BIOTECHNOLOGIA

SPRAWOZDANIE

Joanna Ligas

Joanna Lis

Agnieszka Kordylewska

Maciej Zając

CEL ĆWICZEŃ: Ekspresja dzikiego typu oram mutantów ludzkiego fibro blastycznego czynnika wzrostu FGF2 w szczepie BL(DE3) pLysS E.coli, a następnie oczyszczenie uzyskanego preparatu białkowego.

Dzień 1

Przygotowanie materiałów, odczynników.

Pożywki oraz bufory sporządzono według protokołu.

Funkcje składników buforów:

Tris/HCl – utrzymanie odpowiedniego pH roztworu.

NaCl – utrzymanie siły jonowej, aby w chromatografii nastąpił rozdział.

EDTA – chelatowanie dwuwartościowych jonów metali w celu utrzymania aktywności enzymów (metaloproteaz).

PMSF – inhibicja proteaz serynowych.

DTT – zapobieganie powstawania mostków disiarczkowych, zapobieganie utlenianiu wolnych grup –SH, zapewnienie środowiska redukującego.

Transformacja bakterii chemicznie-kompetentnych metodą szoku cieplnego.

Transformacja – wprowadzenie do organizmu prokariotycznego obcego DNA w celu zmiany właściwości dziedzicznych organizmu. W naszym przypadku – wprowadzenie plazmidu zawierającego gen kodujący białko FGF2 oraz geny oporności na ampicylinę i chloramfenikol.

Destabilizacja błon komórkowych bakterii umożliwiająca wprowadzenie plazmidu osiągana jest przez zastosowanie metody szoku cieplnego.

Postępowano według protokołu.

Wydajność transformacji: JAK KTOŚ MA TO ILE WYROSŁO NA PŁYTKACH TO NIECH DOPISZE

100 µl bakterii

2 µl plazmidu – 100 ng DNA

0,1 µg DNA – 599 cfu

1 µg – X

X = 5,99 cfu / µg DNA

Dzień 2

Przygotowanie prehodowli, przygotowanie pożywki.

Postępowano według protokołu.

Dzień 3

Ekspresja

Postępowano według protokołu; wyjątek: pożywka zawierała jeden antybiotyk – ampicylinę.

NIE MAM TYCH WYNIKÓW OD CO MIERZYLIŚCIE. JAK KTOŚ MA TO NIECH WPISZE I NAJLEPIEJ DOPISZE CO Z TEGO WYNIKA, JAK WIE.

Dzień 4

Oczyszczanie białka.

Sonikacja – wykonuje się ja w celu rozbicia bakterii, pofragmentowania DNA, zmniejszenia lepkości roztworu.

Przemywanie buforem A:

A₂₈₀ (próbka po 1/3 objętości buforu) = 0,338

A₂₈₀ (próbka po 1/2 objętości buforu) = 0,166

A₂₈₀ (próbka po 2/3 objętości buforu) = 0,121

Przemywanie buforem B:

A₂₈₀ (próbka po 1/3 objętości buforu) = 0,06

A₂₈₀ (próbka po 1/2 objętości buforu) = 0,03

A₂₈₀ (próbka po 2/3 objętości buforu) = 0,002

Elucja buforem C:

A 1	0,011
A 2	0,017
A 3	0
A 4	0
A 5	0
A 6	0
A 7	0,006
A 8	0,141
A 9	0,027
A 10	0,053
A 11	0,074
A 12	0,136
A 13	0,196
A 14	0,185
A 15	0,271
A 16	0,384
A 17	0,442
A 18	0,507
A 19	0,646
A 20	0,526
A 21	0,608
A 22	0,559
A 23	0,501
A 24	0,444
A 25	0,374
A 26	0,844
A 27	0,196
A 28	0,297
A 29	0,095
A 30	0,0175

Połączono frakcje 12 – 28 otrzymując preparat oczyszczonego białka.

NIECH KTOŚ ZROBI DO TEGO WYKRES I WKLEI

Dzień 5

Odsalanie oczyszczonego FGF2

Krok ten ma na celu pozbycia się dużej ilości soli w preparacie po chromatografii powinowactwa. 1 ml preparatu odsala się metodą filtracji żelowej.

Profil elucji: A₂₈₀

A280 1	0
A280 2	0,015
A280 3	0,007
A280 4	0,118
A280 5	0,109
A280 6	0,239
A280 7	0,152
A280 8	0,032
A280 9	0,016

WYKRES NIECH KTOŚ Z TEGO ZROBI

Powtórzono pomiar dla prób 6 i 7 oraz oznaczono stężenie białka:

6 – 13,1 µM

7 – 7,6 µM

Analiza elektroforetyczna.

