Wydział: BiNoŻ

Kierunek: Biotechnologia
semestr: IV

gr. dziekańska: 3

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Wpływ stężenia substratu i enzymu na szybkość reakcji.
Wyznaczenie początkowej szybkości reakcji

Data wykonania ćwiczenia: 22.04.2010

Data oddania sprawozdania: 29.04.2010 Maja Szczepaniak
Marcin Szustak
Tomasz Styś

WSTĘP TEORETYCZNY

Główna funkcja enzymów jest zwiększanie szybkości reakcji, tak by reakcje te mogły sprostać wymaganiom organizmu. Kinetyczny opis aktywności enzymów jest konieczny do zrozumienia działania enzymów. Dla wielu enzymów szybkość katalizy V₀, która definiowana jest jako liczba moli produktu utworzonego w czasie 1 sekundy. Ze wzrostem stężenia substratu, szybkość katalizy rośnie lawinowo, następnie przy większych stężeniach substratu ulega zwolnieniu i osiąga wartość maksymalną.

Stała Michaelisa (K_m) - jest to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie szybkości maksymalnej (V_max) tej reakcji. Stała ta jest wyrażana w molach na dm³ i określa powinowactwo enzymu do substratu: im jest mniejsza, tym powinowactwo jest większe, natomiast duża wartość tej stałej mówi o małym powinowactwie enzymu do substratu

źródło:

• „Biochemia” Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer

• www.wikipedia.pl

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

2.1. Wyznaczenie krzywej progresji reakcji i obliczanie początkowej szybkości reakcji.

Sposób wykonania: Do 6 probówek odmierzyliśmy 0,5 ml 250 mM roztworu sacharozy. Następnie co 15 sekund do probówek dodawaliśmy 0,5 ml β-fruktofuranozydazy
i inkubowaliśmy w temperaturze pokojowej. Pierwsze 2 roztwory inkubowaliśmy przez
5 minut od dodania enzymu, kolejne dwa po 10, a ostatnie po 20 minutach od dodania enzymu. W międzyczasie przygotowaliśmy próbę odczynnikową oraz próbę kontrolną. Próbę odczynnikową sporządziliśmy poprzez dodanie do 0,5 ml wody destylowanej 0,5 ml DNS. Mieszaninę inkubowaliśmy 5 minut we wrzącej łaźni a następnie schłodziliśmy i dodaliśmy
4 ml wody destylowanej. Próbkę tą stosujemy do kalibracji spektrofotokolorymetru. Próbę kontrolna przygotowaliśmy dodając do 0,5 ml enzymu 1 ml DNS a następnie 0,5 ml 250 mM roztworu sacharozy. Mieszaninę tą inkubowaliśmy przez 5 minut we wrzącej łaźni. Potem schłodziliśmy, dodaliśmy 8 ml wody destylowanej i zbadaliśmy absorbancję wobec próby odczynnikowej. Po upływie czasu potrzebnego do inkubacji prób właściwych przerywaliśmy działanie enzymu poprzez dodanie 1 ml DNS. Probówki następnie wymieszaliśmy i umiesiliśmy na 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po tym czasie probówki wyjęliśmy i schłodziliśmy do temperatury pokojowej. Dodaliśmy 8 ml wody destylowanej i zmierzyliśmy A₅₄₀ wobec próby odczynnikowej.

Obserwacje i obliczenia:

Tabela obrazująca wyniki absorbancji otrzymanych roztworów

	Absorbancja
Próba kontrolna	0
Czas [min]	Próba 1
5	0,217
10	0,479
20	0,916

• Przykład obliczeń zawartości cukrów redukujących dla czasu reakcji równego 5 minut. Obliczenia ilości cukrów redukujących dla uzyskanych absorbancji równych: 0,217 i 0,22 dokonujemy z proporcji przy użyciu krzywej wzorcowej:

0,1 - 0,55 μmol c.reduk./ ml 0,1 - 0,55 μmol c.reduk./ ml

0,217 - x μmol c.reduk./ ml 0,220 - x μmol c.reduk./ ml

• Wyliczamy ilość powstałego produktu uwzględniając dwukrotne rozcieńczenie próbek:

x= 1,1935 x= 1,210

	Absorbancja	Stężenie produktu P []
czas [min]	Pomiar 1	Pomiar 2
5	0,217	0,220
10	0,479	0,474
20	0,916	0,952

Wykres zalezności stężenia produktu od czasu trwania reakcji P = f(τ)

!Linia na wykresie to linia trendu- normalna krzywa powinna zaczynac maleć przy 3 punkcie!!

