscu katalitycznym. Taka konformacja wzorca pozwala na uniknięcie błędu w związku z czytaniem wzorca i dołączaniem właściwych zasad.

• Domena kciuka nie jest bezpośrednio zaangażowana w katalizę. Natomiast współdziała z nowozsyntetyzowanym DNA w dwóch celach: utrzymuje właściwą pozycje startera i miejsca aktywnego i pomaga w utrzymaniu silnego połączenia polimerazy DNA i jej substratu.

• Polimerazy DNA są enzymami procesywnymi. Procesywność jest cechą enzymów, które działają na substratach polimerycznych. W przypadku polimeraz DNA stopień procesywności jest definiowany, jako średnia liczba nukleotydów dodanych w każdym czasie, kiedy enzym jest przyłączony do starter- wzorzec. Polimerazy DNA zawierają również miejsce korekcyjne, którego zadaniem jest usuwanie błędnie włączonego nukleotydu i jest to ułatwione przez obniżenie zdolności polimerazy DNA do dodania sąsiedniego nukleotydu. Dzieje się tak, dlatego, że błędnie włączony nukleotyd zmienia geometrię 3’ OH przychodzącego nukleotydu w obszarze dłoni polimerazy. Procesywność nadają polimerazie DNA specjalne białka, tzw. klamry ślizgowej, a u Eukariotów jest to PCNA (kompleks białkowy nadający procesywność polimerazie DNA).

• U eukariotów występuje też wiele polimeraz: sigma, alfa i eta. Alfa ma cztery podjednostki, zaangażowana jest w starcie syntezy nowej nici, nie jest procesywna, zmieniana jest z polimerazą sigma lub eta, które są połączone z klamrą ślizgową- proces przełączania polimeraz.

• Kluczem wysokiej procesywności polimeraz sigma i eta jest obecność białek towarzyszących zwanych klamrą ślizgową. Ta klamra ślizga się po DNA bez uwalniania się od niego oraz ciasno przyłączą się do polimerazy DNA.

POLIMERAZA U E. COLI

• Główną polimerazą jest polimeraza III, jest ona częścią większego kompleksu- holoenzym. Holoenzym składa się z 10 różnych podjednostek, z których podjednostka alfa ma aktywność replik azową a eta ma zdolność sprawdzania- egzonukleazową 3’- 5’.

• Oba enzymy Pol. III i I DNA mają miejsce sprawdzania dokładności włączania nukleotydów. Pozostałe trzy polimerazy są zaangażowane w naprawianie DNA i nie mają właściwości korekcyjnych.

• Pol I DNA u bakterii ma za zadanie usuwanie starterowego RNA, ma aktywność nukleazową. Nie jest wysoce procesywna, ale usuwa połączenie RNA- DNA, które jest oporne na działanie RNAzyH. Syntetyzuje krótkie odcinki DNA wypełniające miejsca wycięcia RNA- DNA. Ma dwie podjednostki: fragment Klenowa z aktywnością 5’ > 3’ i druga podjednostka ma aktywność 5’ >3’ i 3’ > 5’.

• Pol II zaangażowana głównie w mechanizmy naprawy DNA. Polimerazy IV i V pośredniczą w syntezie DNA wypełniające miejsca uszkodzone w DNA. Obie polimerazy tworzą bypass uszkodzonego miejsca DNA, które blokuje replikacje DNA przez polimerazę II. Obie polimerazy odgrywają rolę w adaptacyjnej mutagenezie i są skłonne do błędnego włączania nukleotydów w czasie naprawy.

Wykład 5.04.2011r.

ORGANIZACJA SEKWENCJI KODUJĄCYCH W GENOMIE EUKARIOTYCZNYM- GENY KODUJĄCE mRNA

W większości organizmów eukariotycznych ponad 80 % sekwencji koduje różnego rodzaju białka. Pierwszym produktem tych genów jest mRNA. Geny mRNA w formie pojedynczych kopii, występują jeden po drugim w tysiącach w genomie. Pomiędzy nimi są tak zwane sekwencje rozgraniczające- niefunkcjonalne- w których znajdują się umiarkowanie powtórzone motywy sekwencji nukleotydów.

Obszar genu mRNA ma ograniczenie od 5’ do 3’- ramka odczytu. 5’- niereaktywna grupa fosforanowa, 3’- niereaktywna grupa karboksylowa OH. W obszarze od końca 5’ znajdują się sekwencje regulatorowe, które nie są przepisywane na język aminokwasów- nie podlegają translacji- wśród nich jest promotor i czasami aktywator lub represor. Za obszarem regulatorowym występuje obszar kodujący, który podlega translacji. Od końca 3’ też jest obszar kontrolny, który nie podlega translacji. Obszar kodujący zawiera sekwencje kodujące- egzony, i nie kodujące- introny.

W niektórych gatunkach kompletny gen z sekwencjami flankującymi 5’ i 3’ jest całkowicie ulokowany wewnątrz intronu innego genu. Zdarza się też bardzo rzadko, że dwa geny zachodzą na siebie w ten sposób, że ich łańcuchy sensowne zajmują przeciwne nici podwójnego heliksu w tym samym fragmencie DNA.

Prawie wszystkie geny mRNA zawierają informacje dla jednego białka lub polipeptydu. Ale ponieważ introny mogą być wycinane w różny sposób, a egzony składane w rozmaitych kombinacjach, to niektóre geny mogą kodować wiele odmiennych mRNA.

Sekwencje w genie są zawsze zapisane w kierunku od 5’ do 3’ zarówno w odpowiednim RNA jak i w nonsensownym łańcuchu DNA.

Nonsensowy łańcuch DNA jest tak nazywany, dlatego, że jego sekwencja nukleotydów jest identyczna do sekwencji mRNA kopiowanego z genu za wyjątkiem substytucji T na U. Kodon jest czytany w tym samym kierunku z łańcucha nonsensowego. Łańcuch sensowy jest antyrównoległy do nonsensowego- to kierunek 5’ >3’ w sensowym jest przeciwny kierunkowi transkrypcji.

PROMOTOR- zawiera kilka ważnych elementów sekwencyjnych, występujących w większości eukariotycznych kodujących białka. Są to następujące sekwencje:

• TATA box- 20 do 30 pz od miejsca startu transkrypcji. Takie sekwencje mają promotory genów szybko transkrybowanych i specyficznie tkankowo lub dla cyklu komórkowego.

• INICJATOR- PyCAN T/A PyPy…CA: -1 do +1- Takie sekwencje znajdują się w różnych genach, często w promotorach wiralnych.

• Wyspy CpG- występują w promotorach genów wolno transkrybowanych

• Nie tak powszechne jak TATA box są inne sekwencje krótkie, które łączą się z białkami regulatorowymi i wpływają na stopień transkrypcji. Dla niektórych genów są one częste, a dla innych nie i czasami pojawiają się tylko w pojedynczych genach. Np. CAAT box, u zwierząt i niższych eukariontów, znajdujący się w ok. -80 nukleotydzie promotora.

AKTYWATORY- są to sekwencje nukleotydowe liczące ok. kilkuset par zasad.

Wszystkie poznane aktywatory są miejscami łączenia się białek regulatorowych, które aktywują promotor. Występują u wszystkich eukariontów i bakterii.

3 HIPOTEZY DZIAŁANIA AKTYWATORÓW

1. Do sekwencji przyłącza się białko regulatorowe, które ma odpowiednią domenę bezbłędnie rozpoznającą aktywatora. Przyłącza się, ślizga po sekwencjach, aż napotka promotor. Tam oddziałuje na niego w ten sposób, że zwiększa powinowactwo łączenia się z polimerazą II. (model skaningowy)

2. Połączenia aktywatora z białkiem powoduje zmianę konformacji podwójnej nici DNA, ta zmiana jest przenoszona do promotora. Zmiana ta polega na tym, że w promotorze DNA jest częściowo rozwinięty, co pozwala na udostępnienie polimerazie II miejsca na podłączenie się do promotora. (model konformacyjnej transmisji)

3. Model pętli, bardzo powszechny. Mówi o tym, że aktywator położony w pewnym oddaleniu od genu- promotora, przyjmuje białko regulatorowe i między aktywatorem, a promotorem przyłączają się tam inne białka, które zaginają DNA, efektem jest utworzenie pętli. Taki kompleks białek regulatorowych przyjmuje konformację, która łączy sprawniej polimerazę II z promotorem, niż same sekwencje promotorowe.

