Biotechnologia ćwiczenia audytoryjne

Fitohormony

Hormonami roślinnymi określa się endogenne substancje organiczne transportowane w roślinie od miejsca wytworzenia do miejsca, gdzie ich niewielka ilość wywiera swoiste efekty fizjologiczne.
Warunkiem odpowiedzi (reakcji) komórki na sygnał (cząsteczkę hormonu) jest obecność w niej swoistego białka receptorowego, które wiąże dany hormon w sposób specyficzny i odwracalny.

Każdy regulator wzrostu i rozwoju ma szeroki zakres oddziaływania na rośliny, zależny od stężenia oraz współdziałania z innymi substancjami endo i egzogennymi.

Oddziaływanie to na eksplantanty roślinne in vitro można scharakteryzować następująco:

1. Te same regulatory roślinne mogą:
- oddziaływać różnie nie tylko na eksplantanty z grup oddalonych taksonomicznie, ale także na odmiany i klony tego samego gatunku,
- działać niejednakowo na eksplantanty z tej samej rośliny, ale pochodzące z różnych tkanek i organów,
- działać odmiennie nawet na eksplantanty z tej samej części rośliny jeśli pobrano je w różnych etapach rozwoju osobniczego.

2. Kolejne podanie odmiennych regulatorów daje odmienne efekty niż podanie ich równocześnie.

3. Wzrastająca koncentracja regulatora może wywołać nasilenie się jakiegoś efektu a po przekroczeniu progu ilościowego może spowodować zmianę efektu.

4. Różne regulatory, także z różnych grup, mogą powodować taką samą reakcję morfogenetyczną eksplantantów pobranych z różnych tkanek albo z roślin należących do różnych grup taksonomicznych.

5. Reakcja eksplantantu na regulatory roślinne jest w znacznym stopniu modyfikowana przez środowisko np. zawartości składników mineralnych i organicznych w pożywce, cech fizycznych pożywki składu atmosfery w naczyniu, temp czy oświetlenia.

6. Działanie regulatorów roślinnych zależy od wieku kultury, ponieważ wraz z liczbą pasaży zmienia się możliwości ekspozycji na regulator co jest wynikiem zmieniającej się ekspresji/represji niektórych genów lub akumulacji niektórych metabolitów.

7. Reakcja morfogenetyczna eksplantantu na regulator rozwoju następuje po różnym okresie, a długość okresu oczekiwania na reakcją jest zależna od stężenia i rodzaju regulatora, rodzaju eksplantantu jego początkowej wrażliwości i innych czynników.

8. Większość regulatorów rozwoju nie pozostaje w komórkach i tkankach w postaci, w jakiej została podana do pożywki, ale przynajmniej częściowo jest metabolizowana do form nieaktywnych fizjologicznie.

Do roślinnych regulatorów wzrostu i rozwoju stosowanych w kulturach in vitro nalezą następujące hormony: auksyny, cytokininy, gibereliny, kwas abscysynowy, etylen, brasinosterydy, salicylany (kw salicylowy), jasmoniany.

Kontrola wzrostu wegetacyjnego:
Auksyny, cytokininy, strigolatory, gibereliny, brasinosterydy

Kontrola reprodukcji:
etylen, kwas abscysynowy

Reakcje na stres:
salicylany, jasmoniany.

Interakcje fitohormonów

Auksyny
-syntetyzowane są przede wszystkim w młodych częściach roślin, wierzchołkowych pędów, młodych liściach i owocach.
- stymulują wzrost wydłużeniowy komórek, tworzenia korzeni, indukują powstawanie owoców, partenokarpu. Uczestniczą w regulacji dominacji wierzchołkowej.
- w kulturach in vitro auksyny inicjują przedziały komórkowe, w konsekwencji dochodzi, do wytworzenia kalusa, powodują również elongację komórek oraz stymulują tworzenie korzeni, a także indukują somatyczną embriogenezę,
- w kulturach in vitro wykorzystywane są zarówno auksyny naturalne jak i syntetyczne.
Auksyny wzory:
a) naturalne IAA – kwas indololo-3-octowy,
IBA – kwas indolilo-3-maslowy,
b) syntetyczne 2;4 D – 2,4-dichlorofenoksyoctowy
NAA – kwas alfa-naftylo-1-octowy
piktoram – kwas 4-amino-3,5,6-trichloropikolonowy (?)
dicamba – kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy.

