IZOLACJA RNA I DNA

• MATERIAŁ DO IZOLACJI

• Najczęściej wykorzystywany materiał biologiczny (człowiek, zwierzęta)

- krew obwodowa

- komórki epitelialne ( rola w procesach immunologicznych)

- komórki płynu owodniowego

- komórki kosmówki (CVS)

- komórki cebulek włosów

• Rzadziej stosowanym materiałem wyjściowym jest (człowiek, zwierzęta)

- plamy krwi

- nasienia

- fragmenty tkanek pobrane metodą biopsji cienkoigłowej

- szpik kostny

• W przypadku roślin:

- liście

- młode siewki

METODY IZOLACJI

Wybór odpowiedniej metody izolacji zależy:

• od rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyskać (DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe, RNA itd.),

• pochodzenia (roślinne, zwierzęce, bakteryjne, wirusowe itd.),

• rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolację

(z tkanek, organu, hodowli komórkowej itd.),

• oczekiwanych rezultatów (czystość, jakość, czas izolacji itd.)

• przeznaczenia (PCR, klonowanie, itd.)

IZOLACJA RNA I DNA
ETAPY

METODY IZOLACJI DNA

Obecnie metody izolacji można podzielić na trzy grupy:

1. Izolacja DNA z zastosowaniem mieszaniny fenol: chloroform (stosowane do preparatów)

2. Izolacja DNA, która przebiega z wysoleniem białek z otrzymanych lizatów komórek

Izolacja DNA z wykorzystaniem odpowiedniego nośnika, do którego DNA będzie się wiązać, następnie odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie związanego DNA

• Izolacja DNA z zastosowaniem ekstrakcji fenolem i chloroformem
  (z pełnej krwi obwodowej)

LIZA KOMÓRKI -> EKSTRAKCJA DNA Z FAZY WODNEJ (WIROWANIE) -> WYTRĄCANIE DNA -> SUSZENIE -> ROZPUSZCZENIE DNA -> OZNACZENIE DNA

• Izolacja DNA z odsalaniem białek
  (z pełnej krwi obwodowej )

POBRANIE KRWI OBWODOWEJ -> WIROWANIE LIZATU KRWI W WIRÓWCE -> INKUBACJA -> WYTRĄCANIE DNA -> ROZPUSZCZANIE DNA W STERYLNEJ WODZIE

• Izolacja DNA z materiału roślinnego CTAB

LIŚCIE ROZCIERAMY W MOŹDZIERZU-> EDTA/CTAB -> ROZERWANIE STRUKTUR KOMÓRKOWYCH -> INKUBACJA -> WIROWANIE -> WYTRĄCENIE DNA -> WYTRĄCONE DNA NAWINĄĆ NA HACZYK -> ROZPUŚCIĆ DNA

• METODY IZOLACJI
  RNA

Wśród metod izolacji RNA z różnych materiałów wyjściowych, wyróżnia się:

1. Izolacja RNA z limfocytów krwi obwodowej

2. Izolacja RNA z komórek hodowlanych IN VITRO

3. Izolacja RNA z tkanek

4. Izolacja całkowitego RNA z zastosowaniem TRIZOLU

5. Izolacja mRNA z zastosowaniem metody chromatografii powinowactwa

Pomiary stężenia DNA i RNA

Stężenie dwuniciowego DNA C(μg/ml)=(A₂₆₀-A₃₂₀)*50*rozcieńczenie

Stężenie jednoniciowego DNA C(μg/ml)=(A₂₆₀-A₃₂₀)*33*rozcieńczenie

Stężenie RNA C(μg/ml)=(A₂₆₀-A₃₂₀)*40*rozcieńczenie

Pomiar stężenia DNA w roztworze oznacza się poprze pomiar absorpcji przy długości fali λ = 260 nm,

określanej często jako OD – gęstość optyczna.

Idealny roztwór do pomiarów spektrofotometrycznych DNA to bufor o niskim stężeniu jonów, np. bufor TE. Bufor  stosowany najczęściej  do elucji i długotrwałego przechowywania kwasów nukleinowych. Optymalny zakres pH zapewnia stabilość kwasów nukleinowych w trakcie przechowywania.  EDTA  zawarty w buforze chelatuje jony dwuwartościowe będące kofaktorami nukleaz, chroniąc w ten sposób kwasy nukleinowe przed degradacją. TRIS zapewnia utrzymanie właściwego pH roztworu, które nie interferuje negatywnie w reakcjach następczych. 

