Chromatografia:

• Technika analityczna lub preparatywna

• Służy do selekcji składników w układzie kilkufazowym

• Najpierw następuje rozdział składników badanej mieszaniny, a następnie wykrywanie poszczególnych składników

• Składniki badanego roztworu możemy rozdzielić przepuszczając go przez fazę nieruchomą.

• Składniki badanej mieszaniny są zatrzymywane z różną prędkością, dzięki czemu możemy je od siebie oddzielić.

Podstawowe pojęcia:

• Eluent – ciecz służąca do elucji, ciecz wymywająca.

• Elucja – in. wymywanie, proces usuwania z nośnika związków, zatrzymanych na nim w wyniku adsorpcji lub wymiany jonowej

• Adsorpcja – wiązanie cząsteczek, atomów lub jonów na granicy fazy ruchomej i nieruchomej.

• Faza – jednorodna część układu oddzielona od innych granicami fizycznymi, może być ruchoma lub nieruchoma.

• Chromatogram – wynik rozdziału składników mieszaniny ośrodku porowatym w postaci obrazu barwnych pasm lub plam.

• Całkowity czas retencji – ilość czasu potrzebnego do przejścia przez całą długość fazy rozdzielczej określonego składnika analizowanej mieszaniny.

• Adsorpcja – zagęszczenie się cząstek gazów, par, cieczy oraz cząsteczek ciał stałych rozpuszczonych na powierzchni granicznej fazy ruchomej i niruchomej

Podział chromatografii:

W zależności od czynnika wywołującego zróżnicowanie szybkości migracji poszczególnych składników:

• Chromatografia przepływowa –przepuszczenie roztworu badanej mieszaniny przez fazę nieruchomą. Dzięki oddziaływaniu międzycząsteczkowym jedne składniki substancji przechodzą przez złoże szybciej, inne wolniej.

• Elektrochromatografia – kombinacja elektroforezy i chromatografii. Ruch cząsteczek jest wynikiem równoczesnego lub naprzemiennego działania mechanicznego przepływu rozpuszczalnika oraz sił elektrycznych

Podział chromatografii:

Ze względu na siły fizyczne odgrywające role w rozdziale substancji między fazę ruchomą i nieruchomą:

• Adsorpcyjna – rozdział składników jest uwarunkowany różnicami w siłach adsorpcji poszczególnych składników.

• Jonowymienna – rozdział składników jest spowodowany różnymi ładunkami jonów

• Podziałowa – zjawiskiem decydującym o przebiegu procesu jest zjawisko podziału substancji między dwie ciekłe, nie mieszające się fazy.

• Osadowa - rozdział odbywa się na podstawie różnic w szybkości powstawania osadów oraz różnic w ich trwałości

• Powinowactwa - stosowana jest do rozdziału białek ze względu na ich duże powinowactwo do specyficznych ligandów, które związane są z nierozpuszczalnym złożem.

Podział chromatografii:

Ze względu na technikę rozdziału:

• Kolumnowa – rozdzielenie substancji poprzez przepływ badanego roztworu przez kolumnę, wymuszany grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wylocie w wlocie kolumny.

• Bibułowa - fazę rozdzielczą stanowi specjalna bibuła. Podstawą działania jest podział substancji rozdzielanych między fazę ruchomą i nieruchomą. Gdy współczynniki podziału składników badanej substancji są różne, następuje ich rozdzielenie w trakcie przemieszczania się po bibule.

• Żelowa - stosowana jest do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową lub do oddzielania białek od składników niskocząsteczkowych

• Cienkowarstwowa - fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa fazy stałej naniesiona na sztywną płytkę. Na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny.

Podział chromatografii:

W zależności od parametrów procesu:

• HPLC

• FPLC

• UPLC

• GPC

Metody stosowane w chromatografii:

• Metoda analizy czołowej – roztwór badany przesącza się przez kolumnę , następuje zróżnicowanie prędkości przepływania poszczególnych składników mieszaniny. Największą prędkość osiąga składnik o najmniejszym powinowactwie do fazy nieruchomej, stanowi pasmo pierwsze od dołu kolumny i jedyne możliwe do uzyskania w stanie czystym. Pozostałe pasma powstałe nad nim są mieszaniną dwóch lub kilku składników. Metoda ta pozwala jedynie na określenie ilości składników, z których składa się mieszanina i otrzymanie w stanie czystym jednego – najsłabiej adsorbowanego.

