Biotechnologia jest to dziedzina jednocząca biologię molekuklarną cytologię genetykę biochemie i technologie chemiczną i ekonomię w celu uzyskania użytecznych fragmentów elementów struktur komórkowych i samych komórek

Podstawowe zastosowanie biotechnologii w rolnictwie: jest włączenie jej koprogramów hodowlanych.

Najczęściej stosuje się metody analizy DNA RNA lub białek jako markerów określonych cech wskazujących czy pożądana cecha znajduje się w analizowanym materiale czy nie . Można zastosować analizę DNA metodą RFLP markery powtórzeń sekwencji DNA analizę syntetyzowanych RNA oraz stosunkowo najstarszych metod analizę izoenzymów.

Techniki hodowli roślin:

Mikropropagacja produkcja wysokiej klasy ujednoliconych roślin.

Genetyka komórek somatycznych produkcja roślin haploidalnych i somatyczna hybrydyzacja- uzyskanie roślin haploidalnych z mikro i makrospor do celów hodowlanych.

Rośliny transgeniczne – odmiany niedojrzewających bananów pomidor o grubej skórce soja kukurydza odporne na śr ochrony roślin, ryż zawierający karoten.

Zachowanie bioróżnorodności arówno w aspekcie odmian i ras hodowlanych jak i w aspekcie biologicznym. (ochrona rzadkich gatunków).

Oczyszczanie środowiska wykorzystanie alg i roślin do absorpcji metali ciężkich rozwój tzw biofiltrów.

Sucha masa komórek komórki odwirowuje się z określonej objętości kultury i następnie się suszy do stałej wagi.

Pomiar absorbancji dokonuje się pomiaru absorbancji komórek w spektrofotometrze w świetle widzialnym. Zwykle absorbancja w świetle widzialnym jest proporcjonalna do Sm komórek najczęściej stosuje się światło o dł 600nm

Wilgotna masa odwirowuje się określoną objętość kultury i waży się masę osadu.

Liczba komórek wykonuje się to bepośrednio w hemocytometrach lub poprzez rozcięczenie i wysianie określonej objętości kultury na pożywkę i określenie liczby wyrosłych kolonii.

Pomiary fizyczne wzrost komórek jest z reguły związany z wytwarzaniem ciepła jego ilość jest proporcjonalna do stężenia biomas

Czynniki wpływające na prędkość wzrostu temp pH obecność substratów i hamowanie wzrostu produktami metabolizmu.

Mikroorganizmy arbitalne podzielono na 3 gr psychrofile o optym temp poniżej 20C, mezofile 20-40 termofile powyżej 40C. zwiększona prędkość wymierania w podwyższonych temp związana jest z termiczną denaturacją białek i w konsekwencji zwiększonym nakładem energii na mechanizmy naprawcze.

Wpływ pH: bakterie rozwijają się w zakresie 4-8 drożdżaki 3-6 pleśnie 3-7, wyższe eukarionty w zakresie 6,5-7,5 jest to tylko uogunienie bo niektóre bakterie wytrzymują tak nieskie pH jak 2 Lactobacilli.

Niektóre substraty są stymulatorami wzrostu w małych stężeniach ale stają się inhibitorami w większych fenole, formaldehyd, metanol max 10mM

Metabolity wtórne to produkty syntetyzowanie niezależne od wzrostu. Należą tu antybiotyki substancje przeciwnowotworowe.

Zanieczyszczenia pierwotne są to mikroorganizmy bytujące na roślinach w danej strefie geograficznej albo patogeny z innych roślin.

Zanieczyszczenia mikroorganizmami mogą się ujawniać w trakcie propagacji obniżając jej wydajność . mogą produkować toksyczne metabolity.

Zalety i wady mikropropagacji: możliwa produkcja miliona roślin z jednej w ciągu roku, Axenic- zapewnia że eksplant jest wolny od jakichkolwiek zanieczyszczeń tak więc otrzymane rośliny są także zanieczyszczone. Rozmnażanie przez klonowanie cena 0,14euro/plant

Metody mikropropagacji pochwa liściowa 95% całości micro propagacji, genetycznie stabilna, nieskomplikowana i powtarzalne. Formowanie pędów wydajny ale często nie stabilny. Somatyczna embriogeneza rzadko stosowana potencjalnie b.wydajna.

Wybór plantu pożądane właściwości : łatwa sterylizacja, młoda tkanka, dobra odpowiedz na kulturę, fragment łodygi, zawiązek liścia, nasiona Hypocotyl(z kiełkującej rośliny), liście.

Składniki które musisz dostarczyć ex plantowi: liście- cukier GA, Łodyga- auksyny i giberyliny, Korzenie- woda, witaminy, sole mineralne, cytokininy.