Cytokininy
- miejscem syntezy cytokininy są wierzchołki korzeni, kambium, rozwijających się liściach, pakach, owocach oraz kiełkujące nasiona,
- stymulują podziały komórkowe i opóźniają starzenie oraz stymulują kiełkowanie nasion, powodują ustępowanie spoczynku pąków znoszą dominacją wierzchołkowa, hamują tworzenie i wzrost korzeni,
- w kulturach in vitro cytokininy wykorzystywane są w celu indukcji podziałów komórek, merystemów pędowych, znoszenie dominacji wierzchołkowej (co umożliwia wyrastanie pąków bocznych) zahamowanie tworzenia korzeni oraz opóźnienie procesów starzenia.

Tranz-zeatyna
2iP – 6 (yy dimetyloallioamino)-puryna – naturalna
BA – 6 benzoyloaminopuryna
PBA -
TDZ –

Decydujące znaczenie w realizacji kierunku rozwoju (pędów lub korzeni) ma proporcja pomiędzy zawartością auksyn i cytokinin.

Stężenie wysokie		Stężenie niskie
	← Wytworzenie korzeni przez sadzonki →
	← Somatyczna embriogeneza →
Auksyny	← Wytworzenie korzeni przez kalus →	Cytokininy
	← Inicjacja kalusa u roślin dwuliściennych →
	← Powstawanie pędów bocznych →
	← Namnażanie pędów bocznych →
Stężenie niskie		Stężenie wysokie

Gibereliny
- syntetyzowane w wierzchołkach korzeni rozwijają się w liściach, nasionach, owocach,
- działanie ich polega na stymulacji wzrostu wydłużeniowego umożliwiają uzyskanie normalnego wzrostu i pokroju karłowym mutantom. Uczestniczą również w regulacji ustępowania spoczynku nasion, indukcji kwitnienia roślin dnia długiego, stymulują rozwój kwiatów płci męskiej i niekiedy mogą wydłużyć powstawanie owoców partenokarpicznych.
- w kulturach in vitro są wykorzystywane rzadziej niż auksyny czy cytokininy. Stosowane w celu indukcji elongacji pędów lub przerwania spoczynku izolowania zarodków.
GA3 – kwas giberelinowy

Kwas abscysynowy (ABA)
- syntetyzowane w liściach, nasionach, korzeniach i owocach,
- indukuje spoczynek w pąkach i nasionach, hamuje kiełkowanie nasion, hakuje wzrost, indukuje zamykanie szparek, przyśpiesza proces starzenia oraz opadanie organów,
- w kulturach in vitro wykorzystywany jest do regulacji przebiegu somatycznej embriogenezy, umożliwia prawidłowe wykształcenie zarodków somatycznych, znalazł zastosowanie w inhibicji przedwczesnego kiełkowania ziaren i indukcji odpowiada na ich dehydratację.
ABA – kwas abscysynowy

Etylen (gaz)
- syntetyzowany w całej roślinie
- stymuluje ustępowanie spoczynku nasion i pąków, kiełkowanie nasion i zarodków, grzybów, hamuje wzrost padów, korzeni i liści oraz rozwoju pąków bocznych, stymuluje tworzenie korzeni przybyszowych, kwitnienie, dojrzewanie owoców, starzenie organów,
- w kulturach in vitro obserwuje się wpływ zarówno pozytywny ( np. stymulacja wzrostu tkanki kalusowej lub wzrost wydłużeniowego zwiększenia produkcji somatycznych zarodków) jak i negatywny (uprawa zamknięta), (zahamowanie wzrostu, zmniejszenie liczby wytworzonych zarodków, nieprawidłowy wzrost)

Brasinosteroidy
- wydłużenie komórek,
- wzrost łagiewki,
- kiełkowanie nasion,
- różnicowanie wiązek i włośników, tolerancja na stres.