• Metoda wypierania – in. metoda rugowania, niewielką objętość badanej mieszaniny umieszcza się na wierzchołku kolumny, a następnie przemywa się kolumnę roztworem zawierającym kilka składników o różnych właściwościach wypierających, w celu odsunięcia od siebie pasm poszczególnych substancji. Składniki o właściwościach wypierających muszą wykazywać silniejsze zdolności adsorbcyjne niż składniki badanego roztworu. Metoda ta ma swoje zastosowanie przy rozdzielaniu substancji o odwracalnej adsorbcji

• Metoda wymywania – in. elucyjna, zachodzi w dwóch etapach: niewielką objętość badanej mieszaniny umieszcza się na szczycie kolumny, a następnie przemywa kolumnę czystym rozpuszczalnikiem, lub z dodatkiem substancji powierzchniowo czynnej w celu rozwinięcia chromatogramu. Substancja o większej zdolności adsorbowania się przesuwa się wzdłuż kolumny wolniej, niż substancja dobrze adsorbowana. W oddzielnych odbieralnikach zbiera się poszczególne frakcje badanego roztworu.

Obserwacja procesu chromatografii:

Rozdział substancji barwnych można obserwować bezpośrednio na bezbarwnym adsorbencie. Do zaobserwowania rozdziału substancji bezbarwnych stosuje się chromatogramy.

Chromatogramy:

• Chromatogram stały – używając tego chromatogramu należy przeprowadzić związku bezbarwne w barwne, np. poprzez spryskanie lub powleczenie kolumny odczynnikiem dającym barwne połączenia (np. substancje fluoryzujące)

• Chromatogram ciekły – badamy stężenie substancji w wycieku poprzez pomiar zmian absorpcji światła, współczynnika załamania światła, zmian potencjału elektrycznego, zmian przewodnictwa natężenia prądu płynącego przez badany roztwór, zmian pH, radioaktywności

Chromatografia adsorpcyjna:

Chromatografia adsorpcyjna do rozdzielenia składników mieszaniny biologicznej wykorzystuje zjawisko adsorpcji.

ADSORPCJA jest uwarunkowana siłami przyciągania między cząsteczkami adsorbatu i adsorbentu.

Adsorbat – substancja zatrzymywana na powierzchni adsorbentu.

Adsorbent – ciało stałe, na którym zachodzi proces adsorpcji.

Jeżeli energia własna cząsteczek adsorbatu przewyższa siły przyciągania z cząsteczkami adsorbentu, wówczas dochodzi do zjawiska DESORPCJI.

Czas potrzebny do ustalenia się równowagi jest:

• krótszy w przypadku małych cząsteczek

• dłuższy w przypadku makrocząsteczek.

Cechy „idealnego” adsorbentu:

• selektywność i specyficzność działania,

• odpowiednia pojemność adsorpcyjna,

• brak reakcji z adsorbantem,

• brak rozpuszczalności w solwencie,

• struktura porowata,

• odpowiednia wilgotność,

• produkcja adsorbentu jest znormalizowana.

Podział adsorbentów:

1. naturę chemiczną: nieorganiczne, org., mieszane, specyficzne

2. charakter chemiczny: kwasowe, zasadowe, amfoteryczne, obojętne

3. pojemność adsorpcyjną: silne, średnie, słabe

4. polarność: silne, słabe, niepolarne

Rozpuszczalniki stosowane w chromatografii adsorpcyjnej

• Węglowodory – eter naftowy, toluen, benzen,

• Pochodne chlorowcowe – czterochlorek węgla, chloroform,

• Etery – eter etylowy,

• Alkohole – etylowy lub metylowy,

• Woda,

• Zasady organiczne – pirydyna,

• Mieszaniny kwasów i zasad z wodą, alkoholem i pirydyną.

Rozpuszczalniki:

1. Obecność wody:

1. Bezwodne,

2. Nasycone woda

1. Obecność obcych substancji:

1. Czyste,

2. Z domieszką innych substancji.

Szybkość przepływu rozpuszczalnika

1. Za szybko

1. Brak czasu na ustalenie się równowagi adsorpcja – desorpcja

2. Zatarcie się granic czoła poszczególnych składników mieszaniny

1. Za wolno

1. Substancja o większym stężeniu przepływa ze swojego pasma do pasma substancji o mniejszym stężeniu,

2. Zatarcie się granic czoła poszczególnych składników mieszaniny.

Powinowactwo adsorpcyjne jest zależne od:

1. Budowy i wielkości cząsteczek adsorbatu,

2. Liczby i rozmieszczenia wiązań podwójnych w cząsteczce,

3. Liczby i rozmieszczenia grup polarnych i niepolarnych w cząsteczce,

4. Charakterystyki grup polarnych w cząsteczce.

REGUŁA:

Im większa polarność adsorbatu, tym większa adsorpcja na polarnym adsorbencie z niepolarnego solwentu.

