Western-blot

Z Wikipedii

Skocz do: nawigacji, szukaj

Żel poliakrylamidowy z rozdzielonymi białkami, zabarwiony Coomassie Brilliant Blue

Western-blot - metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca do wykrywania określonych białek.

Rozdziela zdenaturowane białka według ich mas oraz natywne (niezdenaturowane) według ich struktury 3-D, za pomocą elektroforezy w żelu (zwykle poliakrylamidowym). Później białka są przenoszone na membranę (zwykle nitrocelulozową lub PVDF). Obecność odpowiednich białek jest sprawdzana za pomocą barwników takich jak Ponceau S, czerń amidowa czy Coomassie Brilliant Blue lub za pomocą przeciwciał przyłączających się do ich epitopów.

Przed dodaniem przeciwciał membrana zostaje "zablokowana" przez zanurzenie w roztworze innego białka, zwykle żelatyny, albuminy surowicy krwi bydlęcej (BSA) lub odtłuszczonego mleka w proszku, często z dodatkiem detergentu (np. Tween 20) lub w roztworze samego detergentu, w celu uniemożliwienia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną.

Analogicznie do metody ELISA w metodzie Western-blot można używać jednego przeciwciała związanego ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał - nieznakowanego, przeciwko wykrywanemu białku (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz znakowanego, przeciwko danemu izotypowi immunoglobulin (przeciwciała drugorzędowe; metoda pośrednia).

Przeciwciała są znakowane zwykle enzymem (np. peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), fluorochromem lub izotopem radioaktywnym. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję. W przypadku stosowania wizualizacji przez luminescencję lub stosowanie izotopów, obraz otrzymuje się przez przyłożenie membrany do kliszy fotograficznej.

Elektroforeza

[edytuj]

Z Wikipedii

Skocz do: nawigacji, szukaj

Aparat do pionowej elektroforezy żelowej

Aparat do poziomej elektroforezy żelowej

Elektroforeza - technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.

Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniu wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.

Istnieje wiele wariantów tej techniki. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział wyróżnić można elektroforezę bibułową (dziś już przestarzałą i praktycznie nie używaną), żelową i kapilarną.

Spis treści [ukryj] 1 Elektroforeza żelowa 2 Elektroforeza kapilarna 3 Zobacz też 4 Przypisy

Elektroforeza żelowa [edytuj]

W elektroforezie żelowej ośrodkiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agarozy, poliakrylamidów^[1], agaru lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu - kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku milimetrów (rzadziej jest to słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu - studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (np. w formamidzie), dzięki czemu rozpływa sie na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną, elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne rzędu 50-3000 V. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki w oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tzw. markery) o znanej mobilności elektroforetycznej.

Fragment żelu poliakrylamidowego z oligonukleotydami analizowanymi w świetle UV. Elektroforeza przebiegała od góry ku dołowi. Poszczególne ścieżki obrazują proces przyłączania barwnika fluorescencyjnego, co zmieniało mobilność oligomerów i ich własności spektroskopowe.
BP, XC - markery.
Ścieżki A - C: absorpcja przy 254 nm;
D: fluorescencja przy 366 nm

Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź obserwację absorpcji światła (zazwyczaj UV) przez żel. Wizualizację elektroforegramów preparatów znakowanych izotopowo uzyskuje się przez zaczernienie kliszy fotograficznej (autoradiogram). W przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje procesowi elucji.

Elektroforeza jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek lub syntetycznych. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).

Z poziomu molekularnego elektroforeza polega na ukierunkowanym przesuwaniu analizowanych cząsteczek przez prąd i ich interakcji z fazą stałą żelu, która w tej cząsteczkowej skali wygląda jak przestrzenna sieć. Bardziej ruchliwe są mniejsze cząsteczki bo łatwiej się przeciskają przez tą sieć, większe się opóźniają. Plusowy prąd uruchamia te które 'utknęły' po drodze i daje lepszej jakości rozdział.

Przykładowe markery do elektroforezy

• błękit bromofenolowy (BP)

• cyjanol ksylenowy (XC)

• oranż G.

Przykładowe substancje wybarwiające żel

• bromek etydyny

• coomassie blue

• srebro

• stains-all

Elektroforegram CE syntetycznego oligonukleotydu

Elektroforeza kapilarna [edytuj]

Elektroforeza kapilarna (CE, od ang. Capillary Electrophoresis), zwana też elektroforezą w wolnym buforze służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jak HPLC). Metoda ta jest często stosowana w biologii molekularnej do analizy DNA, znacznie rzadziej do rozdziału peptydów. Rozdział mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0.5-1 m) kapilarze kwarcowej, przypominającej z wyglądu światłowód. Kapilara ta wypełniana jest buforem.

Próbka wprowadzana jest do wlotu kapilary, po czym jest do niej przykładane wysokie napięcie elektryczne (do 30 kV). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor, który rejestruje wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z elektrod. Dla układu wodnego jest to zwykle katoda.

Technika ta umożliwia rozdzielanie anionów i kationów soli organicznych i nieorganicznych.

Odmianą elektroforezy kapilarnej jest micelarna elektrokinetochromatografia (MEKC). W tej technice w buforze rozdziałowym znajduje się rozpuszczony detergent jonowy (np. dodecylosiarczan sodu - SDS) w takim stężeniu, aby tworzyć trwałą emulsję. Emulsja ta składa się z miceli, które są hydrofobowe wewnątrz i naładowane elektrycznie na swojej powierzchni.

Micele te dzięki swemu ładunkowi poruszają się z inną prędkością niż reszta buforu, a w ich wnętrzach zamknięte są cząsteczki związków chemicznych tworzących analizowaną mieszaninę. Pozwala to rozdzielać związki chemiczne, które nie przyjmują ładunku elektrycznego nawet po przyłożeniu dużego napięcia. Metoda ta umożliwia rozdział i analizę niemal wszystkich związków chemicznych rozpuszczalnych w wodzie.