• Obliczamy szybkość reakcji z równania:

• Dla pomiaru 1:

Średnia szybkość:

• Dla pomiaru 2:

Średnia szybkość:

• Obliczamy aktywność enzymu dla czasu t = 10 min

Gdzie:

A- aktywność enzymu

0,5- współczynnik wynikający z tego, że 1 cząsteczka sacharozy hydrolizuje na 2 cząsteczki cukrów redukujących

A₅₄₀ – wartość absorbancji próbki po określonym czasie

k – współczynnik nachylenia krzywej wzorcowej wynoszący 5,5

[E]- stężenie enzymu; ([E]= 20µg/ml = 0,02mg/ml)

2- rozcieńczenie enzymu

t- czas reakcji

• Dla próbki 1:

• Dla próbki 2:

Wnioski:

Uzyskana przez nas krzywa pokazuje nam, że przez pierwsze 20 minut rozkład sacharozy przez β-fruktofuranozydazę ma charakter zerowego rzędu – wykres jest liniowy. Szybkość początkowa wyliczona w obu próbach jest zbliżona, a także wartości szybkości wyliczane
w kolejnych odstępach czasu oscylują przy średniej wartości szybkości reakcji. Uzyskana aktywność pokazuje nam, że w ciągu jednej minuty jeden mg enzymu rozłożył nieco ponad 13 μmola sacharozy.

2.2.Wyznaczanie wpływu stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej.

Sposób wykonania: Do 8 probówek dodaliśmy po 0,5 ml roztworów sacharozy o stężeniach: 31,2, 62,5, 125, 250 mM ( po jednej wartości stężenia do dwóch probówek). Następnie co 15 sekund dodawaliśmy po 0,5 ml enzymu natychmiast mieszaliśmy. Uzyskana mieszaninę inkubowaliśmy przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dokładnie po 10 minutach dodaliśmy po 1 ml DNS. Po dokładnym wymieszaniu umieściliśmy próbki na 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie wyjęliśmy je, schłodziliśmy i dodaliśmy po 8 ml wody destylowanej. Na końcu zbadaliśmy absorbancji uzyskanego roztworu wobec próby odczynnikowej.

Obserwacje i obliczenia:

Wyniki absorbancji badanych roztworów

stężenie sacharozy [mM]	Absorbancja
	próba 1
31,2	0,137
62,5	0,252
125	0,366
250	0,398
Kontrolna	0

• Obliczamy przyrost stężenia substratów

Gdzie:

k- współczynnik nachylenia krzywej wzorcowej równy 5,5

rozc- rozcieńczenie równe 2

• Przykładowe obliczenie dla pomiaru 1 sacharozy o stężeniu 31,2 mM

Zestawienie wyników obrazujące ilość powstałych cukrów redukujących dla danych stężeń substratu

Stężenie cukrów redukujących
stężenie sacharozy [mM]
31,2
62,5
125
250

• Obliczamy szybkość początkową reakcji katalizowanej przez enzym ze wzoru:

t = 10 min

[E]- stężenie enzymu; ([E]= 20µg/ml = 0,02mg/ml)

• Przykładowe obliczenie dla stężenia sacharozy równego 31,2 dla próbki 1

	Szybkość początkowa V0
stężenie sacharozy [mM]	próba 1
31,2	3,768
62,5	6,930
125	10,065
250	10,945

Zestawienie wyników szybkości początkowej dla badanych stężeń.

