Ćwiczenie 1 – IMMUNOPATOLOGIA

Immunohistochemia

• Wykrywa antygeny lub przeciwciała związane z komórką lub tkanką w skrawkach mikroskopowych.

• Opiera się na reakcji antygen–przeciwciało.

Zastosowanie immunohistochemii

• Wykrywanie obecności antygenów nowotworowych lub produktów komórek nowotworowych

• Różnicowanie nowotworów o nie znanej etiologii (przeciwciała monoklonalne); określanie immunofenotypu komórek nowotworowych

• Kierunek różnicowania się komórek rakowych

• Lokalizacja guza pierwotnego i przerzutów

• Wykrywanie kompleksów immunologicznych i ocena ich składu

• Wykrywanie antygenów w zakażeniach: bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych

• Określanie typu immunoglobin i antygenów

• Różnicowanie komórek limfoidalnych w zespołach limfoproliferacyjnych

• Identyfikacja złogów w tkankach

Otrzymywanie i oczyszczanie przeciwciał do badań immunohistochemicznych

• Immunohistochemiczne uwidocznienie antygenu w materiale biologicznym wymaga uzyskania go w czystej postaci, a następnie otrzymania swoistych dla tego antygenu przeciwciał.

• Wyizolowany metodami preparatyki biochemicznej antygen służy do immunizacji (pobudzenia układu immunologicznego) zwierząt laboratoryjnych, które będą później stanowić źródło swoistych przeciwciał. 

Znakowanie przeciwciał 

Przeciwciała mogą być znakowane:

• fluorochromami, czyli barwnikami fluorescencyjnymi (preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym);

• enzymami (badania na poziomie mikroskopu świetlnego i elektronowego)

• metalami (badania na poziomie mikroskopu elektronowego).

• Znakowanie fluorochromami

Metody immunohistochemiczne wykorzystujące przeciwciała znakowane fluorochromami noszą nazwę immunofluorescencji.

W praktyce stosuje się najczęściej następujące fluorochromy:

• izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) - zielona fluorescencja,

• tetrametylo-izotiocyjanian rodaminy (TRITC) - czerwona fluorescencja,

• czerwień teksańska (Texas Red, TR) - czerwona fluorescencja,

• aminometylokumaryna (AMCA) - niebieska fluorescencja.

Znakowanie enzymami

• Po wykonaniu reakcji immunohistochemicznej (wiązanie przeciwciała z antygenem), należy dodatkowo przeprowadzić reakcję histochemiczną uwidaczniającą aktywność enzymu, którym znakowane było przeciwciało.

• Do znakowania przeciwciał używa się kilku enzymów, z których najpowszechniej stosowane to peroksydaza i fosfataza zasadowa.

Znakowanie ferrytyną

• Ferrytyna to białko zawierające w swojej cząsteczce znaczną ilość (ok. 4000 atomów) żelaza i mające formę elektronowo gęstych ziaren o średnicy ok. 9 nm.

• To pozwoliło na wykorzystanie ferrytyny jako znacznika do badań immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego

Znakowanie koloidalnym złotem

• W badaniach immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego najczęściej stosuje się przeciwciała znakowane koloidalnym złotem (złoto wiąże się z hydrofobowymi obszarami cząsteczki przeciwciała).

• Mikroskopijne ziarenka metalicznego złota (średnica od 5 do 40 nm) widoczne są w mikroskopie elektronowym w postaci kontrastowych, czarnych punktów, wyraźnie lokalizujących miejsce związania znakowanego przeciwciała z tkanką.

• Znakowanie koloidalnym złotem można wykorzystać również na poziomie mikroskopu świetlnego - wykonuje się wówczas dodatkową reakcję redukcji soli srebra do srebra metalicznego przez związane już z tkanką złoto, uzyskując w miejscu reakcji czarny strąt (metoda złoto-srebro).

Najczęściej stosowane znaczniki

• Peroksydaza

• 3,3’-diaminobenzydyna (DAB) – ciemnobrązowy precypitat

• 3-amino-9-etylokarbazol – czerwony produkt

• 4-chloro-1-naftol – niebieski produkt

• Fosfataza zasadowa

• Oksydaza glukozowa – produkt niebiesko-fioletowy

• Znaczniki fluorescencyjne – np.. FITC

Etapy badania histologicznego

• Pobieranie tkanki

• Wybranie wycinków

• Utrwalanie tkanki:

- zazwyczaj chemicznie (formalina)

- mrożenie

• Usunięcie utrwalacza

• Odwodnienie tkanki (alkohole)

• Oczyszczenie tkanki (ksylen)

• Zatopienie w parafinie

• Wykonanie preparatów (szkiełek)

• Barwienie

• Przykrycie szkiełkiem nakrywkowym (balsam kanadyjski)

Materiał

Przygotowanie materiału do badań immunohistochemicznych 

UTRWALANIE

• Utrwalacze, zwłaszcza o charakterze aldehydów, z reguły wywierają niekorzystny wpływ na antygenowość materiału. Często zaleca się krótkotrwałe utrwalanie w szybko penetrujących utrwalaczach precypitacyjnych (alkohole), niekiedy jedynym wyjściem jest przeprowadzenie reakcji immunohistochemicznej na materiale nieutrwalanym.

