Oznaczanie białka całkowitego zmodyfikowaną metodą Extona

Ilona Kopeć, Mariusz Michalczyk, Rafał Rotkiewicz

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest oznaczenie stężenia białka w sokach owocowych zmodyfikowaną metodą Extona (5% kwas z dodatkiem siarczanu sodu oraz kwas 50% bez dodatków).

Metody oznaczania białek

Metoda Extona opiera się na wytrąceniu białek 3% kwasem sulfosalicylowym. Stopień zmętnienia jest następnie oznaczany spektrofotometrycznie przy długości fali 445 nm¹. W zmodyfikowanej metodzie Extona używa się kwasu sulfosalicylowego o różnym stężeniu oraz z dodatkiem Na₂SO_4. Pierwotnie metoda ta wykorzystywana była do oznaczania białek ludzkiej krwi.

Metoda biuretowa - W metodzie tej wykorzystuje się zdolność kompleksowania wiązania peptydowego z jonami miedzi (II) z rozcieńczonego roztworu siarczanu (VI) miedzi. W środowisku zasadowym kompleks przyjmuje barwę fioletową i charakteryzuje się maksimum absorpcji przy 546 nm². Stosowanie tej metody jest ograniczone obecnością soli amonowych, które również dają reakcję barwną z jonami miedzi.

Metoda Lowry’ego służy do oznaczania białek rozcieńczonych. Oznaczenie składa się z dwóch etapów – reakcji biuretowej z jonami miedzi (II) oraz redukcji powstałego kompleksu przez odczynnik Folina-Ciocolteau. Powstały barwny kompleks oznacza się przy długości fali 750 nm.

Metoda Kjeldahla (metoda pośrednia) polega na oznaczeniu azotu, a następnie przeliczeniu go na białko przy użyciu odpowiednich współczynników przeliczeniowych. Zasadniczo składa się z 3 etapów mineralizacji próbki, destylacji amoniaku i miareczkowania mianowanym roztworem HCl³.

Metoda Bradford z kolei polega na połączeniu białka w nierozpuszczalny kompleks z barwnikiem Comassie-Blue G-250. Pomiar standardu białkowego dostarcza informacji na podstawie krzywej wzorcowej, do której następnie odnosi się wyniki dla próbek białka. Jest to metoda szczególnie użyteczna dla białek z dużą ilością reszt aromatycznych. Pomiar odbywa przy długości fali 595 nm.

Metoda spektrofotometryczna – najprostsza z metod polega na zmierzeniu absorbancji dla próbki białka przy długości fali 280 nm. Jest to wartość maksimum absorpcji dla białek, w których dużą ilość stanowią reszty tryptofanu i tyrozyny. Z kolei pomiar przy 185 nm stanowi maksimum absorpcji dla wiązania peptydowego⁴. Jedną z wad tej metody jest to, że wiele innych związków chemicznych obecnych w próbce powoduje zafałszowanie wyników.

Wykonanie ćwiczenia

Trzy równoległe próbki soku „Hortex pomarańcza 100%”, o deklarowanej przez producenta zawartości białka: 0,7 % (m/v), rozcieńczono 10-krotnie w kolbach miarowych roztworem 0,9% chlorku sodu. Oznaczenie oparto na metodzie krzywej kalibracyjnej. Roztwory wzorcowe o odpowiednich stężeniach sporządzono z roztworu wzorcowego białka o stężeniu 1% (m/v) poprzez odpowiednie rozcieńczenia w kolbach miarowych. Wzorzec o stężeniu 1% sporządzono poprzez rozpuszczenie, 0,50 g wzorcowego białka w 50,0 cm³ roztworu soli fizjologicznej (0,9 % NaCl). Objętości wzorca, 1% jakie użyto do sporządzenia wzorców oraz ich końcowe stężenia przedstawia tabela 1. Następnie pobierano po 0,50 cm³ z każdego roztworu (wzorców i badanych soków) do probówek, dodawano po 3,50 cm³ roztworu 5% kwasu sulfosalicylowego z dodatkiem Na₂SO₄ (stężenie soli w roztworze wynosiło 7%) i po 5 minutach mierzono absorbancję przy długości fali 445 nm na spektrofotometrze Metertek SP850 stosując ślepą próbę, jako odnośnik (mieszanina użytego kwasu sulfosalicylowego i roztworu NaCl). Całą procedurę powtórzono stosując roztwór kwasu salicylowego o stężeniu 50%.

Nr roztworu wzorcowego	Objętość standardu białka 1% [cm^3]	Stężenie białka [%]
1	0,00	0,00
2	2,50	0,05
3	5,00	0,10
4	10,00	0,20
5	15,00	0,30

Tabela 1 Objętości standardu białka użyte do sporządzenia krzywej wzorcowej. Objętość końcowa roztworu = 50 cm3. Dopełniano do kreski roztworem soli fizjologicznej.

Wyniki

Obliczenia wykonano w programie GraphPad Prism 5.01.

• Krzywa wzorcowa dla roztworów z 5 % kwasem sulfosalicylowym:

Stężenie białka w roztworze wzorcowym [%]	Absorbancja
0,00	0,000
0,05	0,076
0,10	0,232
0,20	0,604
0,30	0,954

Tabela 2 Wyniki pomiarów absorbancji dla roztworów wzorcowych w 5 % kwasie.

Rysunek 1 Krzywa wzorcowa do oznaczania stężenia białka dla roztworów przygotowywanych w 5 % kwasie sulfosalicylowym.