Punkt przecięcia prostej z osia OX jest wartością -1/Km

Punkt przecięcia prostej z osia OY jest wartością 1/Vmax

Wykres Lineweara - Burka, zależność 1/V₀=f(1/[S])

Wyznaczenie V_max oraz stałej Michaelisa K_m z wykresu

Równanie prostej y = 6,654x + 0,051

• Dla x = 0 y= 0,051 = 1/V_max

V_max = 19,61

• Dla y = 0 x = -0,00766 = -1/K_m

K_m = 130,5 [mM]

Wnioski:

Wraz ze wzrostem stężenia rośnie szybkość reakcji enzymatycznej jednak tylko do pewnego momentu. Początkowy wzrost jest spowodowany tym, że w środowisku znajduje się dużo cząsteczek enzymu którego jest znacznie więcej niż substratu. Dlatego każda ilość dodawanego substratu zwiększa szybkość bo zajmowane są kolejne cząsteczki enzymu. Gdy wszystkie cząsteczki enzymu zostaną zajęte przez substrat szybkość reakcji nie może być już wtedy zwiększona, osiągana jest szybkość maksymalna działania enzymu. Otrzymana stała Michaelisa wyznaczone w różnych metodach znacznie różni się od siebie. Spowodowane to było niedokładnością w wykonywanym zadaniu. Ponieważ wyznaczenie stałej z wykresu Lineweara – Burka jest dokładniejsze możemy uznać ze wartość ta jest dokładniejsza niż wyznaczanie jej graficznie z wykresu zależności szybkości reakcji od stężenia substratu. Wartość Km oznacza nam takie stężenie substratu dla którego szybkość reakcji enzymatycznej zmniejszyła się o połowę w stosunku do szybkości maksymalnej.

2.3. Wyznaczanie wpływu stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej.

Sposób wykonania: Do probówek dodaliśmy po 6,5 ml każdego z czterech przygotowanych roztworów enzymu ( po dwa powtórzenia każde). Następnie co 15 sekund dodawaliśmy do każdej probówki po 0,5 ml 250 mM roztworu sacharozy, wymieszaliśmy i inkubowaliśmy przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie tego czasu przerwaliśmy proces hydrolizy poprzez dodanie 1 ml roztworu DNS. Potem próbki wymieszaliśmy i ogrzewaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut po czym schłodziliśmy próbki dodaliśmy do nich 8 ml wody destylowanej i zmierzyliśmy absorbancję wobec próby odczynnikowej.

Przygotowane roztwory o następujących rozcieńczeniach

Stężenie enzymu [μg/ml]	Ilość buforu [ml]	Enzymu[ml]	Rozcieńczenie
20	-	0,5	1
16	0,1	0,4	1,25x
12	0,2	0,3	1,67x
8	0,3	0,2	2,5x

Obserwacje i obliczenia:

Próba kontrolna:

A₅₄₀=0

Próba właściwa:

Stężenie enzymu [μg/ml]	A540 (próba 1)	A540 (próba 2)
20	0,449	0,488
16	0,395	0,395
12	0,263	0,254
8	0,157	0,163

• Obliczamy przyrost stężenia cukrów redukujących uwolnionych w różnym czasie reakcji analogicznie do pierwszego doświadczenia.

• Przykład dla próby 1 i stężenia 20 μg/ml

Stężenie enzymu [μg/ml]	[P] μmol c. r./ml (próba 1)	[P] μmol c. r./ml (próba 2)
20	4,939	5,368
16	4,345	4,345
12	2,893	2,794
8	1,727	1,793

Tabela pokazująca ilość powstającego produktu

• Dla próby 1 i stężenia 20 mg/ml

Stężenie enzymu [mg/ml]	V0 [μmol sacharozy/(ml·min)] (próba 1)	V0 [μmol sacharozy/(ml·min) (próba 2)
20	0,4939	0,5368
16	0,4345	0,4345
12	0,2893	0,2794
8	0,1727	0,1793

Tabela pokazująca szybkość początkową reakcji

Na podstawie powyższych wyników wykonano wykres [V₀]=f([E])

WnioskiZwiększenie stężenia enzymu powoduje liniowy wzrost szybkości reakcji. Spowodowane jest to większą szansą na utworzenie kompleksu enzym substrat. Szybkość reakcji rośnie do momentu aż w układzie znajdzie się Wiejec cząsteczek enzymu w porównaniu do cząsteczek substratu.