SEKWENCJE NA 3’ KOŃCU GENÓW mRNA

Występują tam sekwencje sygnalizujące koniec transkryptu i koniec transkrypcji. Sekwencja niepodlegająca translacji zawiera AATAAA (transkrybowaną w mRNA- AAUAAA) i zaznacza miejsce, w którym koniec 3’ pre-mRNA będzie odcięty.

GENOMY PROKARIOTYCZNE

Organizacja genomów protokariotycznych jest zasadniczo różna od organizacji genów eukariotycznych. Występuje tu nukleoid, w którym jest upakowana cząsteczka kolista DNA. U E. coli jest on długości ok. 15000 um DNA.

Konsekwencją kulistej natury genomu bakterii jest to, że wszystkie geny są genetycznie sprzężone. U eukariontów genom podzielony jest na chromosomy, a geny w jednym chromosomie są sprzężone, a więc jest tyle grup genów sprzężonych ile jest chromosomów.

Prawie cały DNA bakteryjny ma charakter kodujący. Elementy 3’ lub 5’ kontrolują transkrypcję.

• Większość genów jest zgrupowana i tworzy jednostki transkrypcyjne zwane operonami, kontrolowane wspólnie przez 5’ flankujące elementy kontrolne.

• Bardzo rzadko występują sekwencje powtarzalne i introny. Ma to związek z małymi wymiarami komórek bakteryjnych, które nie mają miejsca na lokalizację większej ilości sekwencji nukleotydowych DNA. Czas replikacji jest także ograniczony przez bardzo szybkie cykle komórkowe.

• Obecność plazmidów

• Geny pochodzące z tej samej bakterii lub z innego gatunku, czy z wirusa infekującego bakterię mogą zostawać wstawiane w plazmid.

• Bakteryjne plazmidy często zawierają transpozony, genetyczne elementy ruchome

• Protokariota mają prostą budowę genów, bez intronów. Nie oznacza to jednak, że ich mechanizm działania i regulacja ich funkcji są proste i uniwersalne.

ORGANIZACJA SEKWENCJI KODUJĄCYCH- OPERONY

• Geny kodujące mRNA są rozmieszczone wokół cząsteczki DNA i są zorganizowane w operony. W operonie może znajdować się kilka genów kodujących jeden do kilku polipeptydów. Maja one wspólny promotor i są transkrybowane, jako całość.

• W 1961 r. Jacob i Monod zaobserwowali dwie klasy enzymów u E. coli: enzymy konstytutywne i enzymy indukowane, które powstawały tylko w obecności substratu- induktora. Zasugerowało to istnienie mechanizmu regulacyjnego, który później nazwany został operonem.

• W operonie geny nie są rozdzielone od siebie. Nawet niektóre sekwencje kodujące w operonie zachodzą na siebie.

• Operony rRNA występują w wielokrotnych kopiach u bakterii w liczbie od 2 do 15 kopii. Geny rRNA mogą występować pojedynczo albo w zbiorach. Każdy operon obejmuje kodowanie 55SrRNA, 16srRNA i 23SrRNA. Operony rRNA zawierają też 1-3 sekwencje tRNA pomiędzy jednostkami kodującymi 16S i 23S, i w niektórych rRNA operonach w obszarze 3’.

• Inne geny tRNA są rozrzucone wokół genomu. U E. coli 46 różnych typów tRNA jest kodowanych przez 77 sekwencji kodujących ulokowanych albo pojedynczo albo w zbiorach i w mieszanych operonach razem z mRNA. Ponadto jest 7 operonów kodujących białka rybosomalne.

SEKWENCJE POWTARZALNE

• Występują bardzo rzadko i nie u wszystkich bakterii. U Salmonella i Escherichia występują umiarkowanie powtarzalne sekwencje nukleotydowe DNA, rozproszone wokół genomu o jednostce powtarzalnej liczącej od 4 do 40 pz. Niektóre z tych sekwencji służą, jako sygnały genetyczne rekombinacji i integracji lub wycinania segmentów DNA. Inne mogą być miejscami przyłączania się białek wpływających na strukturę chromosomu bakteryjnego.

• U Archeobakterii też występują 1-sekwencje umiarkowanie powtarzalne 2- introny 3-eukariotyczny wzór sekwencji genów rRNA, a także częściowo 4-mechanizm syntezy białek na rybosomach.

OPERON LAC- przykład budowy genów kodujących mRNA u bakterii

3 geny strukturalne lacZ, lacY, LacA. LacZ koduje B-galaktozydazę, enzym, który tnie laktozę na galaktozę i glukozę, które są źródłem energii dla bakterii.

• LacY koduje permeazę laktozową, białko błonowe systemu transportu laktozy i B- galaktozydazy do komórki.

• LacA koduje transacetylazę, która oczyszcza komórkę z toksycznych tiogalaktozydów pobranych przez permeazę.

• W górę od tych genów jest gen regulatorowy, kodujący rep resor Lac. Jest on stale aktywny pod kontrolą własnego promotora.

W braku laktozy represor Lac w formie tetrameru łączy się z sekwencjami operatora które zachodzą na obszar promotora. Z tego względu represjo Lac blokuje przyłączanie się polimerazy RNA do promotora i transkrypcja operonu lac jest represjonowana. W obecności laktozy operon lac jest indukowany. Prawdziwym indykatorem jest alternatywna forma laktozy zwana allolaktozą.

Kiedy bet- galaktozydaza tnie laktozę do glukozy i galaktozy, mała frakcja laktozy przemienia się w allolaktozą. W czasie przyłączenia allolaktozą, represor lac podlega zmianie allosterycznej w domenie łączenia się z operatorem, obniża jej powinowactwo łączenia się z DNA do poziomu niespecyficznego, uwalniając od represji lac. Oprócz tego jest także aktywacja transkrypcji. W miejscu odległym od operonu lac jest gen kodujący kataboliczny aktywator białkowy Cap. Jest on receptorem cAMP stąd też często nazywa się go białkiem CRP. CAP łączy się do DNA wewnątrz operonu w miejscu zwanym CAP. To białko tworzy kompleks Cap- polimeraz RNA- DNA i jest przykładem kooperacyjnego łączenia się białek z DNA.

Transkrypcja zaczyna się wtedy, gdy jest wyczerpana glukoza w podłożu, gdyż ona obniża syntezę cAMP, które jest potrzebne do aktywacji CAP, aby mogło połączyć się z DNA.

Bez wspólnego połączenia CAP z polimerazą RNA transkrybuje geny operonu lac na bardzo niskim poziomie zwanym poziomem podstawowym, który jest ok. 40 razy niższy od aktywowanej transkrypcji.

Operon lac E. coli zawiera wewnętrzne terminatory transkrypcji zależne od Rho i białko to kończy transkrypcję w przypadku niedoboru aminokwasów w komórce. Wewnątrzgenowe terminatory nie funkcjonują w warunkach normalnej ekspresji, dlatego, że przeszkadza im obecność rybosomów, które prowadzą translację równocześnie niemal z transkrypcją. Jednak, kiedy jest brak aminokwasów biosynteza białek zostaje zahamowana, a wtedy zostaje eksponowana sekwencja rut na transkrypcie i przyłącza się tam białko Rho i kończy transkrypcję. Dla komórki jest to energetycznie korzystne gdyż zapobiega wydatkowi energii na transkrypt, który nie będzie ulegał translacji.

Wykład 12.04.2011r.

MECHANIZM TRANSKRYPCJI

Centralnym zdarzeniem w ekspresji genu jest kopiowanie sekwencji z wzorcowej nici DNA genu na komplementarny transkrypt RNA- transkrypcja.

U bakterii transkrypcja i translacja występują w jednym wspólnym kompartymencie komórki. Wkrótce po rozpoczęciu transkrypcji i powstaniu mRNA przyłącza się do niego rybosom, zostaje zainicjowana synteza białek. U Pro transkrypcję prowadzi jedna polimeraza, u Eu, trzy.