ODWADNIANIE

ZATAPIANIE

• Stosuje się technikę mrożeniową, zarówno na poziomie mikroskopu optycznego jak i elektronowego lub polarne żywice akrylowe (Lowicryl K4M, LR Gold) w mikroskopii elektronowej.

ODSŁANIANIE MIEJSC ANTYGENOWYCH

• Utrwalenie i zatopienie materiału często powoduje zmiany w cząsteczkach antygenu (zmiany kształtu, dołączenie dodatkowych grup chemicznych), które utrudniają lub uniemożliwiają rozpoznanie determinant antygenowych przez swoiste przeciwciała. Uzyskuje się wówczas słabą intensywność lub całkowity brak reakcji immunocytochemicznej.

Do najczęściej stosowanych metod należą:

• kontrolowane trawienie skrawków przy użyciu enzymów proteolitycznych (np. trypsyną),

• działanie na skrawki mikrofalami.

BARWIENIE

Wykonanie reakcji immunohistochemicznej

• Przed właściwą reakcją immunohistochemiczną wykonuje się tzw. blokowanie, inkubacja preparatów z nieaktywną immunologicznie (nie zawierającą swoistych przeciwciał) surowicą innego gatunku zwierzęcia niż to, od którego uzyskano przeciwciała (można też stosować roztwór albumin). Etap ten ma zablokować w badanym materiale miejsca, które mogłyby nieswoiście wiązać białka osoczowe, a zatem również przeciwciała.

• Istnieją dwie metody przeprowadzania reakcji immunohistochemicznych do celów mikroskopii elektronowej: przed zatopieniem materiału (preembedding) i na skrawkach ultracienkich, po zatopieniu tkanki (postembedding).

Typy reakcji immunohistochemicznych

Reakcja bezpośrednia polega na inkubacji tkanki zawierającej antygen A ze znakowanym przeciwciałem anty-A.

• Znakowane przeciwciało tworzy kompleks z antygenem obecnym w tkance i umożliwia jego mikroskopową lokalizację.

• Wada: chemiczne połączenie przeciwciała ze znacznikiem za pośrednictwem wiązań kowalencyjnych z reguły zmienia kształt cząsteczki przeciwciała, co może utrudniać jego zdolność rozpoznawania i przyłączania antygenu, czyli obniży powinowactwo przeciwciała do antygenu.

• Rzadko stosowana, głównie przy rutynowym wykonywaniu bardzo licznych preparatów immunohistochemicznych oraz w przypadkach, gdy przeciwciało pochodzi od tego samego gatunku zwierzęcia, u którego wykrywamy antygen.

Reakcja pośrednia: na zawarty w tkance antygen A działa się najpierw nie znakowanym przeciwciałem anty-A uzyskanym od zwierzęcia X (np. królika, Xanty-A). W drugim etapie, wytworzone w tkance kompleksy A+(Xanty-A) wiążą się ze znakowanym przeciwciałem antyglobulinowym, czyli skierowanym przeciwko immunoglobulinom zwierzęcia X i wytworzonym na drodze immunizacji zwierzęcia Y innego gatunku (np. kozy, owcy, świni).

• W wyniku takiej dwuetapowej reakcji, w miejscu występowania antygenu A tworzy się kompleks: A+(Xanty-A)+(Yanty-X). Znakowana antyglobulina Yanty-X uwidacznia miejsce lokalizacji antygenu A.

• Przeciwciało wiążące antygen tkankowy nie jest znakowane, a zatem unika się ewentualnych zmian struktury przeciwciała wynikających z jego chemicznej koniugacji ze znacznikiem.

Reakcja z mostkiem immunoglobulinowym i kompleksem enzym-antyenzym składa się z trzech etapów.

• Na antygen A w tkance działa się swoistym przeciwciałem anty-A uzyskanym od zwierzęcia X. Powstaje kompleks A+(Xanty-A).

• Nawarstwia się nieznakowane przeciwciało antyglobulinowe zwierzęcia Y skierowane przeciw immunoglobulinom zwierzęcia X - jest to tzw. mostek immunoglobulinowy.

• Do kompleksu A+(Xanty-A)+(Yanty-X) przyłącza się kompleks enzym-antyenzym (przeciwciało przeciw enzymowi pochodzi od zwierzęcia X).

