Jebane gówno cz. 2
BADANIE ŻYWOTNOŚCI KOMÓREK PRZY UŻYCIU BŁĘKITU TRYPANU
- polega na sprawdzeniu wpływu danej substancji/pożywki na żywotność komórek. Podaje się błękit trypanu który barwi komórki martwe (apoptotyczne, nekrotyczne).
- wykonanie: zawiesina komórek + błękit trypanu. Roztwór do komory Burkera. Pod mikroskopem liczy się martwe (fioletowe) i żywe komórki.
KOMORA BURKERA:
Głębokość: 0,1 mm
Długość boku dużego kwadratu: 1 mm (do środkowej kreski)
Długość boku średniego kwadratu: 0,2 mm
Długość boku małego kwadratu: 0,05 mm
szkiełko z wydrążonymi dwoma komorami o określonej objętości i wymiarach, w których napięcie powierzchniowe wymusza całkowite jej wypełnienie.
Działanie komory Bürkera: Na dnie komory są wyrysowane linie, które ograniczają pewien obszar, w których liczymy komórki. W każdej komorze (2) mamy wyrysowanych 9 kwadratów ograniczonych przez potrójne linie. Każdy z tych 9 kwadratów jest kolejny raz podzielony na 16 mniejszych kwadratów oddzielonych podwójnymi liniami
Przeliczniki:
Objętość 1 kwadratu = 0,1 mm3,
Objętość 10 kwadratów = 1 mm3 (1000 mm3 = 1 ml)
Suma komórek z 10 kwadratów x 1000 daje liczbę komórek w 1 ml badanej zawiesiny.
A = 80000 x B x C x D
80000 – współczynnik
B – srednia ilość kom przypadajaca na 1 pole
C – rozcieńczenie Komorek
D – calkowita objętość zawiesiny
PŁYN TURKA
Odczynnik chemiczny stosowany w analityce medycznej do manualnego liczenia krwinek
Białych bezmieszalnikową metodą.
TESTY:
Bromodeoksyurydyna - (5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU) jest syntetycznym analogiem tymidyny. BrdU jest zwykle używane do detekcji dzielących się komórek w żywych tkankach. Bromodeoksyurudyna, będąc analogiem nukleozydu wchodzącego w skład DNA, wbudowuje się do nowopowstającego DNA, podczas jego replikacji w fazie S cyklu komórkowego. Następnie, przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciw BrdU, możliwa jest detekcja wbudowanych cząsteczek. Pozytywny wynik testu z użyciem BrdU oznacza, iż w komórkach zachodzi replikacja, co wiąże się z podziałem komórkowym zdrowych komórek. BrdU pozwala na detekcję szybko dzielących się komórek w danej tkance. Bromodeoksyurudyna (BrdU) jest mutagenem. W cząsteczce DNA ma skłonność do tworzenia pary z guaniną. Podobnie zachowuje się inny związek: 5-bromouracyl.
test transformacji blastycznej – ocenia zdolność limfocytów do proliferacji. Limfocyty stymuluje się swoistymi antygenami, np. oczyszczona tuberkulina - PPD, anatoksyna tężcowa, drożdżaki, gronkowce... (w przypadku pierwotnej stymulacji transformuje kilka % limfocytów, przy wtórnej – ok. 15%) lub tzw. nieswoistymi mitogenami, które mogą być pochodzenia roślinnego (lektyny) lub bakteryjnego, np. fitohemaglutynina (PHA – stymuluje limfocyty T i B), konkanawalina A (ConA – limfocyty T), mitogen szkarłatki –PWM (limfocyt B), lipopolisacharyd (LPS – limfocyty B), białko A gronkowca (limfocyty B). Pod wpływem mitogenów transformuje 70 – 90% komórek. Stosuje się:
metoda morfologiczna – odsetek komórek blastycznych ocenia się w mikroskopie świetlnym, w preparacie wykonanym z osadu 3-5 dniowej hodowli izolowanych limfocytów z mitogenem lub antygenem.
metoda izotopowa – opiera się na wiązaniu znakowanej trytem tymidyny przez bakterie niepochłonięte przez fagocyty. W teście można oceniać fagocytozę i zabijanie. W liczniku scyntylacyjnym mierzy się stopień radioaktywności samych bakterii oraz sfagocytowanych i oblicza indeks fagocytarny oraz indeks zabijania.
Znakowanie CFSE jest używane do oznaczania fluorescencją komórek. CFDA/SE może przechodzić przez błony komórkowe, jednak kiedy dostaje się do komórki na skutek reakcji enzymatycznych nie może z niej wychodzić. Jest rozdzielany po równo do komórek potomnych komórki pierwotnie oznakowanej (rozkładany jest do FITC, zwiazku fluorescencyjnego). Metoda pozwala na obserwowanie proliferacji komórek, a także odróżnianie komórek z oznaczonego szczepu od tych nieoznaczonych