Syntezę RNA prowadzi polimeraz RNA-RNAP. Używa wzorcowej nici DNA i polimeryzuje tri fosforany nukleotydów. U e. coli jest jedna polimeraza, którą przyłącza się do obszaru Dna genu zwanego promotorem. Promotor jest zwykle ulokowany tuż przed startem transkrypcji genu. Fizycznie łączy się z tym samym ciągiem sekwencji Dna.

Z tego względu promotor jest klasyfikowany, jako sekwencja cis- działająca lub element cis- działający. Promotor różni się od sekwencji kodujących- transkrybowanych i podlegających. Translacji, z tym, że jego sekwencja służy wyłącznie do celów regulatorowych. Do tego celu w promotorze występują specjalne motywy sekwencyjne DNA rozpoznawane przez białka regulatorowe. Białka łączące się do tych cis- elementów noszą nazwę trans- elementów.

Gen kodujący dane białko reagujące z promotorem- element trans- jest transkrybowany, odbywa się translacja. Powstały produkt dyfunduje do elementu cis DNA i wpływa na jego transkrypcję.

Bakteryjne promotory genów mają motywy konsensusowe- rozpoznawane przez podjednostki polimerazy RNA i czynniki regulatorowe. Im bardziej zgodne te sekwencje tym silniejszy promotor. Siła promotora odnosi się do stosunkowej frekwencji inicjacji transkrypcji i do powinowactwa polimerazy do obszaru promotora.

Niektóre bardzo silne promotory mają element UP- odpowiednik eukariotycznego aktywatora, które towarzysza wszystkim genom. UP podnosi powinowactwo promotora do polimerazy. W większości genów u E. coli w promotorze występują dwie sekwencje heksamerowe, rozdzielone obszarem liczącym 17 pz. Jeden motyw położony jest w -10pz TATA-TATA BOX, a drugi położony w miejscu -35 pz TTGACA- PRIBONOW BOX. Przestrzeń ta jest istotna dla transkrypcji, mutacje w tym obszarze są bardzo niebezpieczne.

STRUKTURA BAKTERYJNEJ POLIMERAZY RNA

• Zbudowana z rdzenia i czynnika transkrypcyjnego sigma > holoenzym.

• Rdzeń enzymu katalizuje polimeryzację RNA z każdego Dna i jest to kompleks podjednostek białkowych alfa 1 i alfa 2, beta, beta’ i omega. Te podjednostki i ich struktura i funkcja są ewolucyjnie zakonserwowane. Występują i u bakterii i człowieka. Mają powinowactwo do większości DNA, bez względu na źródło DNA.

• Czynnik sigma wyznacza specyficzność łączenia się polimerazy z promotorem danego genu. Bez sigma rdzeń enzymu może inicjować transkrypcję z każdego DNA promotora, natomiast jego obecność redukuje niespecyficzność łączenia się polimerazy RNA.

• Polimeraz RNA została wyizolowana z Thermus aquaticus. Kształtem przypomina kraba. Zamknięcie szczypiec przyczynia się do zwiększenia intensywności polimerazy RNA. Miejsce aktywne znajduje się w tyle tunelu. UZUPEŁNIĆ!

• Czynnik sigma zaangażowany jest w rozpoznawanie promotorów, a w nich sekwencji -35 i -10. Sekwencja -10 odpowiedzialna za rozdział nici DNA- topnienie nici i ekspozycja promotora, czyli nici wzorcowej. Czynnik sigma ma 4 domeny, której dalej się dzielą na subdomeny odgrywając rolę w rozpoznaniu promotora.

• Najbardziej powszechny jest czynnik sigma 70, który przyłącza Pol RNA do większości genów u E. coli. U E. coli występują także inne czynniki sigma, ta różnorodność może wpływać na zdolności adaptacyjne bakterii.

ETAPY TRANSKRYPCJI

1. INICJACJA- strat transkrypcji.

1. Utworzenie zamkniętego kompleksu promotorowego.

2. Kompleks otwarty, w którym ok. 18 pz wokół miejsca startu transkrypcji ulega rozdzieleniu odsłaniając nić wzorcową DNA.

3. Etap oczyszczenia promotora- przemieszczanie czynnika sigma do innych domen polimerazy RNA, co powoduje przejście do kolejnego etapu transkrypcji

1. B- ELONGACJA- Pol RNA przesuwa się po sekwencjach kodujących, po rozdzieleniu nici, tworzony jest przed polimerazą bąbel, który od razu zostaje zamykany za polimerazą. Obszar przesuwania się polimerazy o długości ok. 30 pz jest zabezpieczony przed trawieniem nukleazy. Wewnątrz tego bąbla jedna nić Dna służy, jako wzorzec do syntezy RNA. Przyłączenie magnezu w miejscu aktywnym enzymu stabilizuje ujemny ładunek opuszczającej grupy pyrofosforanowej, polimeraz RNA przesuwa się wzdłuż wzorca DNA Az napotka kodon STOP.

2. ZAKOŃCZENIE TRANSKRYPCJI- wyróżnia się dwa typy zakończenie transkrypcji:

a) zależna od Rho- wymaga obecności białka Rho, które przyłącza się do mRNA, wtedy, gdy jest koniec genu lub operonu, ponieważ są obecne na nim rybosomy, które równocześnie z transkrypcją syntetyzując białko. W momencie końca genu lub operonu rybosomy już nie przesuwają się wzdłuż mRNA tak, ze fragment nowo powstałego mRNA jest dostępny dla białka Rho. Rho w zależności od ATP przesuwa się wzdłuż RNA i goni polimerazę RNA. Gdy ona zatrzyma się na strukturze pień- pętla stop łapie ją i rozrywa słabe połączenie pomiędzy RNA- DNA- koniec transkrypcji.

b) niezależne od Rho- nie uczestniczy białko Rho, tylko wewnątrz RNA, tuż przed ostatnią transkrybowaną zasadą tworzy się struktura pętli. Ta struktura pień- pętla destabilizuje bąbel transkrypcyjny. Za strukturą pień pętla występuje 7-8 nukleotydów zbudowanych z uracylu, i on paruje z ciągiem A w DNA- słabe połączenie wystarczające by destabilizować kompleks transkrypcyjny.

SPRAWDZANIE PRAWIDŁOWOŚCI POLIMERYZACJI RNA

• Polimeraz RNA posiada zdolność sprawdzania dokładności włączania nukleotydów w rosnący łańcuch RNA.

• Polimeraza cofa się o ok. 5 nukleotydów do 5’ i to powoduje odsunięcie końca 3’ od miejsca aktywnego enzymu.

• Cięcie nukleolityczne, które występują po zatrzymaniu się polimerazy. Polimeraza ma zdolność to wycięcia błędnego nukleotydu i w jego miejsce wstawiania nukleotydów prawidłowych.

Wykład 19.04.2011r.

TRANSLACJA-

tłumaczenie języka nukleotydowego na aminokwasy, mRNA czytany od 5’ do 3’, peptyd syntetyzowany od N końca do C.

CECHY KODU GENETYCZNEGO:

• Trójkowy- aminokwas zdefiniowany przez trzy nukleotydy

• Bezprzecinkowy

• Zdegenerowany- niektóre aminokwasy są kodowane przez więcej niż jeden kodon

• Trzy kodony nie definiują aminokwasu lecz sygnał zakończenia syntezy łańcucha, tzw. kodony STOP

Aby mogła zajść translacja konieczne są rybosomy (mRNA, tRNA- pętla antykodonowa)

Chwiejna para zasad występująca podczas parowania kodonu mRNA z antykodonem na tRNA. Trzecie pozycja w kodonie zwana jest chwiejną.

Łączenie aminokwasu z tRNA wymaga zużycia cząsteczki ATP- energia., dzięki aktywności syntazy aminoacylo tRNA przy udziale energii z ATP. Ta reakcja ma kluczowe znaczenie w dokładności odczytu kodu- aminokwas musi być połączony z tRNA zawierającym odpowiedni antykodon.

Podczas translacji wytwarzane jest wiązanie peptydowe.