Składniki pożywki to: sole nieorganiczne, źródła węglowodanów, witaminy, woda, roślinne hormony (auksyny, cytokininy, GA`s), czynnik zestalający, niezdefiniowane składniki

Węglowodany rośliny w kulturze nie mają zwykle zdolności do fotosyntezy zwykle stos się sacharoze 2-3%. Niekiedy glukoze lub mieszanine glukozy i fruktozy. W wielkoskalowej prod stosuje się tańsze cukry syrop kukurydziany melasa.

Kultury fotoautotroficzne wzrost bez węgla wymaga wzmożonej fotosyntezy. Wysoka intensywność światła90-150uMOLE. Podwyższone stężenie co2 1000ppm norm 369.4ppm. zredukowane zakażenie ułatwia przeniesienie do szklarni.

Zawartość składników nieorganicznych szeroki zakres makro elementów i mikro. Pożywki przygotowane przez suszenie rozpyłowe. Najbardziej popularna Murashiego i Skoog Medium

Hormony roślinne Auksyny, cytokininy, Kwas Gibberelinowy GA, Etylen, Kwas Abscyzynowy,

Witaminy szeroki zakres witamin. Im mniejszy eklsplant większe wymagania zawartości witamin. Często używane- kwas nikotynowy, glicyna, tiamina, pirydoksyna. Inozytol w wysokich stężeniach 100mg/l

Auksyny absolutnie wymagane. Kwas indolilo 3 octowy, dużo analogów NAA, IBA, 2,4D; 2,4,5T Pichloram. Stymuluje wzrost korzeni. Syntetyzowane w merystemach głównie pędów i transportowane po roślinie.

Cytokininy abs wymagane. Hormon pojed zeatyna, analogi benzyladenine BA i Kinetin. Stymulują podziały kom. Wywołują formowanie pędów bocznych. Produkowane w merystemie korzeniowym i transportowane jako rybozy zeatyny we floemie.

Gibberyliny GA formują kwas giberelinowy. Handlowo dost GA3 i GA4+9, stymulują etiolowanie pędów. Ułatwiają uśpienie nasion i przerwanie wzrostu i pędów. Wytwarzanie młodych liści.

Etylen zaangażowanie na zranienia. Prod we wszystkich kom powoduje wzrost na dł i utratę liści. Ogranicza wzrost pędów bocznych, oddziaływuje z białkiem wiążącym etylen EBT w błonie kom. Wiąże AgNO3 albo norbordien do EBT albo norbornadien do EBP obniżając wpływ etylenu.

Kwas abscyzynowy ABA tylko naturalnie. Powoduje utratę liści i uśpienie nasion. Bierze udział w zamykaniu epidermy w odpowiedzi na stres wodny. Istotny w przygotowaniu zarodka do wysuszenia. Pomaga w tworzeniu normalnego nasiona.

Roślinne regulatory wzrostu poliamidy istotna rola w rozwoju zarodka. Kwas Jasmonowy- odpowiedz na zranienie. Kwas salicynowy. Nie są uznawane za hormony roślin działają w wysokich stężeniach.

Suplementy niezdefiniowane źródła hormonów witamin i poliamid. Mleczko kokosowe, ekstrakt z kukurydzy cukrowej, nie powtarzalne, pracują.

Stadium I mikropropagacji sterylizacja zabiegi wstępne w celu przygotowania ex plantu, detergenty, sterylizacja i antybiotyk. Zabiegi wstępne to : transfer rośliny do szklarni w celu zredukowania skażenia, wspomaganie pędów bocznych, przemycie usuwające powierzchniowe skażenie.

Zast detergentów: pęcherzyki powietrza na powierzchni eksplantu mogą chronieć bakterie i grzyby przed roztworem sterylizującym. Mieszanie może zredukować liczby bąbelków powietrza. Detergenty redukują napięcie powierzchniowe woskowej kutykuli umożliwiając zwilżenie powierzchni liścia

Czynniki sterylizujące powierzchnię ex plantu utlenianie, aktywne chlorowce, zatrucie metalami ciężkimi. Silne chemikalia mogą być użyte do sterylizacji nasion. Niebezpieczeństwo że zabijając zanieczyszczenia zabijemy ex plant, powierzchnia ex planu musi być natychmiast chroniona.

Antybiotyki są rzadko stosowane wiele jest bakterio statykami i mogą niekiedy wywoływać wadliwy wzrost kultury po ich usunięciu nie ma fungicydów dla których istnieje pewność że są nieszkodliwe.

