Biochemia – enzymy: kinetyka

Dr Puchalska, X 2012

Kliniczny podział wg Richtericha i Hessa

1. Sekrecyjne (ważna jest dolna granica normy) – normalnie wydzielane do krwi

   1. czynniki krzepnięcia - w wątrobie to głównie czynniki II VII IX X (zespół protrombiny). Wyjątkowo, dla nich ważna jest też górna granica normy. Uszkodzenie wątroby powoduje zmniejszenie stężenia tych czynników i wydłużenie PTT. Przy stosowaniu sterydów (np. sterydowe środki antykoncepcyjne), przechodzą one do wątroby, gdzie stymulują wydzielanie białek - m.in. czynników krzepnięcia, przez co długotrwałe stosowanie prowadzi do zakrzepicy. Dlatego też wprowadzono leki transdermalne, które nie przechodzą przez układ wrotny.

   2. czynniki fibrynolizy

   3. nieswoista esteraza cholinowa

   4. ceruloplazmina

   5. lipaza lipoproteinowa – ektoenzym naczyń mięśni i tkanki tłuszczowej

   6. lipaza wątrobowa (HTGL) – wraz z LPL są ektoenzymami, przytwierdzone przez siarczan heparanu, a odrywane heparyną. Jest wytwarzana przez śródbłonek zatok żylnych wątroby.

   7. acylotransferaza lecytyna-cholesterol (LCAT, EC 2.3.1.43) – estryfikacja cholesterolu w HDL

2. Indykatorowe (wskaźnikowe, nie powinno ich być we krwi). Ilość wskazuje na rozległość uszkodzenia:

   1. Narządowo swoiste – ich obecność wskazuje na konkretny narząd

      1. wątroba: dehydrogenaza alkoholowa i sorbitolowa, transferaza ornitynokarbamoilowa, aldolaza fruktozomonofosforanowa, arginaza

      2. mięśnie i serce: kinaza kreatynowa, aldolaza fruktozodifosforanowa

   2. Narządowo nieswoiste – nie wskazuje na narząd, a na proces zachodzący nieprawidłowo

      1. glikolizy: LDH

      2. cyklu pentozowego: dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

      3. cyklu Krebsa: dehydrogenaza jabłczanowa

      4. przemiana aminokwasów (AlAT, AspAT)

3. Wydalnicze (ekskrecyjne) – wydalane przez przewody

   1. Żółć – tzw. triada cholestazowa - w przypadku zastoju żółci mogą pojawić się we krwi:
      fosfataza alkaliczna, GGTP (EC 2.3.2.2), LAP (leucyloaminopeptydaza, EC 3.4.11.1).

   2. Sok trzustkowy – lipaza, trypsyna, chymotrypsyna

   3. Ślina – amylaza

   4. Sok sterczowy: fosfataza kwaśna (dawniej używana jako marker nowotworu stercza, dziś zastąpiony PSA, czyli antygenem specyficznym dla stercza)

   5. Żołądek – pepsynogen

Izoenzym - enzymy katalizujące tą samą reakcję ale różnią się budową molekularną (najczęściej zbudowane z podjednostek białkowych innych genów), szybkością wędrowania w polu elektrycznym, inhibitorami, aktywatorami, miejscem występowania, genem kodującym

Izoforma – kodowane przez ten sam gen, natomiast w trakcie modyfikacji posttranslacyjnych ulegają innym – powstałe izoformy różnią się głównie specyficznościa substratową, miejscem występowania.

Diagnostyka MI

Markery osoczowe – wyróżnia się enzymatyczne i nieenzymatyczne (lepszymi markerami są nieenzymatyczne, takie jak mioglobina, troponiny).

Kinaza kreatynowa katalizuje odwracalną fosforylację kreatyny. Ma 3 izoenzymy zbudowane z podjednoski B i M (po dwie na enzym). Dla mięśnia sercowego charakterystyczne dwie izoformy MB (15-20% CPK w sercu to izoenzym MB, w mięśniach to 1-3%).