Równanie krzywej kalibracyjnej: y=3,039x, R²= 0,9803

Przykład wyliczenia wartości stężenia białka dla próbek soku w 5 % kwasie:

A_średnie = 0,075

Równanie krzywej: y= 3,039x

c_białka= 0,075/3,039 = 0,025% => po uwzględnieniu rozcieńczenia c_białka = 0,25%

• Krzywa wzorcowa dla roztworów z 50 % kwasem sulfosalicylowym:

Stężenie białka w roztworze wzorcowym [%]	Absorbancja
0,00	0,000
0,05	0,052
0,10	0,129
0,20	0,307
0,30	0,472

Tabela 3. Wyniki pomiarów absorbancji dla roztworów wzorcowych w 50 % kwasie.

Rysunek 2 Krzywa wzorcowa do oznaczania stężenia białka dla roztworów przygotowywanych w 50 % kwasie sulfosalicylowym.

Równanie krzywej kalibracyjnej: y = 1,533x, R²= 0,9912

• Wyniki obliczeń zawartości białek:

Tabela 3. przedstawia wyniki eksperymentu: wartości zmierzonych absorbancji dla wszystkich próbek oraz odpowiadające im stężenia białka (obliczone z uwzględnieniem rozcieńczenia), wynik końcowy stężenia białka przedstawiony jako średnia z uzyskanych stężeń, odchylenia standardowe (SD), względne odchylenia standardowe (RSD), błędy względne oraz bezwzględne oraz równania krzywych kalibracyjnych dla dwóch stężeń kwasu sulfosalicylowego.

ckwasu [%]	próbka	A [j.u.]	cbiałka [%]	cśrednie [%]	SD [%]	RSD [%]	błąd bezwzględny [%]	błąd względny [%]	krzywa kalibracji
5	1	0,078	0,26	0,25	0,01	4,0	-0,45	65	y=3,039x
	2	0,076	0,25
	3	0,072	0,24
50	1	0,058	0,38	0,37	0,02	5,4	-0,33	48	y=1,533x
	2	0,057	0,37
	3	0,053	0,35

Tabela 4 Zestawienie wyników oznaczeń białek w badanym soku.

Do obliczeń błędu względnego i bezwzględnego za wartość dokładną przyjęto stężenie białka zadeklarowane przez producenta badanego soku na opakowaniu tj. 0,70%. Zarówno stężenie białka uzyskane z wykorzystaniem kwasu 5% jak i 50% są zaniżone (ujemne błędy bezwzględne).

• Porównanie wyników średnich testem Studenta na poziomie ufności 95% :

s_1, 2 = 0, 01135; t_x = 12, 95

t (odczytane z tabeli testu studenta, dla poziomu ufnosci 95 %) = 2, 776

t_x > t,  co oznacza,  ze roznica miedzy wartosciami srednimi jest istotna.

Porównanie dwóch wartości średnich pokazuje istotną różnice między wynikami na zadanym poziomie ufności.

Wnioski i omówienie wyników

Wykonano oznaczenie białka w soku owocowym metodą Extona z modyfikacjami: użycie 5% kwasy sulfosalicylowego z dodatkiem siarczanu sodu oraz czystego kwasu sulfosalicylowego o stężeniu 50% w drugiej modyfikacji. Uzyskane wartości stężeń (0,25% dla kwasu 5% oraz 0,37% dla kwasu 50%) różnią się istotnie na poziomie ufności 95%, co wykazano za pomocą testu Studenta. Badanie zostało wykonane precyzyjnie, na co wskazują niewielkie względne odchylenia standardowe (4% oraz 5%) oraz wysoki współczynnik korelacji dla krzywych wzorcowych bliski 1. Dokładność metody była większa w przypadku użycia kwasu 50% niż 5% (mimo mniejszej czułości, której miarą jest współczynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej), o czym świadczy mniejszy (mniej ujemny) błąd bezwzględny, mimo to obie metody nie dały zadowalających wyników z powodu małej dokładności (błędy względne oznaczeń rzędu 50%-60%). Różnica może wynikać z niedokładnej zawartości białka w soku podanej przez producenta oraz z błędu samej metody oznaczania. Należy zauważyć, iż absorbancja tych samych roztworów (zarówno soków jak i roztworów wzorcowych) była różna w zależności od stężenia kwasu użytego do strącenia białka. Wynika z tego fakt, iż stężenie kwasu miało wpływ na ilościowe strącenie frakcji białkowej. Błąd wynikał również z faktu, iż roztwory różnych białek o tym samym stężeniu absorbują promieniowanie w różnym stopniu z powodu odmienności w strukturze białek, zawartości i budowie aminokwasów, konformacji itp., a krzywe wzorcowe sporządzane były ze wzorca białka, które mogło nie odpowiadać białkom obecnym w badanym soku (co można przyjąć za wysoce prawdopodobne). Należy również pamiętać, iż metoda Extona pierwotnie była stosowana do oznaczeń białka w próbkach krwi, moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego, które mają matryce różniące się od matryc soków owocowych (chociażby różnice w rodzaju występujących białek), co również mogło być źródłem błędu. Metoda Extona z pewnością wymaga dalszych modyfikacji oraz dalszych badań w celu dokładniejszych oznaczeń białek w różnych matrycach.

---

1. Wg instrukcji do ćwiczeń „Analiza Białek”↩

2. http: //www.pchba.amu.edu.pl/cw%20Fak/cw4.pdf↩

3. http://chem.arch.ug.edu.pl/zas/dydaktyka/zywnosc/zywnosc2.pdf↩

4. http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Metody-oznaczania-bialek/↩