Jasminiany
- odpowiedzi na patogeny nekrotyczne,
- obrona przed roślinożercami,
- produkcja indukowanych przez roślinożerców (w tym substancji ostrzegających inne rośliny i zwabiających drapieżne owady.

Regeneracja i rozwój rośliny w kulturach in vitro

Trotipotencja – zdolność do odtworzenia całej rośliny z pojedynczej komórki.

Każda żywa komórka nawet zróżnicowana, zawiera pełną informację genetyczną, która w odpowiednich warunkach może zostać uruchomiana i doprowadzić do regeneracji poszczególnych organów bądź całej rośliny. Warunkiem warunkującym trotipotencje jest pozbawienie komórki korelatywnego wpływu organizmu macierzystego. W praktyce polega to na wyizolowaniu i przeniesieniu komórek na pożywkę zawierającą odpowiednią kombinację roślinnych regulatorów wzrostu i rozwoju.

Kompetencja – zdolność komórki do odbierania sygnałów i reagowania na nie za pomocą odpowiedniego receptora.

Trotipotencje i kompetencja może ulec zmienia w trakcie trwania kultury in vitro.

Morfogeneza roślin in vitro –przekształceniom które prowadzą do powstawania wielokomórkowego organizmu wraz ze skomplikowanym układem tkanek i organów. Odbywa się w wyniku

1. Organogenezy – wytwarzanie określonych organów w kulturach in vitro obserwujemy
- organogenezę pędową ( pedogenezę)
- organogenezą korzeniową
Kierunek organogenezy – a więc to, czy powstają pędy czy korzenie – zależy od proporcji pomiędzy auksynami i cytokininami. Przewaga auksyn decyduje o tworzeniu korzeni przewaga cytokinin o tworzeniu pędów.

Organogeneza bezpośrednia – wytworzone organy bezpośrednia na eksplantancie

Eksplantant (komórka, komórka komplementarna) – organ

Organogeneza pośrednia – wytworzone organu jest poprzedzone przez stadium kalusa; organy powstają z tkanki kalusowej.

Eksplantant kalus (komórka, komórka o indukowanej komplementacji) organ.

Kalus – jest tkanką niejednorodną (niestabilną genetycznie) i nie wszystkie jego komórki mają jednakowe zdolności rozwojów. Pośrednia organogeneza nie daje jednorodności roślin.

Eksplantant pośredni
↓
odróżnicowanie komórek ( dedyferycjacja)
↓
kalus
↓
powtórne różnicowanie odmłodzonych komórek (redyferncjacja)
↓
tworzenie organów

2. Somatyczna embriogeneza – kierunek morfogenezy in vitro w którym z roślinnych komórek somatycznych formują się zarodki przybyszowe nie połączone wiązkami przewodzącymi z tkanką macierzystą, zarodki powstają z komórek które nie są produktem fuzji generatywnej.

Bezpośrednia – zarodki tworzą się bezpośrednio z komórek eksplantantu.

Eksplantant – zarodek

Pośrednia – w trakcie procesu występuje faza kalusa, tkanki, z której komórek regenerowane są zarodki

Eksplantant – kalus – zarodek.

Indukcja somatycznej embriogenezy zachodzi najczęściej pod wpływem auksyn.

Mikrorozmnażanie, mikropropagacja, klonowanie in vitro

Mikrorozmnażanie
- polega na wyłożeniu na pożywkę w warunkach in vitro eksplantantu z którego na drodze indukowanej morfogenezy uzyskujemy namnożone rośliny identyczne z tą od której pochodził eksplantant.

Przy wykorzystaniu tej metody należy uwzględnić:
- metoda musi gwarantować wysoki stopień identyczności genotypowej i fenotypowej (brak mutacji i długo utrzymujących się zmian epigenicznych)
- powinna być opłacalna w porównaniu z mnożeniem tradycyjnym.