Translacja odbywa się w cytoplazmie, mRNA, który zostanie wytworzony jest przenoszony do cytoplazmy gdzie znajdują się rybosomy wolne lub związane z siateczką śródplazmatyczną (zależnie od tego jaki typ białka ma zostać wytworzony, np. transportowe- złożone)

RYBOSOM BAKTERYJNY 70S

-mała podjednostka 30 S - 16S rRNA + 21 białek

-duża podjednostka 50 S- 5S rRNA, 23S rRNA +34 białka

ROBOSOM EUKARIOTYCZNY 80S

-mała podjednostka 40S- 18S rRNA

-duża podjednostka 60S- 5SrRNA, 5,8 S rRNA, 28S rRNA + ok. 50 białek

W rybosomie można wyróżnić miejsca funkcjonalne, w których odbywa się translacja:

• E- miejsce wyjścia

• P- miejsce peptydylowe

• A- miejsca aminoacylowe

W translacji wyróżniamy 3 etapy:

• Inicjacja-mała podjednostka rybosomu łączy się z inicjatorowym tRNA, inicjatorowy oznacza to, że znajduje się tam metionina. Dołączone są także czynniki inicjatorowe i GTP. Do tego kompleksu dołącza się mRNA. Wiązanie to następuje dzięki obecności czapeczki guanylowej u Eukariota lub sekwencji Shine- Dalgarno u prokariota (brak czapeczki). Poprzez przeszukiwanie mRNA zostaje odnaleziony kodon AUG właściwy dla metioniny. Po rozpoznaniu kodonu AUG przyłącza się duża podjednostka rybosomu, a czynniki inicjatorowe oddysocjowują. Hydrolizie ulega także GTP i inicjatorowy tRNA znajduje się w miejscu P. Do miejsca A może przyłączyć się aminoacylo- tRNA.

• Elongacja- w dużej podjednostce znajduje się białko katalityczne, umożliwiające stworzenie wiązania peptydowego między metioniną, a aminoacylo- tRNA znajdującym się w miejscu A. (peptydylo- tRNA jest związany w miejscu A). Następnie dochodzi do przesunięcia małej podjednostki rybosomu względem dużej, przez co puste tRNA ( to po metioninie) przechodzi do miejsca E, natomiast peptydylo- tRNA do miejsca P, zwalniając miejsce A dla kolejnego aminoacylo- tRNA. W elongacji biorą udział czynniki elongacyjne.

• Terminacja – kiedy przy miejscu A znajdzie się kodon STOP nie łączy się już żadne aminoacylo- tRNA. Natomiast łączy się czynnik terminacyjny, który powoduje, że enzym (transferaza peptydylowa) katalizujący powstanie wiązań peptydowych hydrolizuje wiązanie pomiędzy peptydem, a tRNA w miejscu P. Dochodzi do uwolnienia peptydu od rybosomu.

Jedno mRNA jest czytane na raz na wielu rybosomach, czyli z jedną cząsteczką mRNA najczęściej łączy się wiele rybosomów produkujących ten sam polipeptyd. Po translacji dochodzi do zmian w białkach- fałdowanie, cięcie proteolityczne, modyfikacje potranslacyjne, glikozylacja. W poprawnym fałdowaniu białek biorą udział tzw. białka opiekuńcze z rodziny HSP70 - chaperony. Łącza się one z powstającym łańcuchem polipeptydowym i pomagają przybrać mu właściwy kształt. Jeżeli białko jest nieprawidłowe może zostać oznaczone ubikwityną i przeznaczone do degradacji, co odbywa się w proteosomie. (ubikwitynylacja- także oznaczanie białek pełniących zróżnicowane role w komórce).

U eukariota: dodanie czapeczki, wycięcie intronów, ogon poliA- obróbka potranslacyjna.

U prokariota: brak czapeczki, brak ogona, obecność intronów. Geny organizowane są w systemie operonowym.

Rybosomy są celem działania wielu antybiotyków, które hamują syntezę protein. Antybiotyki mogą wpływać na funkcje zarówno małej jak i dużej podjednostki rybosomu. Aminoglikozydy- streptomycyna, kanamycyna, neomycyna działają na małą podjednostką i współdziałają na wiązanie kodon- antykodon. Makrolidy- erytromycyna, streptograminy działają na dużą podjednostkę i wpływają na tworzenie wiązania peptydowego lub wzrost łańcucha peptydowego. Antybiotyki raczej działają na rRNA.

SEKWENCJA SHINE DALGARNO- AGGGAGGU- rozpoznaje rybosom i poprzedza sekwencję start AUG- start translacji u prokariota.

Wykład 10.05.2011- obróbka potranslacyjna- uzupełnić!

Wykład 17.05.2011

Regulacja aktywności genetycznej u bakterii- transkrypcyjna i translacyjna regulacja

• Bakterie żyjąc w ciągle zmieniającym się środowisku, stad tez ich procesy regulacyjne muszą dostosowywać organizm do tych warunków. Większość systemów jest łatwo odwracalna, pozwalająca na szybkie przełączenie jednego szlaku biochemicznego na inny. Tylko nieliczne szlaki regulatorowe bakterii prowadzą do stałej komórkowej zmiany przypominającej rozwój i różnicowanie w komórkach. Zwykle szlaki regulatorowe u bakterii są wysoce automatyczne, kieruja ekspresję genów w mechaniczny sposób zależny od zmian środowiska.

• Bakterie nie zawsze wytwarzają wszystkie enzymy na raz, regulacja zależy od warunków środowiska. Enzymy dzielimy na:

1. Konstytutywne- zawsze tworzone niezależnie od obecności swoistego substratu.

2. Adaptacyjne- powstają w Komorkach dopiero po zetknięciu się jej z odpowiednim substratem lub przy braku produktu końcowego. Tego rodzaju mechanizm ma olbrzymie znaczenie biologiczne dla komórki, która rozporządza ograniczona liczba cząsteczek białka. Zwalnia to komórkę od konieczności syntezy enzymów w danej chwili bezużytecznych. Podejmuje syntezę wtedy, kiedy enzym jest potrzebny. U podłoży tego zjawiska leży aktywność genów kodujących odpowiednie enzymy, a szczególne znaczenie ma ich odpowiednia regulacja.

• Geny bakteryjne zgromadzone są w operony, w taki sam sposób zorganizowane geny u bakteriofagów. W obszarach flankujących gen 5’ znajduje się element sekwencyjny cis( leży po tej samej stronie co gen) do którego przyłączają się represory i aktywatory. Przyłączenie represor do promotora powoduje obniżenie częstotliwości transkrypcji od poziomu podstawowego . Przyłączenie aktywatora do promotora- sekwencje cis- zwiększa transkrypcję. Niektóre operony są regulowane przez oba regulatory. W nielicznych bakteriach operony są pod wpływem czynników podobnych do enhancerów- wzmacniaczy- do których przyłączają się białka regulatorowe i oddziałują na promotor tak jak u eukariotów. Operony są także regulowane obecnością lub brakiem czynnika sigma, jego obecność pozwala na inicjację transkrypcji, a jego brak ma skutek odwrotny.

• Regulacja lac operonu przez białko Rho: operon lac zawiera uśpione sekwencje terminatorowe zależne od Rho. Te sekwencje nie są czynne w optymalnych warunkach transkrypcji. Natomiast kiedy przyłączanie rybosomów do transkryptu bardzo się zwalnia lub blokuje, z powodu braku aminokwasów, wtedy eksponowane są sekwencje rut i przyłącza się białko Rho.

• Wspomniany wcześnie aktywator transkrypcji- białko CAP- ma dwie domeny: domenę łączenia się z DNA i domenę aktywacyjną, za pomocą której białko kontaktuje się z polimerazą RNA- z jej domeną C- w jednej z podjednostek alfa tej polimerazy. W ten sposób CAP rekrutuje polimerazę do sekwencji promotorowych. Zarówno białko CAP jak i represor lac przyłączają się do DNA za pomocą specjalnego motywu sekwencyjnego aminokwasów zwanego heliks- skręt- heliks, czyli HTH.

