Test selekcyjny – podstawowa metoda identyfikacji mikroorganizmów w przemyśle.

W konstrukcji tego rodzaju testów poszukuje się cechy biochemicznej, powiązanej bezpośrednio lub pośrednio ze zdolnością mikroorganizmów do produkcji wybranego bioproduktu.

Obecnie dąży się do opracowania testów selekcyjnych umożliwiających prostą i szybką identyfikację mikroorganizmów o poszukiwanych właściwościach biochemicznych.

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu odpornego na wysokie stężenie substancji toksycznej – metoda płytek gradientowych.

Z kolonii, które przeszły testy selekcyjne z wynikiem pozytywnym za pomocą posiewu redukcyjnego zostają wyprodukowane czyste kultury, które poddawane są następnie testom fermentacyjnym.

Testy fermentacyjne

Pozwalają na ocenę stopnia przydatności w przemyśle poszczególnych izolantów mikroorganizmów wyselekcjonowanych w testach selekcyjnych.

Ich celem jest wybór mikroorganizmu przeprowadzającego określony proces biotechnologiczny z największą wydajnością pod względem kosztów ekonomicznych związanych z prowadzeniem procesu produkcji wybranego bioproduktu na skalę przemysłową.

- prowadzone są w niewielkich bioreaktorach o pojemności 5-20l

- w testach tych ustala się optymalną metodę hodowli badanego mikroorganizmu

- wybór określonego rozwiązania konstrukcyjnego bioreaktora

- wybór sposobu hodowli (ciągła, dolewana, okresowa)
- warunki fizyko-chemiczne

- skład pożywki hodowlanej

Identyfikacja

Wybrane na podstawie testów fermentacyjnych mikroorganizmy zostają poddane badaniom mającym ustalić ich przynależność gatunkową.

Doskonalenie szczepów – mutacja

Mutacja - nagłe pojawienie się komórki zmienionej w populacji zdolnej do przekazywania zmienionych cech potomstwu.

Mutant – forma o zmienionym genotypie

Mutageneza – proces, wynikiem którego są mutacje.

Czynniki mutagenne

• Analogi zasad – antymetabolity, po wbudowaniu do struktury DNA funkcjonują prawie jak normalne zasady, ale mają skłonność do tworzenia pary z błędnie dobranym partnerem.

(5-bromouracyl, 5-bromodeoksyurydyna, 2-aminopuryna)

Chemiczne modyfikacje zasad:

• Azotany – deaminacja adeniny (A zamieniona w hipoksantynę tworzy parę z C, a nie z T – mutacja punktowa)

• Hydroksyloamina – reaguje głównie z C, zmieniona zasada reaguje z A – mutacja punktowa

• Związki alkilujące – metylo- i etylometanosulfonian, dimetylo- i dietylosiarczan, iperyt, alkilacja zasad.

Kwas azotawy – oksydatywna deaminacja zasad, zmiana specyficzności parowania zasad.

• Barwniki akrydynowe – cząsteczki barwników mają zdolność do lokalizowania się między sąsiednimi zasadami.

• Promieniowanie UV i jonizujące (254nm – 265nm) powtarzalne wyniki, możliwość uzyskania wszystkich typów mutantów, mutacje w komórkach wegetatywnych oraz przetrwalnych.

Ulepszanie szczepów związane jest z:

- wywołaniem mutacji

- selekcją i ocena mutantów

Selekcja mutantów

Zespół technik, które mają zapewnić szybką i efektywną ocenę efektów mutagenezy i wyodrębnieniem komórek o pożądanych cechach.

Hodowle ze wskaźnikiem chemicznym

Testy wykorzystujące odpowiedni indykator wykazujący zróżnicowanie kolonii. (wskaźnik pH – tworzenie kwasów i zasad, pożywki z celulozą barwioną czerwienią Kongo – enzymy celu lityczne)

Wskaźniki mikrobiologiczne – izolacja mutantów auksotroficznych

Prototrofy – organizmy, które żywią się na pożywkach mineralnych (same mogą syntezować część związków)

Auksotrofy – wymagają pożywek maksymalnych.

Zastosowanie:

Producenci antybiotyków – musi być szczep kontrolny, który jest wrażliwy na działanie antybiotyków. Ustala się słupki i posiewa testowy mikroorganizm

Producenci aminokwasów – podłoże ze szczepem auksotroficznym testowym, który potrzebuje do wzrostu określonego aminokwasu.

Mutanty stosowane w produkcji penicyliny pochodzą od dzikiego szczepu Penicillum chrysogenum Q 176 wprowadzonego do przemysłu w 1945.

Mutanty o zwiększonej produktywności i wybiórczości – produkcja L-lizyny.