Istnieją 3 sposoby mikrorozmnażania

1. Poprzez wyłożenie na pożywkę merystemów paków wierzchołkowych i/lub bocznych (pachwinowych, kątowych) znajdujących się na roślinie matecznej.
Wydajność tej metody zależy od liczby pąków, które u danego gatunku tworzą się na pędzie.
Zaletą metody jest jednolitość genetyczna roślin potomnych z rośliną mateczną (stabilność genetyczna), ponieważ w procesie morfogenezy nie uczestniczy tkanka kalusowa.

2. Poprzez indukowanie w kulturę pędów przybyszowych (tj. pędów których zaczątki w eksplantancie nie występowały) wyrastających bezpośrednio z eksplantantu lub kalusa na nim utworzonego.
W przypadku indukowania pędów przybyszowych powstają one często w kalusie(po kilku pasażach). U niektórych gatunków można je uzyskać bezpośrednio w wyniku podziałów komórek warstwy epidermalnej, które tworzą merystemy pądów a następnie pąki na fragmentach liści, cebul, łusek.
ten sposób mikrorozmnażania pozwala na otrzymanie liczby roślin (zależna od zdolności morfogenetycznych kalusa). Wadą jest możliwość występowania niestabilności genetycznej z powodu pośrednictwa kalusa oraz spadek zdolności do morfogenezy w miarę pasażowania.

3. Przez indukowanie, najczęściej na kalusie przybyszowych zarodków somatycznych.

Somatyczna embriogeneza przebiega w dwóch fazach

1. Indukcja – następuje pod wpływem auksyn powodujących odróżnicowanie komórek i ich podziały. Komórki potomne rozdzielają się ale tworzą zgrupowania zwane jako masa zarodkowa. Polega ona intensywnym podziałom nie zmieniając kierunku rozwojowego do czasu usunięcia auksyn z pożywki.

2. Różnicowanie – w masie zarodkowej przeniesionej na pożywkę bez auksyny następuje rozwój zarodków poprzez stadium globularne, sercowate, torpedy.
- dla prawidłowego kiełkowania zarodka powinny wykształcić funkcjonalne merystemy pędowe i korzeniowe co dokonuje się w procesie ich dojrzewania a sprzyjają temu zwiększona ilość sacharozy i dodatek ABA w pożywce.

Techniki mikrorozmnażania obejmuje następujące etapy:

1. Założenie i stabilizacja kultury
- dezynfekcja materiału roślinnego,
- wycinanie eksplantantu i wykładanie na pożywki,
- indukcja wzrostu pądów lub kalusa,
- etap kończy się z chwilą wytworzenia pądów lub kalusa zdolnych do organogenezy.

2. Namnażanie pędów
- celem jest uzyskanie pożądanej liczby pądów więc w zależności od wydajności, namnażanie polega na wykonaniu odpowiedniej ilości pasaży (może sterować najdłuższy okres ?)
- w zależności od gatunku, z nawet genotypu w składzie pożywki uwzględnia się cytokininy, auksyny i gibereliny.

3. Ukorzenianie
- pędy powstające w wyniku rozkrzewiana oddziela się od eksplantantu inicjalnego i przenosi na pożywkę stymulującą ukorzenianie co osiąga się najczęściej przez dodawanie auksyn (u niektórych gatunków ukorzenianie następuje pod koniec pasażu namnażania, stymulacja ukorzeniania zachodzi też pod wpływem retardantów, floroglucyralu, wit D, aminokwasów.

4. Adaptacja do warunków in vivo.
▪ Ponieważ rośliny z kultur in vitro charakteryzują się
- znacznym uwodnieniem tkanek,
- słabym zdrewnieniem,
- niecałkowicie wykształcona tkanką okrywającą
- niefunkcjonalnymi aparatami szparkowymi.
▪ Dlatego też są podatne na wysychanie i porażanie przez choroby i szkodniki.
▪ z tego powodu w okresie adaptacji należy je chronić przed wysychaniem o zakażeniem wykorzystując szklarnie, mnożarki, pokoje wzrostowe o ustalonych warunkach temperatury, światła i wilgotności.