• CPK-MB

  • czuły marker, MI do 6 godzin od wystąpienia objawów

  • izoformy CPK-MB₁ i CPK-MB₂

• Troponiny

  • cTnI i cTnT

  • dobre późniejsze markery

W przypadku MI ważna jest ilość kinazy kreatynowej jaka dostaje się do osocza CK-MB_mass. Określana badaniem immunoenzymatycznym – przeciwciała przeciwko kinazie znakowane enzymem, pozwalają na określenie bardzo małych stężeń.

Troponiny

• występują u zdrowych w bardzo małych ilościach – wykrywane jedynie przez najczulsze testy.

• diagnostyczny wzrost powyżej >99 percentyla populacji kontrolnej
  (decydujące o zawale cTnT 0,03ng/ml oraz cTnI 0,012-0,4ng/ml zależnie od metody)

• brak wyników falszywie dodatnich (?)

Stężenie kinazy kreatynowej wzrasta fizjologicznie w wyniku bardzo intensywnego wysiłku fizycznego.

Najlepsza jest kombinacja CPK-MB i troponin. Nie należy polegac wyłacznie na troponinach, ich podwyższone stężenie utrzymuje się przez 7-14 dni. Nie nadaje się do wykrywania dowału (drugi zawał – wykrywany CK). Kinaza ma krótki czas połowicznego rozpadu, po 3 dniach wraca do normy. W ostrych stanach wieńcowych także wzrastają troponiny.

Kryteria serologiczne MI

• Podwyższenie, a następnie obniżenie aktywności CK-MB, zmiana ponad 25% między dwoma pomiarami występującymi jeden za drugim.

• Wzrost aktywności CK-MB powyżej 10-13 U/l lub >5% aktywności całkowitej CPK.

• Wzrost aktywności CK-MB ponad 50% między dwoma pomiarami co najmniej 4h po sobie.

• Pojedynczy pomiar – podwyższenie większe niż dwukrotne.

• ** stężenie 6ng/ml, a w następnym pomiarze zmiana o 1,6ng/ml oznacza ostry zawał serca

Diagnostyka MI:

• preferencyjnie powinno oznaczać się troponiny

• CPK-MB oznaczamy jeśli nie można oznaczyć troponin

• Jeśli troponiny nieoznaczalne, a wzrasta CPK-MB, CK-MB najprawdopodobniej nie pochodzenia sercowego

• Jeśli wartość troponin wzrasta >20% od ostatniego oznaczenia – ponowny zawał

• Jeśli pierwsze oznaczenie jest negatywne – kolejne po 6h lub wcześniej jeśli jest duże prawdopodobienstwo zawału

Wzrost troponin

• Oprócz zawału mięsnia sercowego - myocarditis, zator płucny, niewydolność krążenia, przeciążenie prawej komory serca.

• Mogą wskazać na wielkość ogniska zawałowego

  • szczyt troponin w 48-72h

• Czynnik prognostyczny – wysokie stężenie jest skorelowane z

  • śmiertelnościa 30-dniową,

  • upośledzeniem przepływu krwi po PCI

  • zjawiskiem no-reflow

• wskazują na możliwe do zastosowania u danego pacjenta leki

Mioglobina – cytoplazmatyczna hemoproteina, występuje w mięśniach, we krwi brak.

• norma we krwi: 0-116ng/ml

• szybki metabolizm

• szybki wzrost stężenia (1-2h)

• niespecyficzna, lecz jej brak może wykluczyć zawał gdy mierzona w chwili przyjęcia i po 4h

• marker reperfuzji po terapii fibrynolitycznej, wraz ze wzrostem przepływu krwi przez tkankę jest przepłukiwana

• przy niewydolności nerek utrzymuje się dłuzej

H-FABP – białko wiążące kwasy tłuszczowe

• Można je szybko oznaczyć prostymi metodami np. w karetce

• kinetyka podobna do mioglobiny

• bardziej specyficzny dla serca (10x więcej go tam niż w mięśniach szkieletowych)

• czulszy, ale mniej specyficzny

• rokowanie

Zależy co chcemy badać – EKG nie jest wystarczające. Mioglobina – bardzo szybko wzrasta, niespecyficzna. Troponiny – później, czas powrotu po 10-14 dniach. LDH – dla stwierdzenia ewentualnego gojenia się mięśnia po zawale.