• Każdy HTH ma jeden alfa- heliks zwany heliksem rozpoznawczym, który wchodzi do głównego rowka DNA. Boczne łańcuchy aminokwasów łączą się specyficznie z DNA- z nukleotydami. Drugi alfa- heliks leży w poprzek DNA i wzmacnia połączenie pierwszego heliksu z DNA. W czasie połączenia CAP z cAMP zachodzi zmiana allosteryczna. Białko to ma wtedy większe powinowactwo do łączenia się z DNA. Jeżeli jakiś czynnik łączy się z rep resorem to ta laktoza nie występuje w formie funkcjonalnej ale jako allolaktoza, która łączą się z rep resorem obniża jego zdolność do łączenia się z DNA. W rep resorze lac istniej obszar zawiasowy pomiędzy dwoma łańcuchami alfa, który działa jak strukturalny przełącznik pomiędzy specyficznym i niespecyficznym sposobem działania. Zwykle działanie białek regulatorowych zaczyna od niespecyficznego łączenie się z DNA.

• Jeżeli białka regulatorowe przyłączą się do DNA to białka te przesuwają się do swoich specyficznych miejsc w DNA w sposób „random walk”. Po przyłączeniu niespecyficznym, obszar zawiasowy represora jest nieczynny, nie może przyłączać się do głównego rowka DNA bo nie jest odpowiednio zwinięty. Kiedy jednak przyłącza się do specyficznej sekwencji w operatorze wtedy obszar zawiasowy tworzy formę alfa- heliksu, a DNA zagina się o 36 stopni tworząc centralny skręt w operatorze a białko łączy się z motywem HTH z głównym i mniejszym rowkiem. Połączenie jest stabilizowane elektrostatycznymi interakcjami pomiędzy ujemnie naładowanymi fosforanami z DNA o zasadowymi aminokwasami otaczającymi miejsce łączenia represora lac.

• Tworzenie pętli Dna jest mechanizmem powszechnym w regulacji aktywności genów. Pozwala ona na interakcję wielu białek z polimerazą RNA z miejscem przyległym do operonu lub z bardziej odległego. Przyłączanie się wielu białek do miejsc w DNA stabilizuje te połączenia i pozwala na funkcjonowanie regulatorowych w bardzo małych koncentracjach. Przykład to operon arabinozy- białko AraC działa jako aktywator i represor transkrypcji. Arabinoza łączy się z białkiem AraC zmieniając kształt aktywatora tak, że łączy się jako dimer do dwóch regulatorowych sekwencji miejsc połówek. Umieszcza to jeden monomer AraC blisko do promotora z którego aktywuje transkrypcję. Dalej promotor jest aktywowany przez przyłączenie białka CAP i polimerazy RNA. Przy braku arabinozy dimer AraC zwija się w inna konformację i jeden monomer przyłącza się do połowy 194 pz w górę. Wtedy DNA pomiędzy dwoma miejscami tworzy pętlę, która sterycznie blokuje dojście polimerazy RNA do promotora.

• Osłabienie transkrypcji- attenuacja- OPERON TRYPTOFANOWY

W czasie transkrypcji tego operonu powstaje RNa, które może stworzyć dwie różne struktury zapinkowe (antyterminatorwą i terminatorową), które będą między sobą współzawodniczyły. Wiodący RNA poprzedzający antyterminator zawiera 14 nukleotydowy obszar kodujący trpL, który zawiera dwa kodony tryptofanowe. Kiedy bakteria ma wystarczającą ilość tRNA- TRP dla syntezy białka, wtedy syntetyzowany jest liderowy peptyd. Tworzy się terminatorowa forma w transkrypcie liderowym i kończy transkrypcję. Kiedy brak tRNA-TRP rybosomy translujące trpL zatrzymują się na jednym z kodonów tryptofanowych, to umożliwia sekwencjom leżącym w dół na zwinięcie i utworzenie struktury zapobiegającej utworzenie terminatora- zakończenie jest blokowane i uwolniona zostaje transkrypcja biosyntezy tryptofanu.

Attenuacja jest przykładem potranskrypcyjnej kontroli różnorodnego zwijania RNA, który reguluje transkrypcję. Oprócz tego istnieje regulacja przez represję. Represor aktywowany przez trp przyłącza się do aktywatora wewnątrz obszaru promotora i blokuje dostęp dla polimerazy RNA.

• Ryboprzełączniki- ekspresja większości genów jest kontrolowana przez białka. Istnieją też niektóre mRNA, które działają jak przełącznik- on- off. Wychwytują one selektywnie metabolity i kontrolują aktywność genów bez angażowania czynników transkrypcyjnych. RNA może wyczuwać sygnały takie jak temperatura, koncentracja soli, jony metali, aminokwasy i inne metabolity.

Przełączniki te są typowe dla bakterii. Tylko jeden taki RNA wykryto w grzybach i roślinach,

Ryboprzełącznik występuje w obszarze 5’ niepodlegającym translacji mRNA. Wśród przełączników wyróżniamy dwa rodzaje strukturalne: aptamer (selektywnie łączy się do tarczowego metabolitu) i platforma ekspresyjna (konwertuje zdarzenia łączenia się z metabolitem w zmiany w ekspresji genu poprzez zmiany w zwijaniu RNA na skutek przyłączania liganda). Platforma ekspresyjna jest zamienną nazwą dla attenuacji operonu tryptofanowego.

• Czujniki metabolitów- sensory. Geny kontrolowana przez ryboswitche kodują białka, które są zaangażowane w biosyntezę lub transport metabolitu, który jest wyczuwany. W większości przypadków riboswitch, który go wyczuwa jest użyty w formie wstecznej inhibicji. Przełącznik metabolitu funkcjonuje jako genetyczny wyłącznik i obniża produkty genów użyte do produkcji metabolitów. Represja działa albo jako terminacja transkrypcji lub blokada inicjacji translacji. W razie braku metabol out jest formowana struktura drugorzędowa RNA antytermiantorowa. Kiedy metabolit się przyłączy tworzy strukturę pnia i działa jako terminator transkrypcyjny. W przypadku kontroli translacji połączenia aptomerów blokuje miejsce przyłączenia mRNA do rybosomu albo inaczej sekwencję shine- dal garno.

• RNA- termometry

Ekspresja wielu genów szoku termicznego u bakterii brodawkowatych korzeni jest regulowana przez zakonserwowany element sekwencyjny RNA zwany ROSE. ROSE jest wrażliwy na temperaturę, tzw. termometr RNA- riboswitch. Reguluje on temperaturę pomiędzy 30- 40 stopni. W niskiej temp. Translacja tego genu jest zablokowana, kiedy został zsyntetyzowany cały mRNA. Blokowany jest dostęp rybosomów przez rozległe struktury drugorzędowe mRNA. Kiedy temp. Wzrośnie te struktury topią się i rybosomy mają dostęp do mRNA. To topnienie dzieje się za sprawą ROSE, które nie potrzebuje do pomocy żadnych innych czynników komórkowych.

• RYBOZYNY- cząsteczka RNA z właściwością katalityczną. Mają one zdolność do samo modyfikacji co jest sprzeczne z definicją enzymu. Enzym jest substancją podnoszącą wydajność i szybkość reakcji chemicznej bez własnej zmiany w całym procesie. Odkryto RNA będące naprawdę enzymem, np. 23 SrRNA w rybosomie katalizuje powstanie wiązania peptydowego bez własnej modyfikacji w procesie tworzenia wiązania. Katalizują one reakcje w ten sam sposób jak białka. Tworzą one miejsca łączenia z substratem i obniżają energię aktywacji reakcji, pozwalając aby reakcja zachodziła szybciej.

• Ryboprzełączniki nie działają jako rybozymy w swoim mechanizmie kontroli genetycznej. W 2004 r odkryto, że rybozy był wrażliwy na dany metabolit i reagował w odpowiedzi na połączenie z nim. Gen glos u Bacillus subtilis koduje enzym aminotransferazę 6- fosforanowo- fruktozowo- glutaminową. Enzym ten powoduje powstanie 6- fosforanu glukozoaminy z 6- fosforanu fruktozy i glutaminy, Rybozym genu glos reaguje na dodanie 6- fosforanu glukozoaminy przez samo wycięcie swojego mRNA, co powoduje blokadę dalszej produkcji 6-fosforanu glukozoaminy i generuje produkt 2’-3’- cykliczny fosforan i koniec 5’- OH.

24.05.2011 r.