Metody eliminowania wirusów

1. Kultury in vitro merystemów wierzchołkowych
Fragmenty merystemów (0,2 – 1,0 mm dł.) izoluje się z
- pąków wierzchołkowych lub bocznych,
- kultury merystemów indukuje się w pomieszczeniu o temp. 18 -22 st. C przy doświetlaniu światłem ciągłym stosują pasaże na świeżą pożywkę co 3-4 tygodnie. Duże znaczenie ma przygotowanie roślin do przeniesienia ze szkła do doniczki ( pasaż na pożywkę ukorzeniającą o zwiększonej zawartości auksyn, zmniejszonym stężeniu soli mineralnych oraz bez sacharozy) zabieg ten ułatwia roślinom podjęcie fotosyntezy i powrót do samożywności. Po czym otrzymujemy roślinę odpowiednia do wysadzenia na podłoże glebowe. Po przeprowadzeniu pierwszego testowania i wyeliminowania roślin podejrzanych o zawirusowanie otrzymujemy elitarny matecznik, który utrzymuje się w warunkach pełnego zabezpieczenia przed wtórną infekcją. Rośliny mateczne co trzy miesiące poddawane są regularnym kontrolom fitosanitarnym.

2. Chemioterapia
– Antymetabolity należą do związków o wysokiej aktywności przeciwwirusowej są to substancje włączające się w metabolizm wirusów i wywołujące zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusowego, hamując ich namnażanie się. Należy do nich analogi pirymidyn – uracyl, troiuracyl, bromuracyl oraz analogi puryn. Najczęściej są stosowane jako dodatki do pożywki dla kultury merystemów.
- Takie niektóre surfaktanty wykazują właściwości podobne do antymetabolitów np. DEMEB (białek dodecylo-N-metyloefedryny) i są stosowane jako dodatek to pożywki

3. Termoterapia
- Traktowanie eksplantantów wyłożonych na pożywkę (np. merystemów wierzchołkowych, pędowych czy kalusa) podwyższona temperaturą (36 st. C podczas dnia i 30 st. C w nocy przez 4-8 tygodni) eliminuje wiele wirusów nawet niektóre gatunki bakterii systemicznych zasiedlających tkanki przewodzące roślin.
-Warunki terapeutyczne dobiera się eksperymentalnie dla konkretnego gatunku rośliny rodzaju wirusa uwzględniając zakres temperatur tolerowanych przez roślinę; a jednocześnie mieszczących się pomiędzy optimum inaktywującym wirusa a maksimum tolerowanym jeszcze przez eksplantant,
- Termoterapia in vitro np. Vitis vinifera dały najlepsze rezultaty kiedy traktowano podwyższona temp. 36 st.C przez 6 tygodni ukorzenione rośliny. Niektóre świeżo izolowane merystemy bardzo źle znosiły ten zabieg zwłaszcza ze należało go powtórzyć 2x aby uzyskać całkowitą eliminacje wirusów.

4. Krioterapia
- Większość wirusów toleruje niska temperaturę podczas krioprezerwacji eksplantantów. Tylko niektóre grupy termolabilarnych wirusów roślinnych może być eliminowane przez mrożenie.
- Przykładem może być szaraka śliwy który eliminowano stosując metodę kombinowana czyli izolacje małych merystemów wierzchołkowych pędów (od 0,3 do 1mm) i krioterapia.
- Izolowane merystemy Prunus wyłożono na 24 godziny do pożywki zawierające 5% DMSO (dimetylosulfotlenek) i 2% proliny, po czym schłodzono do 4 st.C.
- Następnie przełożono je na 20 do 40min do mieszaniny krioprotektantow PVS2 (12% DMSO, 15% glikolu etylenowego, 25% glicerolu, 3% glikolu polietylenowego i 0,4% M-Sacharozy).
- Po prakulturach merystemy poddany powtórnemu schłodzeniu (-1st.C na 1min) i potem do temp 40st.C po czym zanurzono ich w ciekłym azocie -169st.C
- Następnego dnia merystemy odmrożono i wyłożono na pożywkę MS. Przeprowadzone po 4 miesiącach testowanie metoda PCR wykazało ze 54% roślin zostało uwolnionych od wirusa.