Test selekcyjny – podstawowa metoda identyfikacji mikroorganizmów w przemyśle.
W konstrukcji tego rodzaju testów poszukuje się cechy biochemicznej, powiązanej bezpośrednio lub pośrednio ze zdolnością mikroorganizmów do produkcji wybranego bioproduktu.
Obecnie dąży się do opracowania testów selekcyjnych umożliwiających prostą i szybką identyfikację mikroorganizmów o poszukiwanych właściwościach biochemicznych.
Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu odpornego na wysokie stężenie substancji toksycznej – metoda płytek gradientowych.
Z kolonii, które przeszły testy selekcyjne z wynikiem pozytywnym za pomocą posiewu redukcyjnego zostają wyprodukowane czyste kultury, które poddawane są następnie testom fermentacyjnym.
Testy fermentacyjne
Pozwalają na ocenę stopnia przydatności w przemyśle poszczególnych izolantów mikroorganizmów wyselekcjonowanych w testach selekcyjnych.
Ich celem jest wybór mikroorganizmu przeprowadzającego określony proces biotechnologiczny z największą wydajnością pod względem kosztów ekonomicznych związanych z prowadzeniem procesu produkcji wybranego bioproduktu na skalę przemysłową.
- prowadzone są w niewielkich bioreaktorach o pojemności 5-20l
- w testach tych ustala się optymalną metodę hodowli badanego mikroorganizmu
- wybór określonego rozwiązania konstrukcyjnego bioreaktora
- wybór sposobu hodowli (ciągła, dolewana, okresowa)
- warunki fizyko-chemiczne
- skład pożywki hodowlanej
Identyfikacja
Wybrane na podstawie testów fermentacyjnych mikroorganizmy zostają poddane badaniom mającym ustalić ich przynależność gatunkową.
Doskonalenie szczepów – mutacja
Mutacja - nagłe pojawienie się komórki zmienionej w populacji zdolnej do przekazywania zmienionych cech potomstwu.
Mutant – forma o zmienionym genotypie
Mutageneza – proces, wynikiem którego są mutacje.
Czynniki mutagenne
Analogi zasad – antymetabolity, po wbudowaniu do struktury DNA funkcjonują prawie jak normalne zasady, ale mają skłonność do tworzenia pary z błędnie dobranym partnerem.
(5-bromouracyl, 5-bromodeoksyurydyna, 2-aminopuryna)
Chemiczne modyfikacje zasad:
Azotany – deaminacja adeniny (A zamieniona w hipoksantynę tworzy parę z C, a nie z T – mutacja punktowa)
Hydroksyloamina – reaguje głównie z C, zmieniona zasada reaguje z A – mutacja punktowa
Związki alkilujące – metylo- i etylometanosulfonian, dimetylo- i dietylosiarczan, iperyt, alkilacja zasad.
Kwas azotawy – oksydatywna deaminacja zasad, zmiana specyficzności parowania zasad.
Barwniki akrydynowe – cząsteczki barwników mają zdolność do lokalizowania się między sąsiednimi zasadami.
Promieniowanie UV i jonizujące (254nm – 265nm) powtarzalne wyniki, możliwość uzyskania wszystkich typów mutantów, mutacje w komórkach wegetatywnych oraz przetrwalnych.
Ulepszanie szczepów związane jest z:
- wywołaniem mutacji
- selekcją i ocena mutantów
Selekcja mutantów
Zespół technik, które mają zapewnić szybką i efektywną ocenę efektów mutagenezy i wyodrębnieniem komórek o pożądanych cechach.
Hodowle ze wskaźnikiem chemicznym
Testy wykorzystujące odpowiedni indykator wykazujący zróżnicowanie kolonii. (wskaźnik pH – tworzenie kwasów i zasad, pożywki z celulozą barwioną czerwienią Kongo – enzymy celu lityczne)
Wskaźniki mikrobiologiczne – izolacja mutantów auksotroficznych
Prototrofy – organizmy, które żywią się na pożywkach mineralnych (same mogą syntezować część związków)
Auksotrofy – wymagają pożywek maksymalnych.
Zastosowanie:
Producenci antybiotyków – musi być szczep kontrolny, który jest wrażliwy na działanie antybiotyków. Ustala się słupki i posiewa testowy mikroorganizm
Producenci aminokwasów – podłoże ze szczepem auksotroficznym testowym, który potrzebuje do wzrostu określonego aminokwasu.
Mutanty stosowane w produkcji penicyliny pochodzą od dzikiego szczepu Penicillum chrysogenum Q 176 wprowadzonego do przemysłu w 1945.
Mutanty o zwiększonej produktywności i wybiórczości – produkcja L-lizyny.