Inhibitory enzymów jako leki

Niedobór ważnej biomolekuły

• inhibicja enzymów degradujących

• np. GABA (mediator hamujący un) jest rozkładany przez aminotransferazę GABA. Jeśli działa ona zbyt intensywnie, dochodzi do drgawek (niedobór GABA).

• inhibitory aminotransfereazy GABA: kwas walproinowy, vigabatryna

Nadmiar biomolekuły

• inhibicja enzymu produkującego

• np. synteza kwasu moczowego z puryn

• Dna moczanowa – leczenie inhibitorem oksydazy ksantynowej (ksantyna kwas moczowy) np. allopurynol. Nadmiar puryn w organiźmie występuje przy nadmiernym rozpadzie komórek, nowotworach, reperfuzji np. po udrożnieniu naczynia.

Inhibicja całego szlaku metabolicznego specyficznego dla danego patogenu np. kwasu foliowego – MTX (ten akurat działa na komórki eukariotyczne), trimetoprim (działa na bakterie), sulfonamid (analog PABA)

Inhibicja może być odwracalna, nieodwracalna etc.

Inhibitor samobójczy

• enzym uczestniczy w aktywacji inhibitora – popełnia samobójstwo

• taki inhibitor nieaktywny jest podobny do substratu. W katalizie powstaje reaktywny związek pośredni, który tworzy silne wiązanie kowalencyjne z enzymem lub częściej z grupą prostetyczną (z koenzymem nie, bo ten oddysocjowuje). Powstały kompleks nie dysocjuje i nie mogą się przyłączać następne substraty.

• Zalety: inhibitor podobny do znanego nam substratu, łatwo wprowadzić reaktywne grupy, aktywowane tylko przez enzym docelowy

• Wady: nieodwracalność tej inhibicji

• Przykład:

  • starsze Inhibitory MAO (oksydaza monoaminowa, rozkładanie adrenaliny i noradrenaliny),

  • Penicylina, sulbaktam (antybiotyki beta-laktamowe) – blokowaie syntezy ściany komórkowej bakterii przez nieodwracalne zatrucie enzymu transpeptydazy peptydoglikanu, która tworzy wiązania poprzeczne. Niektóre bakterie syntezują beta-laktamazę, broniąc się – podajemy inhibitory beta-laktamazy + antybiotyk.

  • AZT (azydotymidyna, inhibitor RT)

  • 5-FU (5-fluorourydyna, nowotwory) – przekształcany w inhibitor syntazy tymidylanowej

Leki naśladują naturalne grupy chemiczne aby zablokować enzym np. sulfonamid zamiast PABA w syntezie kwasu foliowego.

Inhibitory cyklooksygenazy (COX1, COX2 – enzym katalizujący przekształcanie kwasu arachidonowego do prostaglandyn, tromboksanów, prostacyklin)

• niesterydowe leki przeciwzapalne (NSAIDs)

  • ibuprofen – blokowanie hydrofobowego kanału transportującego kwas arachidonowy do centrum katalitycznego enzymu

  • kwas acetylosalicylowy – acyluje COX resztą kwasu octowego, nieodwracalnie blokując ten enzym. W niewielkich dawkach blokują COX-1 w trombocytach (wytwarzanie TXA2) hamując procesy krzepnięcia na czas życia trombocytów. Blokują również wytwarzanie prostacykliny przez komórki śródbłonka, ale te dosyntezowują enzym, więc przeważa efekt antyskrzepliwy. Osobom starszym podaje się nisko dawkowaną aspirynę aby zatrzymała procesy krzepnięcia; ponadto w dusznicy bolesnej, zagrożeniu zawałem serca czy udarem mózgu.