Im mniejsza polarność adsorbatu, tym większa adsorpcja na niepolarnym adsorbencie z polarnego solwentu.

Schemat Brockmanna:

REGUŁA: Aktywność adsorbentu i solwentu jest taka sama.

Zastosowanie( rozdział):

1. Barwników roślinnych,

2. Barwników żółciowych,

3. Steroidów,

4. Porfiryn.

Chromatografia Jonowymienna:

Jest to jedna z technik cieczowej chromatografii kolumnowej. Polega ona na wymianie wszystkich zdolnych do wymiany jonów jonitu, na inne jony o tym samym ładunku, zawarte w roztworze.

Jonity:

1. Są to ciała stałe nierozpuszczalne w wodzie i najczęściej stosowanych rozpuszczalnikach organicznych, które mają właściwości wymiany jonów. Wyodrębnia się w nich matrycę, grupy funkcyjne oraz przeciwjony. Rodzaj grupy funkcyjnej decyduje o charakterze reakcji wymiany.

2. W zależności od tego jakie jony wiąże wymieniacz jonowy, wyróżniamy:

• Kationity

• Anionity

Kationity:

Są to wymieniacze jonowe o charakterze kwasów bądź ich soli, wymieniające z roztworem kationy. Można je rozpatrywać jako wielowartościowe aniony z dodatnio naładowanymi przeciwjonami albo jak wielkocząsteczkowe kwasy lub sole tych kwasów.

Anionity:

Są to wymieniacze jonowe o charakterze zasad bądź ich soli, wymieniające z roztworem aniony. Stanowią wielowartościowe kationy z ujemnie naładowanymi przeciw jonami lub wielkocząsteczkowe zasady albo sole tych zasad.

Pojemność wymienna:

Jest to ilość jonów, która może być wymieniona przez jednostkę masy lub objętości jonitu. Oznacza się ją w molach na 1 kg lub w milimolach na 1 g wymieniacza.

Cykl jonitacyjny:

1 etap:

Pierwszym etapem jest proces sorpcji. Na początku wymieniacz zawiera tylko jeden rodzaj jonów podlegających wymianie ( np. –SO3⁻H⁺). Roztwór przepuszczany przez kolumnę może zawierać jeden lub kilka jonów wymiennych. Po przemyciu kolumny wodą jonit zawiera jony wymienione z roztworem i pewną część jonów uprzednio obecnych w wymieniaczu.

2 etap:

W tym etapie następuje regeneracja jonitu, czyli elucja. Przez kolumnę przepuszcza się nadmiar roztworu elektrolitu, który zawiera jeden jon wymienny o większym powinowactwie do złoża jonitu, niż jon wprowadzony w procesie sorpcji. Po przemyciu kolumny wodą jonit jest gotowy do następnego cyklu jonitacyjnego.

Czynniki wpływające na proces wymiany:

Na przejście jonów z roztworu do jonitu i z jonitu do roztworu mają wpływ głównie:

• Budowa wymieniacza

• Ilość i rodzaj grup funkcyjnych jonitu

Klasyfikacja jonitów:

Ze względu na naturę chemiczną wyróżniamy:

• Jonity nieorganiczne

• Jonity organiczne

• naturalne

• Półsyntetyczne:

Należą do nich wymieniacze jonowe pochodzenia naturalnego poddane pewnym przemianom chemicznym w celu zwiększenia ich zdolności wymiennej, wprowadzeniu dodatkowych grup funkcyjnych oraz usunięciu z nich substancji przeszkadzających w wymianie jonowej. Zaliczamy do nich głównie pochodne celulozy ( np. anionit DEAE-celulozę).

• Syntetyczne:

Są to najbardziej wartościowe wymieniacze jonowe ze względu na nierozpuszczalność w wodzie, a także w niektórych rozpuszczalnikach organicznych, dużą trwałość chemiczną i mechaniczną, dużą i wybiórczą zdolność wymienną. Stanowią one twarde, bezpostaciowe, nierozpuszczalne żele o usieciowanej porowatej strukturze.

