http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3.Kataliza enzymatyczna

4.Kinetyka reakcji enzymatycznych

Prof.dr hab. in .Korneliusz Miksch

   

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

•

Swoisto

 enzymu wzgl dem katalizowanej reakcji i 





wzgl dem substratu



 (specyficzno

 reakcji i 



specyficzno

 substratowa)



2. Budowa enzymu

Holoenzym= koenzym + apoenzym

3. Mechanizm dzia ania enzymów



E + S          ES            E + P

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

Kompleks enzym-substrat

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

Miejsce aktywne enzymu (z substratem)

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

Reakcja  katalizowana  przez  enzym  rozpoczyna  si   od  zwi zania 





substratów  przez  centrum  aktywne  enzymu  i  powstania 
przej ciowego  kompleksu  enzym-substrat  (E-S).  Nast pnie 



zachodzi  w a ciwa  reakcja:  po czenie  cz steczek  substratów  w 







produkt  reakcji  albo  roz o enie  substratu  na  mniejsze  cz steczki. 

 



Reakcja  ko czy  si   uwolnieniem  produktów  przez  enzym. 





Cz steczka  enzymu  nie  zu ywa  si   podczas  reakcji  i  po 







uwolnieniu  produktów  jest  gotowa  do  przy czenia  nowych 



substratów. 

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

ENERGIA  AKTYWACJI  to  energia,  któr   musz   mie  







cz steczki  (jony,  atomy),  aby  by y  zdolne  do  okre lonej 





reakcji  chemicznej.;  energia  aktywacji  wyra a  si   zwykle 





w kilod ulach na mol (kJ/mol) reaguj cych cz steczek; im 







mniejsza  jest  energia  aktywacji,  tym  reakcja  zachodzi 
szybciej

 

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

Je eli w czasie zderze substraty maj za ma energi reakcja nie zachodzi.









czna liczba zderze mi dzy cz steczkami wzrasta z temperatur (cz steczki













poruszaj si szybciej). Udzia cz steczek obdarzonych energi wi ksz od















energii aktywacji wzrasta wraz z temperatur.

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

W reakcji katalizowanej wymagana jest znacznie ni sza energia aktywacji: 

E

akt.kat.

. W identycznych warunkach temperatury, znacznie wi cej cz steczek ma





energie przekraczaj ce t zmniejszon warto progow . Na wykresie odpowiada











temu pole oznaczone szarym + czarnym kolorem cznie.



http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

Maksymalna liczba obrotów wybranych enzymów

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3.Kataliza enzymatyczna

     

Wp yw odczynu na aktywno

 enzymów





http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

Nazewnictwo i klasyfikacja enzymów

Enzymy dawniej poznane maj  tradycyjnie u ywane nazwy 





zwyczajowe, np. pepsyna, trypsyna. Cz sto u ywanym 





sposobem tworzenia nazwy enzymu jest dodanie do nazwy 
rozk adanego zwi zku ko cówki „aza” np.:







-         sacharoza – sacharaza

-         dehydrogenacja (od czenie H2) 



 dehydrogenaza

-         dekarboksylacja (od czenie CO2) 



 dekarboksylaza

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

Klasy enzymów wg klasyfikacji mi dzynarodowej:



•Klasa 1: oksydoreduktazy- przenosz   adunki (

 

elektrony   i protony)

z cz steczki



 substratu na cz steczk  akceptora: AH





2

 + B   A + BH

2

; 

•Klasa  2:  transferazy  -przenosz   dan  





grup   funkcyjn





 z  cz steczki 



jednej substancji na cz steczk  innej substancji: AB + C   A + BC; 





•Klasa 3: hydrolazy -powoduj  rozpad substratu pod wp ywem 





wody

hydroliza): AB + H

2

O   A + B; 

•Klasa 4: liazy -powoduj  rozpad bez udzia u wody: AB   A + B; 





•Klasa 

5: 

izomerazy 

-zmieniaj  

wzajemne 

po o enie 

grup 



 

chemicznych wewn trz cz steczki zwi zku: AB   BA; 







•Klasa  6:  ligazy  (syntetazy)  -powoduj   syntez   ró nych  cz steczek; 









powstaj  wi zania chemiczne: A + B   AB; 





http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

3. Kataliza enzymatyczna

     

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Ilo ciowo

szybko reakcji



okre la si jako zmian





molowego st enia substratu lub produktu w jednostce



czasu.

Je eli mamy równanie reakcji chemicznej A ---> B + C



+ ...., to szybko reakcji opisuje równanie:



v = dc

A

/dt = k*c

A

    

lub

v = dc

B

/dt = dc

C

/dt     

gdzie: c

A

, c

B

, c

C

- st enia molowe substancji A, B, C,...



; t

– czas; dc

A

/dt - ubytek st enia substaratu w jednostce



czasu;dc

B

/dt, dc

C

/dt - przyrost st enia produktów w



jednostce czasu; k - wspó czynnik proporcjonalno ci



(sta a szybko ci).



http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Szybko reakcji jest wprost proporcjonalna do iloczynu



st e substratów.

 

Je eli mamy równanie reakcji chemicznej aA + bB + cC --->



dD, to szybko reakcji opisuje równanie;



v = k[A]

a

* [B]

b

* [C]

c

     /7-26/

gdzie: k - sta a szybko ci reakcji, (a, b, c) - wyk adnik pot gi,







do której nale y podnie st enie, odpowiednio [A], [B], [C].