OPERON LAC

• Inicjacja transkrypcji odbywa się z miejsca -35 i -10 nukleotydów w obszarze promotora. Sekwencja zgodna do -35 jest TTGACA, a dla miejsca -10- TATAAT ( znana jako Pribnow box)Te miejsca są rozpoznawane przez polimerazę RNA i do nich sona się przyłącza.

• Aktywność Pol RNA w danym promotorze zależy od interakcji z białkami regulatorowymi- czynnikami transkrypcyjnymi. Mogą one być aktywatorami lub rep resorami. Dostępność promotora dla maszynerii transkrypcyjnej jest regulowane w większości przez sekwencje aminokwasowe w białkach zwane operatorami. W większości operonów operator wiąże represor ale są też obszary DNA, w których sekwencje rep resorowe i aktywatorowe zachodzą na siebie.

• Przykładem regulacji za pomocą katabolitu jest operon laktozowy, odpowiedzialny za otrzymywanie energii z beta- galaktozy w postaci laktozy.

• W operonie laktozowym w obszarze regulatorowym leży gen i- regulatorowy, który koduje białko represorowe, występuje 3 geny strukturalne Z, Y i A, gen Z koduje hydrolazę b- galaktozydazę, która hydrolizuje laktozę na monosacharydowe jednostki- glukoza i galaktoza. Gen Y koduje enzym permeazę, która zwiększa przepuszczalność błony komórkowej dla b- galaktozydów, a gen A koduje transacetylazę.

• Kiedy bakteria rośnie na pożywce z glukozą, represor lac jest połączony z obszarem operatora i zapobiega transkrypcji- blokuje miejsce polimerazie RNA.

• Jeżeli w pożywce pojawia się induktor, np. laktoza. Represor łączy się z nim i dalej już nie może być przyłączonym do operatora w obszarze promotora. Wtedy polimeraza RNA może się połączyć w promotorze i transkrypcja może się zacząć.

• Może następować tez represja operonu lac nawet w obecności laktozy, jeżeli jest tez obecna glukoza. Jest ona utrzymywana Az do wyczerpania się glukozy. Ten rodzaj represji jest nazywany represja kataboliczną i wynika z niskich poziomów cAMP. Represja lac operonu jest łagodzona w obecności glukozy i z nadmiarem cAMP, kiedy poziom glukozy w pożywce spada to wzrasta poziom cAMP.

• Aktywacja operonu przez cAM wynika interakcji cAMP z białkiem CRP. Jest ono też nazywane białkiem CAP. Kompleks cAMP- CRP łączy się do obszaru w górę obszaru łączenia się polimerazy RNA i częściowo zachodzi na miejsce łączenia się represora w obszarze operatora. To połączenie aktywuje Pol RNA od 20 do 50krotnie.

OPERON TRYPTOFANOWY

• Operon tryptofanowy składa się z genów kodujących syntezę tryptofanu. Jest on regulowany przez białko represorowe, które aktywowane jest przez połączenie się z tryptofanem i w tej sytuacji tryptofan jest korepresorem. W związku, z tym, że sam tryptofan jest korepresorem i jest zaangażowany w regulację to poziom transkrypcji jest stopniowany, w zależności od poziomu tryptofanu w komórce.

• Ekspresja tego operonu jest regulowana attenuacją. Sekwencje nukleotydowe budują obszar attenuatora i te sekwencje są obecne w transkrybowanym mRNA i są one zaangażowane w regulację transkrypcji po tym jak polimeraza RNA zainicjuje syntezę RNA. Sekwencje attenuatorowe w RNA występują w pobliżu końca 5’ obszaru liderowego RNA. Sekwencje liderowe są ulokowane przed startem obszaru kodującego pierwszego genu w operonie- trpE. Obszar attenuatora ma kodony dla małego liderowego polipeptydu tandemami kodonów tryptofanowych. Ten obszar jest zdolny do tworzenia różnych stabilnych struktur pień- pętla. Zależnie od poziomu tryptofanu i poziomu trp- tRNA i pozycja rybosomów na liderowym polipeptydzie i częstość na translacji pozwalają na tworzenie tych struktur.

• Jeżeli tryptofanu jest pod dostatkiem, to rybosomy nie mogą się łączyć bo powstaje struktura pień- pętla 1-2, najczęściej pień- pętla 3-4. Pętla 3-4 występuje w pobliżu obszaru bogatego w uracyl i działa jako pętla terminująca, w konsekwencji polimeraza jest odłączana od wzorca.

• Taki mechanizm attenuacji jest obecny w operonach genów kodujących liczne inne aminokwasy ale nie ma tego typu regulacji w komórkach eukariotycznych.

REGULACJA EKSPRESJI GENÓW U EUKARIOTÓW

• Transkrypcja RNA jest reakcją polimeryzacji, katalizowanej przez enzymy zwane polimerazami RNA zależnymi od DNA, w obecności jonów magnezu, manganu i czterech nukleozydów tri fosforanowych ATP, GTP, CTP, UTP.

• Transkrypcji towarzyszą białka zwane czynnikami transkrypcyjnymi, których obecność jest konieczna dla przyłączenia się polimeraz de sekwencji promotorowych. Transkrypcja zaczyna się zawsze od promotora do którego przyłączy się odpowiednia polimeraza RNA.

• Proces transkrypcji składa się z trzech etapów: inicjacja, elongacja, zakończenie.

• Występuje rozdzielenie transkrypcji od translacji.

• U eukariontów transkrypcję prowadza trzy różne polimerazy RNA- są on e największymi białkami i najbardziej złożonymi. Ich struktura jest podobna u Eu i Pro.

• Pol I transkrybuje geny rRNA i wymaga obecności jonów magnezu, jest aktywna tylko w jąderku.

• Pol II transkrybuje geny mRNA i większość genów sn RNA- małych jądrowych; wymaga obecności jonów magnezu; nie rozpoznaje promotora; składa się z 12 podjednostek i ma wlk. 600 kDA.

• Pol III transkrybuje geny tRNA, 5SrRNA, jeden sn RNA i sc RNA; wymaga jonów magnezu. Transkrybuje geny, które mają wewnętrzny promotor- usytuowany wewnątrz sekwencji kodujących.

• Każda polimeraza składa się z 2 dużych podjednostek i od 6 do 10 mniejszych. Typowo dla każdej polimerazy dwie największe podjednostki i kilka mniejszych tworzą rdzeń enzymu, który jest zdolny do transkrybowania każdej sekwencji DNA na RNA. Pozostałe podjednostki warunkują specyficzność o- ograniczają Pol do promotora i do pewnych genów.

• Enzymy te mają wlk ok. 10-15 nanometrów i są większe niż nukleosomy.

• Faktory towarzyszące polimerazom w transkrypcji dzielą się na:

- faktory ogólne- działają w połączeniu z jedną z polimeraz w transkrybowaniu większości lub wszystkich genów przez daną polimerazę.

- faktory specyficzne genowo- wskazują gen lub grupę genów, która ma być transkrybowana przez daną polimerazę.

• Polimeraza II transkrybuje wszystkie geny kodujące białko, w której bezpośrednim produktem jest mRNA, Pol II wymaga współdziałania 8 czynników transkrypcyjnych A, B, C, D, E, F, G, H, I, które tworzą razem inicjacyjny kompleks transkrypcyjny.

• Do sekwencji konsensusowej w promotorze przyłącza się D, tzw. TFIID i gromadzi kolejne białka kompleksu. Czynnik H fosforyluje seryny i treoniny w domenie C Pol II i usadawia ją w promotorze. Czynnik A pomaga D i umożliwia łączenie się B, F i E z polimerazą. Polega to na tym, że B i F łączą się z D i powodują zmianę jego konformacji, która pozwala mu na rozpoznanie sekwencji TATA w promotorze. Utworzony kompleks hydrolizuje ATP i rozwija DNA i rozpoczyna się transkrypcja.

• Przed transkrypcją na chromatynę obszaru genu transkrybowanego działają specjalne kompleksy białkowe remodelujące chromatynę w ten sposób, że albo udostępniają obszar promotora genu dla maszynerii transkrypcyjnej albo blokują.

Wykład 31.05.2011

Genomy wirusów:

• SV40-Simian virus – wirus małpi, jego genom został odkryty w 1978 roku na Uniwersytecie w Gandawie w Belgii.