Zalety i wady chromatografii jonowymiennej:

Zalety:

• Wysoka rozdzielczość i selektywność

• Duża pojemność kolumny

• Możliwość stosowania próbek o bardzo niskiej koncentracji separowanych makromolekuł

Wady:

• Konieczność stosowania próbek w roztworze o niskiej sile jonowej i dokładnie określonej wartości pH

• Rozdzielone molekuły wymywane są zwykle w eluencie o wysokiej zawartości soli, którą trzeba później usunąć innymi technikami

Chromatografia powinowactwa:

:

Chromatografia powinowactwa w wielu procesach biotechnologicznych

• Pozwala wyizolować substancje i uzyskać najwyższy stopień jej czystości

• Jest szczególnym przykładem chromatografii adsorpcyjnej

• Wykorzystuje zdolność do specyficznegon wiązania się dwóch substancji

• Chromatografia powinowactwa może być również z powodzeniem stosowana do oczyszczania preparatu z pewnych substancji np. oczyszczenie preparatu fibrynogenu z fibronektyny i plazminogenu

• Chromatografia podziałowa jest oparta na podziale solutu (substancji rozpuszczonej) pomiędzy dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe, z których jedna jest ruchoma i jest to najczęściej rozpuszczalnik organiczny, a druga jest osadzona na porowatym nośniku (kolumna lub bibuła), zazwyczaj jest to woda.

• O rozdziale substancji decydują różnice w ich rozpuszczalności w fazie ruchomej i nieruchomej, a tym samym różnice we współczynnikach podziału tych substancji między dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe.

Oddziaływanie to ma charakter wiązania:

• hormon - receptor

• enzym - substrat

• antygen - przeciwciała

• komplementarne odcinki kwasów nukleinowych

• kwasy nukleinowe – białko

Etapy chromatografii powinowactwa:

1. immobilizacja ligandu – unieruchomienie ligandu na powierzchni nośnika

2. powstanie specyficznego wiązania miedzy ligandem i substratem oraz wymycie niespecyficznie zaadsorbowanych cząsteczek

3. elucja substancji związanej z ligandem

Nośniki w chromatografii powinowactwa:

• stosuje się nośniki standardowe w przypadku filtracji żelowej przy czym musza być specyficznie aktywowane

• pochodne dekstranu, agarozy, poliakrylamidu

Podział:

Chromatografia kowalencyjna:
Umożliwia selekcję substancji z grupami tiolowymi. Miedzy grupami tiolowymi nisnika i substancji tworzy się spontanicznie odwracalne wiązanie.

Chromatografia chelatująca:
Nośnik tworzy odwracalne wiązanie z jonami metali. Jony mera tli mogą z kolei na swej powierzchni adsorbować białka i peptydy. Nośnik zawierają ligant chelatujący jony metali.

Prawo podziału solutu:

Prawo Nernsta :

W układzie utworzonym przez dwie niemieszające się ze sobą fazy ciekłe i wspólny dla nich solut, stosunek stężenia tego solutu w fazie 1 (c₁) do jego stężenia w fazie 2 (c₂) jest w stanie równowagi wielkością stałą, zależną tylko od temperatury i właściwości substancji tworzących roztwory, a niezależną od ilości substancji rozpuszczonej.

Współczynnik podziału K:

Wartość współczynnika podziału k nie zależy od ilości substancji rozpuszczonej w przypadku układów doskonałych, do których zbliżają się roztwory rozcieńczone.

Stosunek podziału K:

Wyrażenie stężenie solutu, który ulega podziałowi nie w molach, a w gramach na jednostkę objętości pozwala uwzględnić wszystkie rodzaje cząsteczek niezależnie od stanu ich agregacji. Uzyskana w ten sposób wartość różni się od wartości współczynnika podziału i nosi nazwę stosunek podziału K.

Stopień rozdziału:

Jest to miara selektywności rozdziału dwóch substancji A i B w danym układzie:

Rozpuszczalność:

Rozpuszczalność substancji w jednej i drugiej fazie ma decydujący wpływ na stosunek podziału między te dwie fazy. Sprowadza się ona do wzajemnego oddziaływania cząsteczek solwentu i solutu i zależy od ich natury chemicznej, wielkości i budowy.