Składniki buforu do próbek:

SDS – nadaje białku ujemny ładunek, tak, aby zostały rozdzielone na podstawie masy.

β-merkaptoetanol – redukcja mostków disiarczkowych

Glicerol – nadaje obciążenie.

Tris – bufor, utrzymuje odpowiednie pH.

Gotowanie próbek do elektroforezy – przyspiesza denaturację termiczną, układ szybciej dochodzi do równowagi.

Dane markera:

Page Ruler Prest

Product #26616

Lot #00117687

Kolejność próbek w elektroforezie:

1. Marker.

2. Preparat przed indukcją IPTG.

3. Preparat po indukcji IPTG.

4. Puste miejsce (powinien być osad po sonikacji i wirowaniu, niestety nie rozpuścił się w buforze do próbek przez co niemożliwym było nałożenie go na elektroforezę.)

5. Supernatant.

6. Puste miejsce.

7. Eluent po nanoszeniu preparatu na kolumnę w chromatografii powinowactwa.

8. Próbka zebrana podczas przemywania buforem A.

9. Próbka zebrana podczas przemywania buforem B.

10. Oczyszczony preparat FGF2.

Interpretacja wyników elektroforezy:

2. Jest to białko przed indukcją IPTG, a więc przed syntezą FGF2 – nie ma go zatem w preparacie. Widoczne jest wiele innych białek balastowych. CZY JEST? WIEM, ŻE NIE POWINNO, ALE NIE WIEM CZY TAM NIE MA TEGO PASKA, CIĘŻKO STWIERDZIĆ, POPRAWCIE JAK COŚ.

3. Preparat po indukcji syntezy białka FGF2 – obserwujemy gruby prążek odpowiadający masie naszego białka oraz wiele innych białek balastowych.

4. W tym miejscu nie został nałożony żaden preparat. Wynik elektroforezy jest skutkiem przelania się części preparatu z poprzedniej studzienki, jest to więc obraz taki sam jak w przypadku miejsca 3, słabszy, gdyż znalazło się tam o wiele mniej materiału.

5. W próbce supernatantu widoczny jest wyraźny prążek pochodzący od białka FGF2. Po wirowaniu białko to znajduję się we frakcji roztworu, więc jest to wynik prawidłowy.

6. W tym miejscu nie został nałożony żaden preparat. Sytuacja podobna jak w przypadku studzienki nr 4. Podczas nakładania poprzedniej próbki, jej część przelała się do następnej studzienki – stąd widoczne prążki na elektroforezie, pochodzą one z preparatu z supernatantu.

7. W tym miejscu nie obserwujemy białka FGF2, gdyż po naniesieniu preparatu na kolumnę w chromatografii powinowactwa, zostało ono związane do kolumny i nie znajduje się w eluacie.

8. Podczas przemywania kolumny roztworem A, białko FGF2 jest związane z kolumną, więc nie ma go w preparacie. Na elektroforezie nie zauważamy więc prążka pochodzącego od naszego białka. Widzimy słabe sygnały innych białek niezwiązanych z kolumną.

9. Sytuacja podobna do poprzedniej, podczas przemywania buforem B, białko FGF2 związane jest z kolumną, na elektroforezie nie ma prążka pochodzącego od naszego białka.

10. Próbka z oczyszczonego preparatu – widzimy wyraźny, gruby prążek pochodzący od białka FGF2. Stopień oczyszczenia jest wysoki, zauważyć możemy kilka innych, jednak bardzo słabych prążków.

Widma fluorescencji białka FGF2 natywnego i zdenaturowanego

Pomiar fluorescencji jest dobrą metodą przy określeniu stopnia zwinięcia białka FGF2.

Widmo fluorescencyjne natywnego białka : pik przy długości fali ok. 310 nm pochodzi od tyrozyny. FGF2 posiada w swojej strukturze tryptofan, jednak nie obserwujemy jego fluorescencji w przypadku natywnego białka, gdyż jest on tak ułożony, że bardzo ściśle przylega do okolicznych reszt i jego fluorescencja zostaje w ten sposób wygaszona.

Widmo fluorescencyjne zdenaturowanego białka : intensywność fluorescencji znacznie spada wraz ze wzrostem temperatury, więc kiedy białko FGF2 zostanie poddane denaturacji, poziom fluorescencji jest bliski zeru, co możemy zauważyć na powyższym wykresie.