*Inhibitory fosfolipazy A2 – sterydowe leki przeciwzapalne np. hydrokortyzon. Enzym ten uwalnia z fosfolipidów błony kwas arachidonowy, będący substratem COX.

*Inhibitory lipooksygenazy – zileuton, dietylokarbamazyna, azelastyna, NDGA.

Inhibitory acetylocholinoesterazy (enzym produkowany w wątrobie – jako jeden z pierwszych przy uszkodzeniu wątroby pojawia się jej wzrost we krwi). Enzym ten ma miejsce estrowe (dla acetylu) oraz anionowe (dla choliny).

• odwracalne, kompetycyjne: edrofonium (tylko m. anionowe), neostygmina, fizostygmina, riwastygmina (oba mm.). Używane w leczeniu jaskry

• nieodwracalne (fosforylują m. estrowe): związki fosfoorganiczne (diizopropylofluorofosforan, fosfolina – leki na jaskrę), insektycydy, gazy bojowe (sarin, tabun), donepezil

• zastosowania: myastenia gravis, glaucoma, choroba Alzheimera, zatrucie muskarynomimetykami; w przypadku nieodwracalnych istnieją związki wiążące te inhibitory, czyli odwracające nieodwracalną inhibicję:

• Odtrutki – oksymy, wiążą związki fosfoorganiczne i tracą one powinowactwo: pralidoksym, obidoksym; ponadto atropina (antagonista receptora muskarynoego ACh)

• Sukcynylocholina (oprócz acetylocholiny jest substratem acetylocholinoesterazy; środek zwiotczający mięśnie podczas zabiegów) – przy uszkodzeniu lub niedoborze acetylocholinesterazy (genetycznie uwarunkowany podtyp AA pseudocholinoesterazy) może być przyczyną zgonu.

Inhibitory fosfodiesterazy (rozkładają cAMP – fosfodiesteraza 6, cGMP – fosfodiesteraza 5). Utrzymanie wysokiego stężenia cyklicznych AMP lub GMP powoduje ciągłe przekazywanie sygnału przez pobudzanie receptora beta-adrenergicznego (efekt jakby działała amina katecholowa)

• Sildenafil (viagra)

  • blokuje rozpad cGMP (inhibcja PDE5)

  • wzmaga działanie NO

  • hamowanie PDE₆ w siatkówce – zaburzenia widzenia kolorów

• Enzym rozkładający cAMP (fosfodiesteraza 6, PDE6?) hamowany jest przez: metyloksantyny – teobromina, teofilina, kofeina. Metyloksantyny są metabolizowane do kwasu moczowego.

Inhibitory reduktazy HMG-CoA – jeden z metabolitów pośrednich w syntezie cholesterolu, reduktaza HMG-CoA do kwasu mewalonowego. Blokowanie tego etapu powoduje obniżenie niekorzystnych parametrów lipidowych (LDL, Total cholesterol, Triglicerydy). Statyny inhibują kompetycyjnie, odwracalnie

• atorvastatyna, simvastatyna, rosuvastatyna, lovastatyna, pravastatyna, fluvastatyna.

• Efekt: spadek LDL TCh TG, wzrost HDL

Układ renina angiotensyna – angiotensynogen pod wpływem reniny (to jest enzym produkowany w nerce) przekształca się w angiotensynę-1. AT-1 pod wpływem ACE przekształca się w AT-2, a ta ma dwa rodzaje receptorów. AT-2 – wazokonstrykcyjnie, co jest niekorzystne przy schorzeniach układu krążenia.

• Inhibitory reniny: aliskiren, ramikiren (nie powstaje angiotensyna)

• Inhibitory ACE: captopryl, enalapryl, lysinopryl, cilazapryl, perindopryl (nie powstaje angiotensyna II). Zawierają ugrupowania wiążące cynk.

• Inhibitory AT1: losartan, walsartan, kondesartan, telmisartan (angiotensyna II łączy się wtedy z AT-2, co ma korzystniejsze skutki)

Receptory:

AT1 – wzrost ciśnienia krwi, pobudzenie skurczu mięśni gładkich

AT2 – wazorelaksacja

Inhibitory nieodwracalne: jony metali ciężkich, głównie Hg Pb Ag – powinowactwo do siarki, grup –SH (tiolowych). Wiązania S-S stabilizują strukturę enzymów, a te powodują ich zniszczenie.