• Kompleks: A+(Xanty-A)+(Yanty-X)+(Xantyenzym+enzym) uwidacznia miejsce lokalizacji badanego antygenu A, a antyglobulina Yanty-X pełni rolę mostka spinającego przeciwciało anty-A i antyenzym połączony z enzymem znacznikowym.

• Ostatnim etapem jest reakcja histochemiczna uwidaczniająca aktywność związanego z kompleksem enzymu.

• Najczęściej stosowane kompleksy to peroksydaza-antyperoksydaza (PAP) i fosfataza zasadowa-antyfosfataza (APAAP).

Reakcja z białkiem A: białko to wykazuje zdolność wybiórczego wiązania fragmentu Fc prawie wszystkich immunoglobulin (klasy G) ssaków.

• Można nim zastąpić antyglobulinę w reakcji pośredniej (białko A musi być wówczas znakowane), lub też można go użyć w charakterze mostka antyglobulinowego w reakcjach z kompleksem enzym-antyenzym.

• W praktyce najczęściej wykorzystuje się białko A znakowane złotem w reakcjach pośrednich na ultracienkich skrawkach przeznaczonych do badania w mikroskopie elektronowym. 

Reakcja z awidyną i biotyną wykorzystuje trwałe i swoiste połączenie tworzące się pomiędzy awidyną (glikoproteidem występującym w białku jaja) a biotyną (niskocząsteczkową witaminą (H) wyosobnioną z żółtka).

• Biotynę można sprzęgać na drodze chemicznej z przeciwciałami, natomiast awidynę można znakować.

• Wiązanie awidyna-biotyna pełni rolę łącznika pomiędzy przeciwciałem a znacznikiem.

• Reakcje z awidyną i biotyną przeprowadzane są przeważnie według schematu pośredniej reakcji immunohistochemicznej

Istnieją dwie podstawowe odmiany reakcji z awidyną i biotyną:

• reakcja LAB (ang. labeled avidin-biotin), w której awidyna znakowana jest chemicznie

• reakcja ABC (ang. avidin-biotin-enzyme complex), w której do biotynylowanej antyglobuliny przyłącza się uprzednio przygotowany, wielocząsteczkowy kompleks awidyny, biotyny i enzymu znacznikowego.

Reakcje kontrolne 

Do najczęściej stosowanych reakcji kontrolnych negatywnych należą:

• użycie do reakcji przeciwciał, które zostały uprzednio związane ze swoistym antygenem in vitro, w związku z czym ich fragmenty Fab są zablokowane (tzw. kontrola adsorbcyjna),

• blokowanie właściwej reakcji przez preinkubację ze swoistym, lecz nie znakowanym przeciwciałem (przy reakcjach bezpośrednich)

• inkubacja z immunoglobulinami (lub surowicą) nieimmunizowanego zwierzęcia gatunku, który posłużył do uzyskania przeciwciał, zamiast pierwszego przeciwciała, swoistego dla danego antygenu (przy reakcjach pośrednich),

• inkubacja bez mostka antyglobulinowego (w reakcjach immunoenzymatycznych z użyciem mostka),

• wykonanie reakcji histochemicznej wykrywającej aktywność enzymu znacznikowego z pominięciem poprzednich etapów procedury immunoenzymatycznej.

• Pozytywne reakcje kontrolne sprawdzają, czy zastosowane przeciwciało wiąże się z wykrywanym antygenem. Reakcję immunocytochemiczną przeprowadzamy na przebadanym uprzednio materiale, w którym jest obecny wykrywany antygen, lub na skrawkach żelu nasyconego roztworem wyizolowanego i oczyszczonego chemicznie antygenu. Prawidłowym wynikiem jest dodatnia reakcja, jej brak świadczy o nieaktywnych przeciwciałach lub o błędach metodycznych. 

Mikroskopy w immunohistochemii

• Mikroskop świetlny

• Mikroskop fluoroscencyjny

• Mikroskop konfokalny albo współogniskowy

• Mikroskop elektronowy transmisyjny

• Mikroskop elektronowy skaningowy

Barwienie kwasem nadjodowym i fuksyną - reakcja PAS (Periodic
acid-Schiff)

• Oligocukry poddane działaniu kwasu nadjodowego ulegają utlenieniu. Powstały dwualdehyd reaguje z dczynnikiem Schiffa jakim jest fuksyna (odbarwiona kwasem siarkawym) dając barwną, purpurową reakcję.

Reakcja PAS - szpik prawidłowy

Produkt reakcji: czerwone ziarnistości w miejscu występowania glikogenu

Komentarz: Gruboziarnista reakcja w limfocycie wskazanym strzałką. Ponadto, widocznych jest pięć innych granulocytów wykazujących słabą, reakcję dodatnią dyfuzyjną (w neutrofilach segmentowanych reakcja ta jest silna).