Rodzaje chromatografii podziałowej:

1. chromatografia podziałowa kolumnowa

2. chromatografia podziałowa bibułowa

• jednowymiarowa

• dwuwymiarowa

ilościowa

Ch. P. kolumnowa:

- Ogranicza się tylko do tych substancji, które wykazują umiarkowaną rozpuszczalność w wodzie.

- Ma mniejsze znaczenie niż chromatografia podziałowa na bibule oraz jonowymienna.

Ch. P. Bibułowa:

Zalety chromatografii bibułowej:

- prostota techniki, aparatury, sprzętu,

- możliwość rozdzielania i wykrywania składników mieszanin, których odseparowanie stosowanymi dotychczas metodami było żmudne i zbyt długotrwałe,

- możliwość przeprowadzania mikroanaliz.

Chromatografia (podział):

Z uwagi na kierunek migracji fazy ruchomej w bibule:

- jednowymiarową,

- dwuwymiarową.

Ze względu na kształt bibuły wyróżnia się chromatografię:

- arkuszową,

- krążkową,

- paskową.

Ch. Bibułowa jednowymiarowa:

W zależności od kierunku przepływu rozpuszczalnika przez bibułę wyróżniamy technikę:

• zstępującą (spływową),

• wstępującą (wstępowania kapilarnego),

• krążkową.

Technika zastępująca:

Polega na zanurzeniu bibuły (w postaci pasków lub arkusza) w wanience z rozpuszczalnikiem umieszczonej w górnej części komory. Rozpuszczalnik spływa w dół głównie dzięki sile ciężkości i powoduje, że substancje nakroplone n a linii startu rozdzielają się między fazę ruchomą i nieruchomą.

Technika wstępująca:

Przeprowadza się ją na paskach oraz arkuszach bibuły zawieszonej płasko lub zwiniętych w cylinder. Rozpuszczalnik znajdujący się w zbiorniku na dnie komory wznosi się do góry głównie na skutek właściwości kapilarnych bibuły. W metodzie tej potrzeba zazwyczaj krótszego czasu na rozwinięcie chromatogramu. Rozpuszczalnik osiąga wysokość nie przekraczającą ok. 20 cm. Rozdzielane substancje musza się różnić dość znacznie prędkością wędrówki, żeby uległy wyraźnemu rozdziałowi na krótszej drodze.

Technika ta nadaje się szczególnie do prób orientacyjnych, zwłaszcza w komorach probówkowych.

Technika krążkowa:

Pozwala uzyskać wyraźne i ostre rozdziały w krótkim czasie, bez użycia skomplikowanej aparatury i ze znaczną oszczędnością bibuły oraz miejsca.

Na krążku bibuły nanosi się roztwory badane na obwodzie współśrodkowego pierścienia o niewielkim promieniu. Rozpuszczalnik wędruje po bibule poziomo w kierunku odśrodkowym, powodując rozdzielanie składników pod postacią współśrodkowych pierścieni.

Ch. Bibułowa dwuwymiarowa:

Polega na poddawaniu mieszaniny substancji kolejnemu działaniu dwóch różnych systemów rozpuszczalników w dwu kierunkach prostopadłych:

• zstępująco – zstępującym,

• wstępująco – wstępującym,

• zstępująco – wstępującym,

• wstępująco – zstępującym.

Ch. Bibułowa ilościowa:

Wyróżnia się 2 typy ilościowego oznaczania zawartości substancji w wywoływanym chromatogramie:

• bezpośrednie,

• przez elucję (proces wymywania za pomocą fazy ruchomej substancji zaabsorbowanej wcześniej na fazie stałej).

Współczynnik Rf:

Współczynnik przepływu w chromatografii bibułowej wyraża stosunek prędkości migracji czoła pasma do prędkości wędrówki czoła rozpuszczalnika:

Wartość R_f jest wielkością stałą dla danego składnika, systemu rozpuszczalnika i stałych warunków doświadczenia oraz charakterystyczną dla poszczególnych substancji.

Zależy ona od:

• gatunku, czystości i stopnia uwodnienia bibuły,

• temperatury,

• stanu nasycenia komory i bibuły,

• ilości i wieku rozpuszczalników,

• czasu i drogi przepływu,

• odległości punktu startu od powierzchni fazy ruchomej.