• Jest endemicznym wirusem małpim, wywołuje zmiany chorobowe w nerkach małpich, guzy u chomików; może transformować komórki ludzkie, jest zaliczany do wirusów papova, w której są wirusy brodawczaków (papilioma) i palyoma. Do brodawczaków zalicza się wirusy wywołujące brodawki i kurzajki, u ludzi i innych ssaków. Do grupy polyoma zalicza się SV40, wakuolizujący nerki królika oraz ludzkie wirusy IC i BK.

• Materiałem SV40 jest dwuniciowy DNA, kolisty o długości w przybliżeniu 5224 p.z. średnica kapsydu wynosi 45 nm, kapsyd jest zbudowany z 420 podjednostek ułożonych ukośnie, zgrupowanych w 12 pentamerach i 60 heksamerach, nie ma żadnej zewnętrznej otoczki ani osłony.

Jak wirus wchodzi do komórki i do jądra:

Wirusy z grupy papova są wprowadzane do komórki za pomocą endocytozy, w której uczestniczy receptor (rozpoznający wirusa jako nie obcego). Wirusy są transportowane do jądra komórkowego, gdzie uwalniają swój DNA.

Wirus mozaiki kalafiora (CaMV) wchodzi do komórki z zewnątrz przez nakłucie owadów albo przechodzi z sąsiednich komórek na skutek transportu (przez plazmodesmy). CaMV podobnie jak hepadnavirusy dokują przy porach jądrowych, tam znajdują specjalne białka dokujące i uwalniają swój DNA do jądra. Uwolniony DNA jest niekompletny i ulega „ reperacji” w jądrze i formuje superzwinięty dsDNA i tworzy mini chromosomy. Pozostałe wirusy jak wirus grypy, opryszczki wchodzą do komórki za pomocą endocytozy, ale w przypadku wirusa grypy tworzy się endosom. W endosomie jest kwaśne środowisko, które prowadzi do oddzielenia się białka M1 i fuzji wiralnej i endosomalnej błony. W endosomie w wyniku tego powstaje 8 pojedynczych rybonukleokapsydów, które są uwalniane i transportowane do jądra.

Inne wirusy jak HIV 1 uwalniają swoje kapsydy do cytoplazmy i w cytoplazmie odbywa się odwrócona transkrypcja. Po tym nukleokapsydy rozpadają się i powstają reintegracyjne kompleksy składające się z DNA oraz 3 białek: Vpr, IN oraz MA, one pomagają w dostaniu się wirusa do jądra.

Wirus opryszczki: jego kapsydy są transportowane za pomocą dyneiny (białko motoryczne), które transportuje je do jądra i tam jest uwalniany genom wirusa i łączy się z histonami i tworzą się struktury podobne do nukleosomów.

Agrobakteria zatrzymuje się w miejscach zranienia na kom roślinnych. Z tych miejsc przekazywane są sygnały, które indukują coś tam do produkcji białek wirusowych, one są zaangażowane w wycinanie z plazmidu i transportują jednoniciowy plazmid do komórki. Powstaje kompleks T-DNA….

DNA SV40 jest połączony z nukleosomami komórki gospodarza i tworzy mini chromosomy wewnątrz wirionu i w jądrze zainfekowanej komórki. Do produkcji białek obie nici są używane jako matryca, jednak jest znaczna różnica w replikacji. Jedna nić jest replikowana wcześniej w cyklu replikacyjnym wirusa i z niej syntetyzowane jest białko konieczne do replikacji wirusowego DNA. Uważa się że wczesny mRNA (19S) wirusa transkrybowany jest z wolnego rodzicielskiego DNA, co oznacza, że integracja wirusowego DNA z DNA gospodarza jest konieczna dla ekspresji wczesnego genu wirusowego. Integracja następuje w czasie pojawienia się w jądrze antygenu T, głównego produktu ekspresji wczesnego genu. Równocześnie następuje stymulacja produkcji kom RNA i rozpoczyna się replikacja kom RNA…

Późna transkrypcja daje w efekcie syntezę trzech białek. Gen SV 40 jest regulowany sekwencjami liderowymi o długości 200 p.z. o obszarze genu 16 S RNA i sekwencje wzmacniające występujące przed lub po sekwencjach, na które oddziałują. Genom SV 40 wyróżnia się:

1 – mini chromosomy

2 – podział na wczesną i późną transkrypcję

3 – sekwencje liderowe

4 – sekwencje wzmacniające

Transkrypcja wczesnego wirusowego mRNA stanowi 0,01% całkowitej syntezy mRNA w kom i ma stałą sedymentacji 26S. Jest na końcu 5’ zaopatrzony w czapeczkę guaninową i jest poliadenilowany (poly-A) na końcu 3’. Jest on przerobiony na 3 rodzaje mRNA 19S. W efekcie późnej transkrypcji powstają dwie klasy mRNA: 16S i 19S

Struktura genomu: zerowym miejscem na mapie DNA SV40 jest jedyne miejsce restrykcyjne EcoRI. Enzymy restrykcyjne Hind II i Hind III produkują 13 fragmentów oznaczonych od A do M. Replikacja jest dwukierunkowa i zaczyna się w pozycji 0,67 w palindromie o długości 27 p.z. zasada znajdująca się w środku palindromu jest oznaczona jako „O” i od tego miejsca liczone są nukleotydy „wczesnego” i „późnego” obszaru. Obszar wczesny liczy 2574 p.z. a późny 2649 p.z.

U wszystkich wirusów papova występuje obszar 200 p.z. wokół początku replikacji, który jest przypuszczalnie miejscem przyłączania się antygenu T- białka inicjującego replikację wirusowego DNA. Antygen T może związać się z genomem gospodarza i wpłynąć na inicjację replikacji DNA gospodarza.

Po zakażeniu wirus produkuje 2 antygeny T: jeden o masie powyżej 80000 T a drugi o masie cząsteczkowej 17000-20000. Ten mały antygen-t jest czynny w transformacji kom, a antygen T ma charakter antygenu transplantacyjnego, nadając oporność przeszczepienną.

Sekwencja kodująca T rozpoczyna się w tym samym miejscu co t i do połowy genu t sekwencje są identyczne. W czasie obróbki potranskrypcyjnej m RNA t jest wycinany i kończy się „stop” za 2550 nuleotydem oszaru wczesnej transkrypcji. W przypadku małego antygenu t translacji ulega ¼ cząst. mRNA, a reszta jest wycinana przez nukleazy.

Wirus RNA – Rous sarkoma virus

Genom składa się z 2 jednoniciowych RNA, o podobnej dł. Złączonych dwoma cząst. tRNA, które działają jako startery dla replikacji. Retrowirusy są proste w budowie. Każdy RNA zawiera 4 geny: gag – rdzeń białkowy, Pol – odwrotną transkryptazę, env – białko otoczki, one - gen kodujący białko transformacji onkogennej. Na każdym końcu tych genów jest długa terminalna powtórka 560 p.z. Wirus posiadający gen Pol może zsyntetyzować dwuniciowy DNA na matrycy RNA i w ten sposób może się zintegrować z DNA gospodarza. Integracja ta jest konieczna do transkrypcji genów wirusa i replikacji. Nie wszystkie wirusy są onkogenne.

Wirus mozaiki tytoniu – TMV jako przykład wirusa o budowie pałeczkowatej.

Pałeczka TMV ma kształt helikalny i jest strukturą symetryczną. TMV obejmuje zespół szczepów wirusów o zbliżonych właściwościach. Różnią się między sobą właściwościami serologicznymi, rodzajem wywołanych symptomów i zasięgiem gospodarzy.

Wokół heliakalnej zwiniętej nici RNA ( o 6380 nukleotydach) o masie cząsteczkowej 2,1*10 do 6. Dookoła umieszczone są 2130 podjednostek białkowych kapsydu. Podjednostka jest pojedynczy łańcuch białkowy o masie cząsteczkowej 17500 złożony ze 158 aminokwasów. Każda podjednostka łączy się z 3 nukleotydami RNA i tworzy rodzaj cylindra, w którego środku jest umieszczony RNA.