Stadium II namnażanie wykonać cięcie w węźle. Usuwa to hamujący wzrost wpływ szczytuu pędu na wzrost pączka. GA`s bmoże być użyty w celu etiolacji jeśli gat formułuje rozete. Cytokininy mogą być użyte w celu zwiększenia wzrostu pączka . Jest to czynność pracochłonna.

Stadium III i IV ukorzenianie i przeniesienie do szklarni. Roślina musi wytworzyć korzenie przez kulturę na pożywce lub zanurzeniu w roztworze auksyn. Następnie zahartować roślinę przez wzrost intensywności światła redukcję ilości cukru soli nieorganicznych i wilgotności. Usunięcie pożywki przed przeniesieniem w celu zapobiegania zakażeniu.

Czystość produkcji roślin patogen obniżający wydajność istnieją ścisłe przepisy fitosanitarne dot importu roślin. Wirusy i bakterie mogą rozwijać się razem z ex plantem muszą zostać usunięte przed namnażaniem.

Drogi eliminacji wirusów traktowanie ciepłem rośliny rosną szybciej w wyższych temp. Tworzenie merystemów- wirusy transportowane z kom przez komórkę wierzchołki często wolne od wirusów walka infekcji z rozwojem. Nie wszystkie kom są zainfekowane pędy boczne z pojedyńczych komórek mogą- roślina wolna od wirusów.

Zalety i wady produkcji zalety: możliwość manipulacji śr. Wyboru prokursora, możliwa selekcja kultury, możl uzyskanie wszystkich kom w kulturze. Możliwość ciągłej ekstrakcji. Można odzyskać biomasę. WADA wysoki koszt, zainfekowanie, mała prod wewnętrzna

Koszt produkcji kom roślinne wolno rosną, zawart wody 90-95%, łatwe zakażenie, wrażliwość mechaniczna wymusza modyfikację bioreaktorów, koszt do 20Euro/kg

System roślinnych kultur kom: zorganizowane tkanki(kulura pędów, włośnikowych korzeni, zarodków). Niezorganizowane (kalus, zawiesina kom)

Kultury pędów duża ilość pędów jest tworzona przy dużym stężeniu cytokinin, wyższa wydajność dla produktów potrzebujących światło, wrażliwe pękają. Problem z oświetleniem na większą skale.

Kultury korzeni włośnikowych powstają po zakażeniu sterylnej rośliny Agrobacteriumk rhizogenes, geny syntezy auksyn i wrażliwości są wprowadzone do roślin prowadząc do niewrażliwej masy korzeni. Użyteczne przy prod masy korzeniowej. Przy zwiększonej skali prod agregacja i wrażliwość.

Biosynteza zaroków zarodki somatyczne prod z tkanki liściowej i zygotycznych embrionów. Prod w celu mikropropagacji. Problem- wrażliwość. Dojrzewanie w cieczy niezwykle trudne technicznie.

Produkcja szikoniny w kulturze szikonina inhibitor telomerazy zapobiega rozwojowi AIDS. Jest produkowana przez całe rośliny- alkanna lithosperumum. Wprowadzone do kultury i produkowana w bioreaktorze.

Kalus równopolowe stężenie auksyn i cytokinin stymulują podziały kom. Co powoduje powstanie masy nieurbanizowanych kom tzw kalusa. Wymaga określonej struktury organiczają wzrost skali prod. Np. saponiny z żenszenia.

Kultury zawiesinowe hodowany w mieszanej pożywce ma tendencje do rozpadu , zawiesina łątwiejsza w operacjach, duża skala prod bioreaktorów do prod szikoniny i berberysy.

Wprowadzenie kalusa do kultury zawiesinowej luźny kalus można przeprowadzić w zawiesinę , usunięcie dużych agregatów na sitach, wzrost pojedyńczych kom lub małych agregatów na płytkach

Charakterystyka komórek roślinnych duże 10-100uM tworzą agregaty, wrażliwe, wolno rosną, łatwo zakazić, małe wymagania tlenu. Mogą nie tolerować watunków tlenowych, rosnąć do wysokiej gęstości 300g/l świeżej masy, mogą tworzyć lepkie roztwory

Bioreaktory do zawiesinowych kultur roślinnych tank ze zmodyfikowanym mieszadłem, powietrze wznoszące, pętla powietrzna, kolumna pęcherzyków, reaktor z rotacyjnym bębnem( jak pralka, małe pękanie komórek, łatwość zmiany skali)

Drogi zwiększenia wydajności selekcja, start z optymalnym fragmentem rośliny. Modyfikacja pożywki dla wzrost i produkcji. Prekursory i produkty pośrednie, produkcja w warunkach imitujących normalne.

Selekcja na poziomie całej rośliny, w kulturze (poj komórka przedmiotem selekcji, analiza do mil kom na płytce petriego, progresywna seekcja we wszystkich fazach.)