Chromatografia cienkowarstwowa:

- U podstaw leżą te same procesy, które decydują o pomyślnym rozdzieleniu substancji innymi metodami chromatograficznymi.

Są to procesy:

• odwracalnej adsorpcji fizycznej,

• wymiany jonowej,

• rozdziału substancji między dwie fazy ciekłe.

- Najczęściej zachodzi kombinacja wszystkich trzech zjawisk, z przewagą jednego lub drugiego.

- Po rozpatrzeniu różnic strukturalnych związków wchodzących w skład badanej mieszaniny możemy dokonać właściwego wyboru jednej z wymienionych technik rozdziału.

Adsorbenty (kilka wymogów):

• nie mogą pęcznieć zbyt mocno pod wpływem rozcieńczonych elektrolitów,

• nie mogą pękać w trakcie suszenia,

• muszą zapewniać wymagane w analizie warunki czułości,

• nie powinny pochłaniać promieniowania UV.

Adsorbenty możemy podzielić na organiczne i nieorganiczne.

Jeżeli przyjmiemy wartość R_f danej substancji odnośnikowej jako „1” to możemy obliczyć R_B jako stosunek:

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA POWTARZALNOŚĆ WARTOŚCI R_f DANEJ SUBSTANCJI:

• Jakość oraz sposób przygotowania warstwy: dla danej serii doświadczeń najlepiej użyć adsorbentu pochodzącego z tej samej serii, grubość warstw powinna być taka sama.

• Jakość oraz sposób użycia rozpuszczalnika: używane rozpuszczalniki muszą być bardzo czyste, te które mogą podlegać zmianom chemicznym należy przygotowywać na świeżo, należy zwrócić uwagę na możliwość tworzenia estrów w układach zawierających alkohol i kwas.

• Ilość naniesionej substancji.

Techniki ch. Cienkowarstwowej:

• chromatografia wstępująca,

• chromatografia zstępująca,

• chromatografia poziomowa,

• chromatografia jedno – i dwuwymiarowa,

• techniki ilościowe

Ch. Wstępująca:

Przygotowaną do rozdziału płytkę wstawia się do komory wysyconej parami rozpuszczalnika, zanurzając ja w układzie rozwijającym. Długość drogi rozwijania zależy od szybkości migrowania substancji.

Ch. Zstępująca:

W wanience znajdującej się na górze komory (szczelnie zamkniętej i dobrze wysyconej parami rozpuszczalnika) umieszcza się rozpuszczalnik i doprowadza się go do płytki za pomocą paska bibuły.

Ch. Pozioma:

Polega na rozwijaniu chromatogramu w pozycji poziomej i nadaje się do rozdzielania substancji wolno migrujących, o zbliżonych wartościach Rf

Ch. Jeno- i Dwukierunkowa:

Chromatogramy rozwija się jednorazowo w danym układzie rozpszczalników. Jeśli różnice wartości R_f substancji rozdzielanych są nieznaczne, należy zastosować kilkakrotne rozwijanie.

Współczynnik R_f jest określany w tej metodzie jako ⁿR_f :

Lepsze efekty rozdziału zapewnia też technika stopniowego rozwijania oraz jednowymiarowa technika stref klinowych.

Chromatografie dwuwymiarową stosuje się, gdy rozwijanie chromatogramu w jednym kierunku nie daje pożądanego efektu.

Techniki ilościowe:

• Porównanie wielkości plam : metoda półilościowa oparta na fakcie, że rozmiar plamy jest proporcjonalny do logarytmu z ilości naniesionej substancji (w zakresie 1 – 30µg). Plamy porównujemy przerysowując je na papier milimetrowy i obliczając ich powierzchnie.

• Metoda fotometryczna bezpośrednia: polega na przesunięciu wywołanego chromatogramu przed okienkiem fotokomórki. Na podstawie odczytanych absorbncji i wykreślonej krzywej kalibracyjnej odczytujemy na niej ilości substancji.

• Oznaczanie stężenia w eluatach: analogiczna do stosowanej w chromatografii bibułowej, najdokładniejsza. Zaabsorbowane substancje wymywa się z warstwy za pomocą odpowiednich rozpuszczalników i oznacza się ich stężenie kolorymetryczne lub spektrofotometryczne. Po zlokalizowaniu plam należy je zeskrobać do roztworu eluującego. Próbkę należy odwirować przed oznaczeniem (zawiesina adsorbentu uniemożliwia właściwy pomiar).