Trzy białka powstają na skutek translacji wirusowego RNA. Powstają monocistronowe, krótkie mRNA i na końcu 5’ jest czapeczka guaninowa, a na końcu 3’ struktura tRNA, zdolna do aminoacylacji histydyny. Po infekcji TMV w kom najpierw są syntetyzowane białka niestrukturalne potrzebne do replikacji. Potem tworzy się nić – RNA, która jest transkrybowana do nici +RNA. Nić +RNA kieruje syntezą białka kapsydu.

Oprócz monocistronowych mRNA powstają mRNA potomne nici + pełnej długości.

Po infekcji kom wirusem następuje kilkugodzinny okres bez zmian. W tym czasie wirusy tracą swoją tożsamość fizyczną i znaczną część albo całość zakaźności w okresie wstępnego etapu replikacji i ten okres nazywa się fazą eklipsy. Potem faza produktywna, w której tworzone są nowe cząst. wirusa i są uwalniane z komórek.

Plan replikacji wirusowej:

1. Wirus przyłącza się do komórki

2. Wnika do jej wnętrza

3. Podłaszcza się, tzn. traci otoczkę białkową

4. DNA jest przepisywane na różnorodne mRNA kodujące albo 5’ wczesne albo późne białka. Oba typy białek są syntetyzowane na rybosomach komórkowych. Białka wczesne mogą być…

Wszystkie wirusy mają na swojej powierzchni białko, które ma miejsce wiążące receptor znajdujący się na powierzchni komórki.

Po przyłączeniu się do komórki następuje fuzja otoczki wirusa z błoną plazmatyczną komórki i uwolnienie kwasu nukleinowego wirusa. Wirusy mają specjalne białko fuzyjne pośredniczące w zlewaniu się lipidów osłonki wirusa i błony komórkowej.

Na drodze pinocytozy – wiropeksji wnika cały winion do wnętrza komórki. W tym pośredniczy białko klatryna, która otacza wirus i w pęcherzykach wnika do komórki. Uwolnienie wirusa z otoczki następuje przy pomocy białka wirusowego hemaglutyniny (HA). Po uwolnieniu wirus migruje do jądra komórkowego i tam ulega transkrypcji i replikacji. Nie wiadomo jak jest zabezpieczany kwas nukleinowy wirusa w cytoplazmie przed nukleazami.

Wykład 7.06.2011r.

Replikacja faga fi X174

• Wyróżnia się 4 etapy:

1. Endonukleaza nacina nić + w podwójnoniciowej replikatywnej formie faga

2. Wolny koniec 3’ powstały w wyniku tego nacięcia, służy jako starter do dodawania nukleotydów do nici +, natomiast koniec 5’ jest przemieszczony; nić- (negatywna) służy jako wzorzec, replikacja postępuje w miarę jak nić + się wydłuża

3. Jednostka długości nici +DNA zostaje przemieszczone i odcięta przez endonukleaz a wolne końce zostają zbigowane, tworzy się koło.

4. Replikacja postępuje i tworzy się druga nić + na wzorcu nici negatywnej: cały proces powtarza się kolejno i powstaje wiele kół fagowego genomu.

Mutacje genu

• Mutacjami są zmiany w sekwencji Dna genu. Konsekwencją tych zmian mogą być zmiany w sekwencji aminokwasów w białku kodowanym przez ten gen lub zniesienie ekspresji genu.

• U bakterii(nie tak jak u Eu.!!!); u eukariotów zmiana w sekwencji nukleotydów w genie o prowadzi do powstania allelu tego genu, który koduje cechę przeciwstawną.

• U bakterii każda mutacja jest widoczna, gdyż brak chromosomów, geny nie występują parami. Wyróżnia się dwie podstawowe typy mutacji u bakterii :

1. PUNKTOWE LUB SUBSTYTUCJE

Mutacje punktowe dotyczą zmiany jednego nukleotydu, która może powstać na skutek tranzycji. Tranzycja to podstawienie jednej puryny w miejsce drugiej puryny, lub pirymidyny na drugą pirymidynę. Jest to najpowszechniejszy typ mutacji gdyż może powstawać poprzez chemiczne modyfikacje zasad azotowych. Modyfikacja zasad powoduje, że łączą się one z zasadami niehomologicznymi- nie tworzą się pary zasad zgodne z modelem Watsona i Cricka.

Transwersje sa podstawieniem puryn w miejsce pirymidyn i odwrotnie. Jeżeli substytucja ma miejsce w obszarze kodującym genu może, lecz nie zawsze musi zmienić sekwencję aminokwasów w białku. W składzie aminokwasowym w białku nie zawsze występują zmiany, gdyż aminokwas może mieć więcej niż jeden kodon. Jeżeli mutacja zajdzie w kodonie, który koduje krytyczne aminokwasy w tym białku nastąpi zmiana sekwencji aminokwasów w białku, a jeżeli takie domeny nie są krytyczne- mogą one ulegać podstawieniu i mutacji bez szkody w funkcjonowaniu białka.

Mutacja w genie może spowodować taką sytuację, że może nie dojść do wytworzenia białka- substytucja powoduje, że kodon kodujący dany aminokwas zostaje przemieniony na kodon STOP, np. w kodonie tryptofanowy UGG na UGA- kodon stop- i do przedwczesnego zakończenia translacji i powstania nieprawidłowego białka.

Substytucja zasad może uniemożliwić translację białka wtedy, gdy powstanie kodon STOP. Substytucja w sekwencji TATA boksu, który jest koniecznym elementem regulatorowym genu, może prowadzić. W tym przypadku sekwencje kodujące białko mogą być nietknięte mutacją ale gen będzie nieaktywny, ponieważ nie będzie transkrybowany.

1. INSERCJE LUB DELECJE

Tego typu mutacje zmieniają ramkę odczytu genu i mają większy wpływ na kodowane białko niż substytucje.

• MUTACJE SPONTANICZNE

Powstają niezależnie od czynnika indukującego mutację. Częstość mutacji u różnych bakterii jest bardzo zróżnicowana. U E. coli częstotliwość mutacji dla poszczególnych genów waha się od 10 -5 mutacji na pokolenie do 10 -9. U Mycobacterium i riketsji mutacje są wyjątkowo rzadkie.

Źródłem spontanicznych mutacji są najczęściej błędy w czasie replikacji DNA:

-tautomeria zasad powoduje błędne włączanie nukleotydów

-wstawianie analogów zasad azotowych, w miejsce naturalnie występujących zasad azotowych

-uszkodzenie zasad, np. deaminacja 5- metylocytozyny, która przechodzi w tyminę przyłącza inną zasadę

Pomimo, że występują błędne włączenia zasad w czasie replikacji to polimeraza DNA ma właściwości korygujące i nie dochodzi tak często do mutacji.

• MUTACJE WYWOŁYWAĆ MOGĄ TAKŻE:

1. Transpozony też mogą wywoływać mutację u bakterii, indukują zmiany w strukturze genu, co z kolei skutkuje zmianą białka.

2. Rekombinacja genetyczna u bakterii i bakteriofagów, dzieli się na dwa zasadnicze typy:

1. OGÓLNA

Zachodzi pomiędzy homologicznymi nićmi DNA. Przebiega wg. Trzech szlaków rekombinacyjnych, które sa prowadzone przez trzy białka: RecBCD, RecE, RecF. Białko RecBCD rządzi rekombinacją pokoniugacyjną i potransdukcyjną, gdy jednym z rekombinantów jest dwuniciowy, liniowy DNA. Szlak RecF zachodzi między cząsteczkami kolistego Dna i między DNA- plazmid. Rekombinacja w różnych szlakach zachodzi w obecności białka RecA. Białko to łączy się z jednoniciowym DNA i nadaje mu zdolność inwazji drugiej cząsteczki DNA. Oprócz tego białka w rekombinacji DNA bierze udział więcej białek, powyżej wymienione sa jednak najważniejsze.

1. NIEUPRAWNIONA- zachodzi między helisami DNA nie wykazującymi ogólnej homologii

SWOISTA- dla miejsca uwarunkowana jest obecnością kilku krótkich odcinków homologii sekwencji między rekombinującymi partnerami. Ten rodzaj rekombinacji ma znaczenie w rearanżacji genów u bakterii i powstających mutacji- duplikacji, a czasami zwielokrotnienie odcinków DNA przyczyniających się do powielenia genomu bakterii.