Strategia selekcji pozytywna negatywna wzrokowa analityczny przesiew.

Selekcja pozytywna dodać skł toksyczny np. kanamycin, wyrosną kom odporne na toksynę i dadzą kolonie w jej obecności. Wybrać kolonie rosnące, możl selekcji 1mln koloni w 1 dzień , wymaga d. ciśnienia selekcyjnego

Selekcja negatywna dodać cytostatyk np. BUdR chlorany. Wysiej na płytkę na odp czas, odmyj cytostatyk i przenieś na płytkę z czynnikiem wzrostowym.zginą kom rosnące na cytostatyku nie rosnące zaczną się rozwijać. Użyteczna w selekcji autotrofów

Selekcja wizualna użyteczna z barwnikiem lub czynnikami fluorescencyjnymi. 50tyś kom na płytkę. Dodać czynnika barwiącego lub fluoro. Można test milon kom dziennie

Przesiew analityczny kalus podz na 2cz. Założyć subkulturę z jednej cz. Jedną cz ekstrahuj i oznacz zaw składnika analitycznie HPLC/GCMS/ELISA. Metoda pracochłonna 200prób/dzień

Uprawa molekularna przeciwciała molekularne. Albumina serum krwi ludzkiej. Interleukiny. Szczepionki, odnowienie źródła tworzyw sztucznych. Neurotransmiter 50mg/kg enkefaliny w oleju rzepakowym. Modyfikacja oleju w celu poprawy FAME. Prod enzymów doustnych szczepionek i przeciwciał.

Szlaki interesujące hodowców roślin wysoka produktywność nasion. Wys wydajność plonów. Wys wartość żywieniowa. Adaptacja do uprawy z innymi roślinami.Asymilacja azotu. Wytrzymałość suszy na śr ochrony roślin, dost do mechanicznej uprawy. Odpowiedni feto period. Eliminacja toksyn.

Transformacja genetyczna roślin przegląd wymagań do transformacji. Rozwój żywności GM. Geny do upraw. Zysk upraw GM. Sposób wprowadzenia genów do kom. Regeneracja całej rośliny z jednej kom transformowanej.

Wymagania podczas transformacji genetycznej roślin szlak powinien być zależny od jednego genu. Wymagania do świadomej ekspresj genu (promotory i terminatory). Wymagania do wprowadzenia genu do kom.sposób selekcji transformatorów.. sposoby uzyskania całej transformowanej rośliny (regeneracja)

Geny wprowadzone do roślin odporności na herbicydy, owady, nasiona, wirusy, grzyby, opóźnione dojrzewanie, mrozoodporność, odporność na suszę, wysokoskrobiowe ziemniaki, oleje, tworzywa sztuczne, białka trawienne, przeciwciała.

Geny odporności na szkodniki inhibitory proteaz, lektyna, białka inhibitory rybosomów. Grzyby chitynazy i B-1,3 glukanazy, RIPs, Tioniny białka przeciwgrzybowe

Poprawione wł pożniwne do 50% żywności w Afryce traci się przy zbiorach. Kontrola dojrzewania. Aglutynina zarodków pszennych. Flavsevr pomidor zawierający antysensowna sekwencję do poligalaturonazy- zmiękcza pomidora przez rozpuszczenie ściany kom.

Inne użyteczne modyfikacje poprawa wł rolnicze. Poprawa hodowli roślin, poprawa wł żywieniowych.

Cechy GMO dopuszczone do uprawy męska sterylność. Modyfikacja kw tł. Kolor kwiatów. Czas kwitnienia. Opóźnione dojrzewanie odporność na wirusy.

Systemy wprowadzenia genu nagi DNA ściana komórkowa pierwszą przeszkodą dla DNA. Biobalistyka. Włókna SiC, protoplasty, elektroporacja, pyłki. Wektory Agrobacterium- wirus.

Wprowadzenie genu do komórek (wektory) agrobacterium naturalny genetyczny wywołuje tumor Galla. B wydajny w transformacji 2liściennych. Strzelba cząsteczkowa pracuje. Brak pozostałości Agrobacterium. Można użyć do testu różnych DNA i jego funkcji

Tranformacja z Agrobacterium zawiera on plazmid Ti przenoszący wybrane geny. Hodowla Agrobac z rośliną przenosi DNA

Ko integracyjny wektor wymaga genów które są przeniesione z bakterii do plazmidu przez homologiczną rekombinację dla podwójnych wektorów plazmid zawira t DNA zdolne do replikacji w e.coli i może być przeniesiony do Agrobact przez trzeciorzędowe krzyżowanie z udziałem pomocniczego szczepu e.coli. to ułatwia proces konsrykcji plazmidu.