2 typy mutantów:
- wyeliminowanie dehydrogenazy homoserynowej
- zmiana charakteru kinazy asparaginowej (zmieniona została wrażliwość na hamowane produkty)
Hybrydyzacja
naturalna hybrydyzacja wiąże się z przekazaniem informacji genetycznej z komórki dawcy do komórki biorcy w wyniku ich fizycznego kontaktu i polega na wymianie fragmentów DNA pomiędzy ich chromosomami albo genoforami.
Badania genetyczne mają sens tylko wtedy, kiedy u organizmów występuje cykl płciowy lub przynajmniej cykl paraseksualny.
Naturalna hybrydyzacja zachodzi z częstotliwością 10-6.
Przeszkody: sztywna ściana komórkowa, ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony komórkowej.
Fuzja protoplastów – fuzja wymuszona
Protoplasty (komórka bez ściany komórkowej)
Sferoplasty (częściowo zachowana ściana komórkowa utrzymuje się na drodze enzymatycznej hydrolizy ściany komórkowej w warunkach zapewniających osmotyczną stabilizację struktury).
Związki wybrane do stabilizacji środowiska osmotycznego.
Pożywienie – toksyczność – nie hamuje
- sole nieorganiczne, sacharydy, alkohole cukrowe w buforze
Protoplasty bakterii:
Gram+ lizozym
Gram - lizozym + EDTA + warunki jonowe
Protoplasty grzybów – sok żołądkowy ślimaka
Najłatwiej otrzymać protoplasty z komórek pochodzących z fazy wzrostu wykładniczego.
Protoplasty mogą łączyć się ze sobą gdy zbliżą się do siebie na odległość mniejszą niż 1nm.
PEG – inicjator fuzji
Podczas fuzji tworzy się układ heterokariotyczny w którym z dużą częstotliwością następuje kariogamia i rekombinacja pomiędzy genoforami. Następnie w procesie samorzutnej lub indukowanej haploidyzacji następuje segregacja nowych genotypów. Protoplasty hoduje się potem w odpowiedniej pożywce.
Selekcja rekombinantów
Wymaga genetycznie trwałych markerów fizjologicznych. Najczęściej używa się szczepów auksotroficznych o różnych wymaganiach pokarmowych, mutantów oddechowych lub opornych na dany antybiotyk.
Zastosowanie fuzji protoplastów pozwala na rekombinację zarówno wewnętrzną jak i zewnątrzkomórkową oraz rekombinację więcej niż 2 genów.
Technologia rekombinacji DNA – przenoszenie genów z jednego organizmu na drugi. Otrzymuje się komórki zdolne do syntezy określonego białka.
Narzędzia rekombinacji
- restryktazy – endonukleazy restrykcyjne – rozpoznają specyficzne sekwencje palindromowe, sekwencje w dwuniciowym DNA i hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w obu niciach w miejscu rozpoznanej sekwencji lub w niewielkiej odległości od tego miejsca.
- metylazy – towarzyszą restryktazom (system chroniący) – metylują zasady purynowe i pirymidynowe w obrębie miejsca rozpoznawanego przez restryktazy w macierzystym DNA np. metylaza EcoRI.
- egzonukleazy – hydrolizują 1-niciowe DNA lub RNA, usuwają fragmenty 1-niciowe lub 2-niciowe
- fosfataza alkaliczna – usuwa końce 5’ gr. Fosforanowej, linearyzacja wektora
- odwrotna transkryptaza – synteza RNA komplementarnego do mRNA
- polimerazy DNA – wykorzystywane do syntezy dwuniciowego DNA na matrycy jednoniciowej
- lipaza – łączą polinukleotydy ufosforylowane w pozycji 5’ do polinukleotydów posiadających wolne grupy 3’-OH
- rybonukleazy – hydrolizują RNA
- enzymy lityczne – do pozbycia się ściany komórkowej
Technologie rekombinacji DNA – wektory
- ogólnego zastosowania - pBR322
- ekspresyjne do efektywnej syntezy białka
- klonowanie sekwencji promotorowych
- ekspresyjno – elekcyjne – do produkcji egzoproteiny
- mutagenezy insercyjnej
Klonowanie – etapy:
Izolacja lub synteza genu
Łączenie genu z wektorem
Wprowadzenie do komórki gospodarza
Selekcja klonów
Praktyczne wykorzystanie klonów
Ad1.
- cięcie losowe DNA – pierwsza metoda izolacji DNA, gen alfa-amylazy z Bacillus jakiegoś tam w Bacillus subtillis
- chemiczna synteza genu – stosowana do krótkich polipeptydów
- synteza cDNA – procedura, która wykorzystuje jednoniciowy mRNA jako matrycę do syntezy komplementarnego DNA
- synteza genów metodą PCR