• Ołów

  • wchłania się 10-15% dawki (stosunkowo dużo),

  • może się kompleksować z wapniem, żelazem, fosforem (jego wchłanianie wzrasta przy niedoborze wapnia, żelaza, fosforu)

  • odkłada się w tkankach

  • osocze – 99% ołowiu w erytrocytach, gdzie:

    • hamuje dehydrogenazę kwasu delta-aminolewulinowgo (ALA – enzym biorący udział w syntezie hemu) oraz ferrochelatazę – zahamowana synteza hemu, skutkiem jest anemia

    • hamuje 5’-nukleotydazę pirymidynową (regeneracja rRNA) – powstają nieprawidłowe erytrocyty

    • kompetycja z Ca2+ - zaburzenia neuroprzekaźnictwa

  • leczenie EDTA, DMSA (chelatory)

• Rtęć

  • Źródła: timerosal – związek używany do konserwacji szczepionek i leków, stare baterie, związki metaloorganiczne

  • kumuluje się w nerkach -> uszkodzenie nerek oraz w innych narządach zależnie od obecności transporterów

  • inhibitor enzymów z –SH

  • niespecyficzne działanie

  • denaturuje oksydazę bursztynianową i cytochromową, dehydrogenazę bursztynianową (cykl krebsa, łańcuch oddechowy)

  • Leczenie – chelatory: D-penicylamina (również wiąże Cu²⁺, przy długim stosowaniu nie działa też oksydaza lizylowa, może powodować miastenię), DMSA DMPS

• Srebro

  • wiąże –SH

  • Źródło: azotan srebra

  • hamuje aktywność peroksydazy glutationowej (antagonista selenu, który ma właściwości antyoksydacyjne) – upośledza ochronę przeciwwolnorodnikową i przeciwnowotworową

  • srebro koloidalne w małym stężeniu działa antybakteryjnie

Enzymy jako leki - znacznie mniej powrzechne niż inhibitorów enzymów.

Choroby trzustki – amylazy, trypsyny, lipazy

• bardzo powrzechnie stosowane w przypadku niedoboru lub bardzo tłustej diety

• w specjalnej otoczce chroniącej przed kwaśnym pH żołądka

Choroby spichrzeniowe – nadmierne magazynowanie globozydów, gangliozydów i innych. Nadmierne gromadzenie się takich związków prowadzi do zaburzeń neurologicznych.

• choroba Fabriego (niedobór alfa-galaktozydazy A)

• choroba Gauchera (niedobór glukocerebrozydazy)

  • obie powyższe - bardzo wysokie koszty rzędu setek tysięcy USD rocznie

Terapia fibrynolityczna

• streptokinaza – wyizolowane ze streptococcus, łączy się z plazminogenem aktywując go. Mniej wybiórcza niż tPA, aktywuje zarówno plazminogen w osoczu (gdzie może on rozkładać krążący fibrynogen) oraz ten związany ze skrzepem fibrynowym. Jej niekorzystną cechą jest antygenowość. Leczenie zakrzepicy naczyń wieńcowych

• altepiaza (tPA) – i poniższe są rekombinowane, inny np. czas półtrwania. Bardziej wybiórcza, bo tPA aktywuje plazminogen tylko w obecności fibryny. Leczenie chorych na udar niedokrwienny mózgu, zwężenie tętnic obwodowych, zatorowość płucną.

• reteplaza

• tenektoplaza

Asparaginaza

• leczenie ostrej białączki limfoblastycznej

• na skutek mutacji zanika możliwość syntezy asp w komórkach białaczkowych (nie wszystkich, tylko limfoblastycznych). Po zastosowaniu asparaginazy komórki zdrowe dosyntetyzują Asp, w przeciwieństwie do komórek nowotworowych.