Długość fali (nm)	substancje absorbujące
230	EDTA, polisacharydy, etanol
260	DNA, RNA
270	fenol
280	białka
320	drobiny komórkowe

Jeżeli A260 równa się 1 to stężenie dwuniciowego DNA (dsDNA) wynosi około 50 µg/ml, natomiast jednoniciowego DNA (ssDNA) 33 µg/ml, RNA - 40 µg/ml, a oligonukleotydów 30 µg/ml.

Preparat DNA uznaje się za czysty jeżeli A260/A280 wynosi 1,8-2,0. Kiedy próbka DNA jest zanieczyszczona RNA to wartość A260/A280 jest bliższa 2,0 , natomiast w razie gdyby próbka zanieczyszczona była białkami to wartość A260/A280 jest niższa od 1,8.

Elektroforeza

• Jest podstawową metodą wizualizacji kw. nukleinowych, białek, peptydów, aminokwasów.

• Techniką rozdzielenia fragmentów kw. nukleinowych, białek frakcje.

• Techniką oczyszczania DNA, białek itd.

Polega na rozdzieleniu mieszaniny zw. chem. na jednorodne frakcje PRZEZ:

• Wymuszenie wędrówki ich cząstek w polu elektrycznym

Od czego zależy: wielkości cząstek, stężenia żelu, wielkość ładunku cząsteczek, właściwości elektrolitu

Im MNIEJSZE cząstki tym SZYBCIEJ poruszają się!

Im stężenie żelu WIĘKSZE tym WOLNIEJ poruszają się cząstki!

• Cząstki o różnej konformacji DNA poruszają się z różną prędkością w polu elektrycznym.

• NIE MOŻNA określać wielkości cząsteczki kolistej DNA porównując jej drogę migracji z liniowym DNA.

Na co trzeba zwrocić uwagę dokonując elektroforezy?

• Parametry elektryczne. Podczas elektroforezy wydziela się ciepło, które musi być obowiązkowo odprowadzane! To jest związane z odpowiednimi parametrami el. Dlatego przed elektroforezą trzeba zanalizować parametry el.

• Temperatura. T=const. (na zadanym poziomie).Zbyt duże wydzielane ciepło może spowodować: Denaturację białek, uszkodzenie aparatu, topnienie żeli elektroforetycznych.

Techniki elektroforezy

• Elektroforeza pozioma (agarozowa) (w stałym polu elektrycznym, w zmiennym polu elektrycznym)

  • Nośnik tu jest umieszczony poziomo.

  • Brak wycieków elektrolitu.

  • Istnieje możliwość odprowadzenia ciepła generowanego.

  • Służy do rozdziału dużych fragmentów cząst.

• . Elektroforeza pionowa (poliakrylamidowa) (Elektroforeza poliakrylamidowa w obecności żelu niedenaturującego, Elektroforeza poliakryloamidowa w obecności żelu denaturującego )

  • Służy do rozdziału małych fragmentów cząst.

  • Może służyć do rozdziału monomerów i oligomerów.

  • Duża zdolność rozdzielcza. (W różnicy długości o 0,1%)

  • Można rozdzielić większe ilości związków ( 10 µg w jednej ścieżce) bez utraty zdolności rozdzielczej.

  • DNA uzyskana w tym żelu jest b. czyste.

Agaroza - naturalny polimer (polisacharyd) izolowany z ścian kom. krasnorostów.

Detekcja DNA i RNA

• Barwienie bromkiem etydyny (Cząsteczki bromku etydyny wnikają pomiędzy parami zasad kw. nukleinowych, dzięki czemu one stają sie widoczne w UV.

• Bromek etydyny jest fluorescensyjnym barwnikiem.)

• Barwienie związkami srebra (Barwienie związkami srebra jest bardziej czułe niż barwienie bromkiem etydyny. Jest to metoda fotochemiczna.)