W przypadku reakcji gazowych cz sto w równaniach



kinetycznych zamiast st e molowych stosuje si ci nienia

 



cz stkowe



http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Rz d reakcji

Wspó czynniki pot gowe (a, b, c) przy st

eniach







poszczególnych substratów okre laj rz d reakcji,



który mo e by cz stkowy lub sumaryczny.





Cz stkowy rz d reakcji

Je eli a = 1, to reakcja jest pierwszego rz du





wzgl dem A; je eli a = 2, to reakcja jest drugiego





rz du wzgl dem A itp.





Cz stkowe rz dy reakcji,



odpowiadaj

tylko

wspó czynnikom stechiometrycznym tych



reagentów.

Sumaryczny rz d reakcji

Sumaryczny rz d reakcji chemicznej - jest to suma

wyk adników pot gowych w równaniu szybko ci







reakcji chemicznej
( rz d reakcji = a + b + c + .....).

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Cz steczkowo

reakcji



Cz sto stosuje si okre lenie cz steczkowo

reakcji,









któr definiuje liczba cz steczek bior cych udzia w



najwolniejszym stadium reakcji.
Cz steczkowo

i rz d reakcji wyznacza si tylko





eksperymentalnie, nie mo na obliczy ich teoretycznie.





Sumaryczny rz d reakcji jest przewa nie liczb



nieca kowit , co oznacza, e reakcja przebiega przez





etapy po rednie, z których nawolniejszy decyduje o



sumarycznym rz dzie reakcji.



Na ogó rz d reakcji



, jak i cz steczkowo

s z regu y





ma ymi liczbami nie przekraczaj cymi warto ci 3.





Zagadnienie sprowadza si do tego, e równoczesne





zderzenia wi kszej liczby cz steczek s ma o





prawdopodobne, a na sumaryczn szybko

reakcji



wp ywa przede wszystkim najpowolniejszy etap



po redni bed cy przemian elementarn i dlatego rz d



reakcji jest ma

liczb



http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Praktycznie pomiary szybko ci reakcji wykaza y, e szybko

reakcji









nie jest sta a, lecz maleje w miar zu ywania si substratów.









Zmiany st

enia w czasie, dla reakcji I-szego rz du



http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Równanie Michaelisa-Menten

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

V=szybko

pocz tkowa (mole/litr); [S]=st

enie substratu(molowe);





Vmax=szybko

maksymalna; Km= sta a Michaelisa





http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Determination of V

m

and K

m

Linear representation of the the Michaelis-Menten Equation

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Determination of V

m

and K

m

Linear representation of the the Michaelis-Menten Equation

Eadie-Hofstee equation

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

 – 

typy inhibicji

    

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Efekt allosteryczny

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

In the absence of the substrate the equilibrium favors the T state very much so

nearly all enzyme is in the less active (or inactive) form. Addition of low amounts

of substrate will slightly affect this situation, because although the substrate will

bind preferentially to the R state molecules and pull more T into R state, there

will be not sufficient substrate for many R molecules to bind a second substrate

molecule, nor for many R state molecules to be formed. If a higher substrate

concentration is used, however, T molecules will "immediately" bind a second

substrate as soon as it they are converted into R . Thus we will observe an

initial slow increase in activity with increasing S concentration, which will then

take off.

 

Most allosteric enzymes are oligomeric (consisting of multiple subunits).

The oligomer has two different conformational states, R and T; T has low

affinity, R has high affinity for the substrate; no mixed R/T hybrids exist.

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

  

The activity of an allosteric enzyme with a sigmoidal binding curve
(black line) can be altered markedly when either an activator (blue
line) or inhibitor (red line) is bound to the enzyme. Addition of an
activator can lower the apparent Km, raising the activity at a given
[S]. Conversely, the addition of an inhibitor can raise the apparent
Km, producing less activity at a given [S].

The activated (blue) curve is ~hyperbolic. In the presence of
activator, the enzyme appears to be in the R-form. In the absence of
the activator or the presence of inhibitor (black and red curves)
appear to have decreasing R-form characteristics and more the
curve of the T-form of the allosteric enzyme.

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

Shown

are

plots

of

initial

velocity

versus

[fructose-6-phosphate]

for

phosphofructokinase-1 from E. coli. Increasing the concentration of ADP decreases the
apparent Km without affecting Vmax. The concentration of ATP is 0.1mM. [Adapted
from Blangy, S., Buc, H., and Monod, J. (1968). Kinetics of the allosteric interactions
of phosphofructokinase from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 31:13-35]

Non-covalent activation of an enyzme is possible through allostery through cooperative
binding of affector molecules. Increasing substrate increases the fraction of enzyme in
the R structure. The addition of ADP has the same effect. At 70micromolar ADP and
100micromolar ATP the plot shows that PFK-1 is almost entirely in the R-form.

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

R conformation of phosphfructokinase-1 

http://kbs.ise.polsl.pl

Environmental Biotechnology Department, SUT

4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

     

The  E.  coli  phosphofructokinase-1  is  a  tetramer  of  identical 
chains.  (a)  In  this  single  subunit,  shown  as  a  ribbon,  the 
products,  fructose  1,6-bisphosphate  (yellow)  and  ATP 
(green) are bound in the active site. The allosteric acctivator 
ADP (red) is bound in the regulatory site. (b) In the model of 
the  tetramer  (2  subunits  are  blue,  2  are  purple),  the 
products,  fructose  1,6-bisphosphate  (yellow)  and  ATP 
(green)  are  bound  in  the  four  active  sites.  The  allosteric 
activator  ADP  (red)  is  bound  in  the  four  regulatory  sites,  at 
the interface of the subunits. [PDB 1PFK] 

R conformation of phosphfructokinase-1