Wykład 3

Ascomycetes – workowce

Mają grzybnię podzieloną septami, rozmnażają się płciowo – tworzą worki, w których tworzą się zarodniki.

Przykłady:

- Chaetomium – wytwarza ciała owoconośne (butelkowaty kształt, pokryte rzęskami, ogromna siła celulityczna – zdolność do wytwarzania celulaz – rozkład błonnika) wytwarzają je również grzyby podstawkowe.

- Byssochlamys fulva – atakowanie pasteryzowanych przetworów.

- B. nivea – atakowanie pasteryzowanych przetworów, atakuje truskawki

Deuteromycetes

Nie rozmnażają się generatywnie, rozmnażają się wegetatywnie. Występuje cykl paraseksualny – strzępki 2 różnych plech zbliżają się do siebie, tworzą się poprzeczne mosty – anastomozy – dochodzi do plazmogamii, powstaje grzybnia zawierająca jądra obu plech – powstaje heterokarion. Czasami zlewają się jądra (kariogamia). Po zlaniu 2 jąder różnych powstaje diploida, która ulega samorzutnej haploidyzacji bez mejozy.

Przykłady:

1. Aspergillus

Jest to kropidlak, występuje w powietrzu, glebie, zawiera różne enzymy hydrolityczne, produkuje różne substancje – kwas cytrynowy

- produkty o małej zawartości wody – A. glaucus, A. niger

- surowce roślinne – zboża, nasiona, orzeszki arachidowe – A. ochraceus, A. oryzae, A. flavus, A. parasitius

- ściany, materiały budowlane – A. niger, A. flavus, A. oryzae

Aspergillus produkuje aflatoksyny.

1. Penicillum

Pędzlak, zespół konidalny, występuje w glebie i powietrzu, saprofity – rozkład materii organicznej, należy do pleśni magazynowych, atakuje owoce

- zielona zgnilizna – P. digitalum

- niebieska zgnilizna – P. italicum

- mokra zgnilizna – P. expansum

- sery – P. camemberti, P. roqueforti

Odpowiedzialne również za degradację ksenobiotyków

1. Fusarium

Mają podbarwioną grzybnię od spodu, wytwarzają przetrwalniki, chlamidospory, znoszą wysoką temperaturę, niską temperaturę i wysoką wilgotność. Przeżywają mycie i pasteryzację, saprofity, mogą pasożytować na roślinach - zboże, buraki cukrowe. Fitopatogenność związana z produkcją pektynaz.

Fuzarioza kłosów, wytwarzanie miko toksyn, które mają właściwości hormonalno-estrogenne.

F. solani, F. oxysporum, F. moniliforme

1. Botritis

Szara grzybnia, uczestniczą czynnie w rozkładzie celulozy i pektyn, saprofity, mogą być pasożytami roślin

B. cinerea – pasożyt buraków cukrowych, zakażone hodowle pomidorów, atakowanie winorośli, wytwarzają substancje śluzowate

1. Alternaria

Rosną na czarno, z Aspergillus i Penicillum wchodzą w skład pleśni magazynowych. Silne alergeny.

1. Cladosporium

Grzybnia brunatna, jasne kulki z zielonymi włoskami, bardzo silne właściwości lipolityczne, należą do psychotropów, rozwijają się w warunkach chłodniczych.

C. herbarum, C. fulvum - pomidory, powodują plamistość liści

są silnymi alergenami.

1. Geotrichum

Jasna, luźna grzybnia, atak na masło, mleczarstwo, kiszonki – zdolność do stabilizacji kwasu mlekowego, silne właściwości lipolityczne.

G. candidum - saprofit, może być patogenem ludzkim, jama ustna, drogi oddechowe

Identyfikacja mikroorganizmów

Proces identyfikacji mikroorganizmów polega na określeniu przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku.

Szczep referencyjny – izolant danego gatunku, opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec).

Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujący co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA.

Identyfikacja taksonomiczna bakterii

Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe.

%G+C = (nG + nC)/(nA + nT + nC + nG) *100%

W obrębie rodzaju różnice w % molowych G+C nie mogą przekroczyć 10%

Klucz Bergey’a dotyczy tylko bakterii!!

Metody klasyczne – Procaryota

- morfologia komórki

- skład chemiczny ściany komórkowej

- obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych

- interakcje z innymi organizmami

- środowisko występowania

- patogenność

- wrażliwość na antybiotyki

- charakterystyka temperaturowa, pH

- stosunek do tlenu

- skład i ilość produktów fermentacji

- wymagania pokarmowe

- zdolność do tworzenia pigmentów

Metody biologii molekularnej – Procaryota

- analiza ilościowa kwasów nukleinowych (%G+C)

- homologia kwasów nukleinowych

Sekwencja polinukleotydów 16S rRNA

Metody klasyczne – Eucaryota

- sposób rozmnażania generatywnego

- patogenność

- ekologia

- budowa ściany komórkowej

- osmotolerancyjność i osmofilność

- czynniki pokarmowe

- tworzenie ureazy – drożdże

- zdolność do wytwarzania pseudogrzybni lub grzybni

- tworzenie pigmentów

- cechy hodowlane populacji

- sposób rozmnażania wegetatywnego

- cechy morfologiczne komórki.

Metody biologii molekularnej – Eucaryota

Takie same jak u Procaryota

Sekwencja polinukleotydów 18S rRNA

Metody biochemiczne – polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych.

Cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych. Wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo:

- wzrost lub jego brak

- reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem

- na podstawie reakcji chemicznej

Metody biofizyczne

Umożliwiają one identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów przez oznaczanie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych. Wyróżniamy tutaj metody elektroforetyczne i chromatograficzne.

Metody elektroforetyczne – skład białek jest charakterystyczny dla danej jednostki taksonomicznej. Izolacja białek, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym – profil białkowy.

Metody chromatograficzne – skład kwasów tłuszczowych ściany komórkowej jest charakterystyczny dla danego gatunku przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli.

Metody biologii molekularnej

Metody oparte na badaniu homologii kwasów nukleinowych

Metoda hybrydyzacji – sondy genetyczne

Homologia > 60% - przynależność do gatunku

Homologia > 20 % - zgodność z danym rodzajem

Homologia < 5% - organizmy niespokrewnione

Gene Trak (sonda znakowana peroksydazą)

Gene Probe (sonda znakowana estrem akrydynowym)

Metoda PCR

Metody immunologiczne

Metody oparte na reakcji pomiędzy przeciwciałem a antygenem.

Testy aglutynacyjne (identyfikacja bakterii, pleśni), testy immunoenzymatyczne ( wykorzystują reakcje enzymatyczne do uwidocznienia reakcji immunologicznej, cząsteczki enzymu związane są kowalencyjnie z przeciwciałami lub biotyną [peroksydaza chrzanowa, alkaliczna fosfataza]), testy immunofluorescencyjne (wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi, cząsteczki barwnika przyłączone są do cząsteczek immunoglobulin kowalencyjnie)

Elisa – test bezpośredni

Elisa – test pośredni

Elisa – test podwójnego wiązania „kanapkowy”

Mikroorganizmy w biotechnologii

Źródła szczepów przemysłowych:

1. Środowisko naturalne

2. Środowisko przekształcone przez człowieka

3. Kolekcja szczepów

4. Inne źródła

Pozyskiwanie mikroorganizmów o znaczeniu przemysłowym:

- izolacja nowych mikroorganizmów o pożądanych cechach

- badanie nowych szczepów, nowe sposoby hodowli, bardziej czułe metody analityczne

Pozyskiwanie szczepów mikroorganizmów o znaczeniu przemysłowym

1. Wybór miejsca

2. Pobranie próby ze środowiska

3. Wstępna obróbka próbki

4. Izolacja

5. Testy selekcyjne

6. Testy fermentacyjne

7. Identyfikacja gatunkowa wybranego mikroorganizmu

1. Wybór miejsca

Środowisko – to wybrane przez nas na drodze racjonalnego wyboru źródło mikroorganizmów, z którego spodziewamy się wyizolować, z zastosowaniem klasycznych technik mikrobiologicznych mikroorganizmów o właściwościach, które stanowią o ich atrakcyjności biotechnologicznej

Przykłady:

1. Wydajna enzymatyczna hydroliza laktozy w mleku o temperaturze 10-15 stopni C

Miejsce pobrania próby – środowisko naturalne obfitujące w gatunki mikroorganizmów psychrofilnych i psychrotrofowych

1. Przetwórstwo skrobi – wytwarzanie syropów glukozowych

Środowisko naturalne obfitujące w gatunki mikroorganizmów termofilnych i hipertermofilnych

1. Nowe antybiotyki

Środowisko naturalne obfitujące w gatunki promieniowców

1. Bioremediacja gleby skażonej produktami ropopochodnymi

Środowisko obfitujące w gatunki mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji węglowodorów

1. Bioremediacja gleby skażonej pierwiastkami promieniotwórczymi

Środowisko obfitujące w gatunki mikroorganizmów odpornych na promieniowanie jonizujące

1. Pobranie próby ze środowiska

Kolekcja gatunków mikroorganizmów dominujących w populacji drobnoustrojów w danym środowisku nie stanowi problemu. Mikroorganizmy potencjalnie przydatne w procesach przemysłowych to tylko niewielki odsetek całej populacji

Sposoby zwiększania liczebności pozyskiwanych mikroorganizmów:

- oddziaływanie na środowisko przed pobraniem próby

- wprowadzenie do środowiska wabików – pułapek

- wstępna obróbka fizyczna lub mechaniczna próbki

- hodowla wzbogacająca.

Przykłady:

1. Izolacja bakterii propionowych – hodowle beztlenowe na glukozie, podłoże z mleczanem/C

2. Izolacja bakterii kwasu octowego – źródło węgla, 4% etanol (Acetobacter, Glukonobacter)

3. Izolacja promieniowców – novobiocyna, penicylina

4. Izolacja grzybów – Streptomycyna

5. Izolacja bakterii przetrwalnikujących – podwyższona temperatura

1. Techniki izolacyjne

Zastosowanie pożywek stałych – metodę tę stosuje się do izolowania producentów enzymów. Stosuje się odpowiednią pożywkę selekcyjną zawierającą substrat dla enzymu i obserwuje się stan podłoża wokół kolonii.

Izolacja poprzez przegląd szczepów – wykorzystuje się takie podłoża hodowlane, które zapewniają maksymalną ekspresję cech genetycznych. Przygotowuje się wiele pożywek o różnych czynnikach limitujących, a dla każdego limitowanego substratu stosuje się różne formy składników występujących w dostarczonych ilościach.