2 typy mutantów:

- wyeliminowanie dehydrogenazy homoserynowej

- zmiana charakteru kinazy asparaginowej (zmieniona została wrażliwość na hamowane produkty)

Hybrydyzacja

naturalna hybrydyzacja wiąże się z przekazaniem informacji genetycznej z komórki dawcy do komórki biorcy w wyniku ich fizycznego kontaktu i polega na wymianie fragmentów DNA pomiędzy ich chromosomami albo genoforami.

Badania genetyczne mają sens tylko wtedy, kiedy u organizmów występuje cykl płciowy lub przynajmniej cykl paraseksualny.

Naturalna hybrydyzacja zachodzi z częstotliwością 10^-6.

Przeszkody: sztywna ściana komórkowa, ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony komórkowej.

Fuzja protoplastów – fuzja wymuszona

Protoplasty (komórka bez ściany komórkowej)

Sferoplasty (częściowo zachowana ściana komórkowa utrzymuje się na drodze enzymatycznej hydrolizy ściany komórkowej w warunkach zapewniających osmotyczną stabilizację struktury).

Związki wybrane do stabilizacji środowiska osmotycznego.

Pożywienie – toksyczność – nie hamuje

- sole nieorganiczne, sacharydy, alkohole cukrowe w buforze

Protoplasty bakterii:

Gram+ lizozym

Gram - lizozym + EDTA + warunki jonowe

Protoplasty grzybów – sok żołądkowy ślimaka

Najłatwiej otrzymać protoplasty z komórek pochodzących z fazy wzrostu wykładniczego.

Protoplasty mogą łączyć się ze sobą gdy zbliżą się do siebie na odległość mniejszą niż 1nm.

PEG – inicjator fuzji

Podczas fuzji tworzy się układ heterokariotyczny w którym z dużą częstotliwością następuje kariogamia i rekombinacja pomiędzy genoforami. Następnie w procesie samorzutnej lub indukowanej haploidyzacji następuje segregacja nowych genotypów. Protoplasty hoduje się potem w odpowiedniej pożywce.

Selekcja rekombinantów

Wymaga genetycznie trwałych markerów fizjologicznych. Najczęściej używa się szczepów auksotroficznych o różnych wymaganiach pokarmowych, mutantów oddechowych lub opornych na dany antybiotyk.

Zastosowanie fuzji protoplastów pozwala na rekombinację zarówno wewnętrzną jak i zewnątrzkomórkową oraz rekombinację więcej niż 2 genów.

Technologia rekombinacji DNA – przenoszenie genów z jednego organizmu na drugi. Otrzymuje się komórki zdolne do syntezy określonego białka.

Narzędzia rekombinacji

- restryktazy – endonukleazy restrykcyjne – rozpoznają specyficzne sekwencje palindromowe, sekwencje w dwuniciowym DNA i hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w obu niciach w miejscu rozpoznanej sekwencji lub w niewielkiej odległości od tego miejsca.

- metylazy – towarzyszą restryktazom (system chroniący) – metylują zasady purynowe i pirymidynowe w obrębie miejsca rozpoznawanego przez restryktazy w macierzystym DNA np. metylaza EcoRI.

- egzonukleazy – hydrolizują 1-niciowe DNA lub RNA, usuwają fragmenty 1-niciowe lub 2-niciowe

- fosfataza alkaliczna – usuwa końce 5’ gr. Fosforanowej, linearyzacja wektora

- odwrotna transkryptaza – synteza RNA komplementarnego do mRNA

- polimerazy DNA – wykorzystywane do syntezy dwuniciowego DNA na matrycy jednoniciowej

- lipaza – łączą polinukleotydy ufosforylowane w pozycji 5’ do polinukleotydów posiadających wolne grupy 3’-OH

- rybonukleazy – hydrolizują RNA

- enzymy lityczne – do pozbycia się ściany komórkowej

Technologie rekombinacji DNA – wektory

- ogólnego zastosowania - pBR322

- ekspresyjne do efektywnej syntezy białka

- klonowanie sekwencji promotorowych

- ekspresyjno – elekcyjne – do produkcji egzoproteiny

- mutagenezy insercyjnej

Klonowanie – etapy:

• Izolacja lub synteza genu

• Łączenie genu z wektorem

• Wprowadzenie do komórki gospodarza

• Selekcja klonów

• Praktyczne wykorzystanie klonów

Ad1.

- cięcie losowe DNA – pierwsza metoda izolacji DNA, gen alfa-amylazy z Bacillus jakiegoś tam w Bacillus subtillis

- chemiczna synteza genu – stosowana do krótkich polipeptydów

- synteza cDNA – procedura, która wykorzystuje jednoniciowy mRNA jako matrycę do syntezy komplementarnego DNA

- synteza genów metodą PCR