Metoda western blot

Metoda detekcji konkretnych białek w homogenacie komórkowym lub ekstrakcie białkowym poprzez ich rozdział elektroforetyczny, unieruchomienie na membranie i wykorzystanie odpowiednich przeciwciał. Testy Western blot pozwalają potwierdzić zakażenie w przypadku testów przesiewowych o specyficzności mniejszej niż 100%. Wśród badań serologicznych możemy wyróżnić badanie odczynów oraz badanie specyficznych przeciwciał. Te pierwsze pozwalają określić występowanie przeciwciał, co do których nie mamy wiedzy, do jakiej klasy należą, np. odczyn lateksowy w przebiegu mononukleozy zakaźnej. Te drugie badania tak zwanych specyficznych przeciwciał obejmują wykrywanie przeciwciał w klasach IgM (przeciwciała wczesne) oraz w klasie IgG (przeciwciała późne). Często badamy również przeciwciała w klasie IgA oraz coraz częściej w klasie IgE. Przeciwciała klasy IgM utrzymują się krótkotrwale, zwykle do 6 miesięcy. Natomiast przeciwciała klasy IgG utrzymują się bardzo długo, niekiedy przez całe życie! Częstym błędem w diagnostyce przeciwciał IgM jest błędna interpretacja czasu ich utrzymywania się w surowicy.
W przebiegu niektórych schorzeń jako choroba kociego pazura mogą utrzymywać się bardzo krótko, więc podczas diagnostyki bartonelozy możemy ich już nie wykryć mimo prowadzenia badań jeszcze w fazie ostrej zakażenia. Z kolei w przebiegu toksoplazmozy przeciwciała IgM mogą utrzymywać się ponad 6 miesięcy, a nawet przez 12 miesięcy, co sugerowałoby występowanie świeżego zakażenia, a takim w ogóle to zakażenie może nie być, często niepotrzebnie wzbudzając niepokój ciężarnej. Przeciw ciała klasy IgA, podobnie jak IgM, pojawiają się na krótko po zakażeniu, ale – w przeciwieństwie do IgM – pojawiają się również przy powtórnych kontaktach z antygenem (np. w przypadku reinfekcji pałeczką krztuśca po zaniku odporności poszczepiennej) albo po reaktywacji drobnoustroju. W przypadku przeciwciał klasy IgG bardzo ważnym elementem interpretacji jest obserwacja ich stężenia lub miana. Znane jest zjawisko zamiennego zwiększenia miana przeciwciał, które ma być stwierdzone w dwóch próbkach surowicy pobranych w odstępie 2 tygodni i być przynajmniej czterokrotne.

Materiałem do badań może być dowolny materiał biologiczny – wyizolowane komórki, fragmenty tkanek zwierzęcych i ludzkich, tkanki roślinne, ekstrakty komórkowe. Mogą być to zarówno próbki świeżo izolowane, jak i mrożone lub utrwalone w parafinie.

Pierwszym etapem procedury jest uwolnienie białek komórkowych z preparatu. W tym celu stosuje się metody mechaniczne jak homogenizacje w moździerzu, odpowiednim homogenizatorze lub młynku oraz odpowiednie bufory zawierające detergenty (np. Triton X100 lub SDS) a także związki chelatujące jony (jak EDTA). Niekiedy zamiast wszystkich białek komórkowych bada się jedynie te pozyskane z błon lub wybranych frakcji organellowych. W tym celu przeprowadza się odpowiednie procedury ich izolacji. Uzyskane w ten sposób homogenaty lub ekstrakty białkowe są rozdzielane metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym (zwykle w warunkach denaturujących w żelu zawierającym SDS). Dzięki temu uzyskujemy rozdział wszystkich białek ekstraktu na podstawie ich masy cząsteczkowej.

Następnym etapem jest ich transfer na odpowiednią membranę która wykonaną z nitrocelulozy lub PVDF .

Transfer ten ma na celu lepszą identyfikację cząsteczek technikami immunobarwienia oraz ułatwienie pracy ponieważ membrana jest bardziej odporna na uszkodzenia mechaniczne niż żel. Elektrotransfer polega na przeniesieniu ujemnie naładowanych białek z żelu na membranę, pod wpływem przyłożonego napięcia prądu. Białka migrują w kierunku dodatniej elektrody i zostają zatrzymane na membranie umieszczonej za żelem co przedstawiono na rysunku.

Kolejnym krokiem jest tak zwane blokowanie, czyli zabezpieczenie membrany przed niespecyficznym wiązaniem się do niej przeciwciał. Efekt ten otrzymuje się przez inkubację w roztworze albuminy z surowicy wołowej lub odtłuszczonego mleka oraz detergentu Tween

Po zakończeniu blokowania można przystąpić do inkubacji membrany w roztworze przeciwciał. Zwykle stosuje się dwa przeciwciała.

Pierwsze to tak zwane przeciwciało pierwszorzędowe, wiążące się specyficznie do poszukiwanego białka. Jego nadmiar należy usunąć przez odpłukanie odpowiednim buforem.

Następnie podaje się roztwór drugiego przeciwciała, zwanego drugorzędowym, mającym powinowactwo do globuliny zwierzęcia z którego pochodzi przeciwciało pierwszorzędowe.

[niekiedy wykonuje się przedtem powtórne blokowaniu niespecyficznych miejsc wiążących na membranie]

Wiąże się ono z przeciwciałem pierwszorzędowym a samo jest znakowane umożliwia jego detekcję

[należy jednak wspomnieć, że możliwa jest także wyznakowanie i detekcja przeciwciała pierwszorzędowego, choć wariant taki stosuje się rzadziej]

Elementem znakującym zwykle jest enzym katalizujący (po dodaniu odpowiedniego substratu) reakcję dającą efekt chemiluminescencji lub reakcję barwną. Przeciwciało może być również znakowane radioaktywnie lub barwnikiem fluorescencyjnym. W przypadku reakcji chemiluminescencyjnych i znakowania izotopami promieniotwórczymi wynik procedury można zaobserwować na odpowiedniej kliszy. Jeśli próba wyznakowana jest enzymem dającym efekt barwny to wynik ten jest widoczny bezpośrednio na membranie, natomiast wynik uzyskany przy użyciu fluorochromu można obserwować za pomocą odpowiedniego sensora (np. kamery CCD). Należy wspomnieć, że często wykonuje się wariant tej techniki w którym bada się nie to czy dane białko znajduje się w badanym materiale, lecz czy w badanej surowicy znajdują się przeciwciała skierowane przeciwko antygenom związanym np. z poszukiwanym przez nas „zarazkiem” (przeciwciała z badanej surowicy traktuje się tu jako odpowiednik przeciwciał pierwszorzędowych).

Zarówno w nauce jak i medycynie metoda western blot szybko znalazła liczne zastosowania. Immunobloting stosuje się w diagnostyce chorób bakteryjnych, jak borelioza wywoływana przez krętka Borelia burgdorferi, gruźlica wywoływana przez prątki Mycobacterium tuberculosis. Technika ta może być również wykorzystywana w diagnostyce zakażeń wirusami, jak np. HIV, koronawirus wywołujący SARS czy wirus HSV będący czynnikiem etiologicznym opryszczki. Metodą western blot można również wykryć niektóre choroby pasożytnicze, jak wągrzyca spowodowana przez larwy tasiemca uzbrojonego, a nawet choroby genetyczne, jak pewne formy niedokrwistości Fanconiego. Dane literaturowe wskazują, że możliwe jest również zastosowanie tej techniki w diagnostyce nowotworów, co dowodzi niezwykłej użyteczności i wszechstronnych możliwości jej wykorzystania.