ANALIZA INSTRUMENTALNA

Temat ćwiczenia: Spektrofotometria UV/VIS. Zastosowanie spektrofotometrii w Biochemii.

Celem wykonywanego ćwiczenia jest zbadanie widma aminokwasu – Fenyloalaniny oraz określenie jak budowa aminokwasu wpływa na kształt jego widma.

Wstęp teoretyczny:

Spektrofotometria to badanie właściwości optycznych ciał, które zależą od ich budowy.

Absorpcja( inna nazwa to ekstynkcja), to jedna z właściwości optycznych, polegająca na pochłanianiu światła.

Widmo- zależność absorpcji od długości fali.

W zakresie VIS( światła widzialnego) i UV za absorpcję światła w cząsteczkach biologicznych odpowiadają elektrony walencyjne z wiązań wielokrotnych. Właściwości absorpcyjne mają tylko te związki chemiczne, które w budowie mają wiązania wielokrotne.

Grupa chromoforowa- grupa atomów w obrębie cząsteczki posiadająca wiązania wielokrotne i uczestnicząca w ekstynkcji światła np. C=C, C=O, C=N, wszelkie pierścienie purynowe itp.

Grupa auksochromowa- same nie uczestniczą w absorpcji światła, ale jeśli znajdują się w pobliżu grupy chromoforowej powodują dodatkowe wzmocnienie właściwości absorpcyjnych cząsteczki, np.: wszelkie podstawniki OH,Cl, NH₂, CH₃ .

Osłabienie wiązki światła padającego na warstwę roztworu jest wprost proporcjonalne do grubości tej warstwy oraz stężenia roztworu i zależy od rodzaju związku w roztworze.

- dI/I= kdx*c , gdzie

-dI/I – dowolne osłabienie

k – współczynnik charakteryzujący właściwości absorpcyjne związku

dx – grubość warstwy

c – stężenie

Po przejściu przez kuwetę sumujemy osłabienia we wszystkich warstwach, co w efekcie daje wzór na absorbancję:

logI_o/I_w=E _m* c* l , gdzie E _m to molowy współczynnik absorpcji

logI_o/I_{w =} A ; a więc :

A = E _m* c* l - PRAWO LAMBERTA-BEERA

Absorbancja światła monochromatycznego jest wprost proporcjonalna do grubości warstwy i stężenia roztworu.

Wielkością mierzoną w spektrofotometrii jest absorbancja( wielkość bezwymiarowa).

Molowy współczynnik absorpcji co do wartości równa się absorbancji roztworu 1-molowego w kuwecie 1-centymetrowej.

Odstępstwa od tego prawa:

- cząsteczki badanej substancji oddziałują ze sobą lub z cząsteczkami rozpuszczalnika

- zachodzi rozkład lub polimeryzacja substancji

- tworzą się pary jonowe lub wiązania wodorowe

- tworzenie się dimerów

- substancja rozprasza światło lub wykazuje fluorescencję

- ograniczenia aparaturowe.

Do wykonania ćwiczenia korzystamy z prawa Lamberta- Beera.

Przebieg ćwiczenia:

Odważamy ok.20mg Fenyloalaniny (18,7mg).

Dokonujemy obliczeń, by uzyskać stężenie molowe aminokwasu : 0,113 mol/dm^3.

Metodą kolejnych rozcieńczeń uzyskujemy następujące stężenia: 0,056 mol/dm³; 0,028 mol/dm^3.

Następnie przy użyciu spektrofotometru wyznaczamy molowe współczynniki absorpcji, które równe są: 178,23; 194,28; 222,857.

Uzyskane wyniki porównujemy z wartościami tablicowymi oraz sprawdzamy ich zgodność z prawem Lamberta-Beera.

Na wykresie przedstawiamy zależność absorpcji od stężenia.

Obliczenia:

PHE:Masa molowa: 165,19

165,19 g - 1 mol

0,0187g - x mol

______________________

x = 0,000113 mol

10cm³ - 0,00013 mol

1000cm³ - x mol

______________________

c1 = 0,0113 mol/dm³ C1: 0,0113 mol/dm³

Początkowa długość fali: 200

Końcowa długość fali:400

Skala:20nm

Prędkość:

Uśrednienie:600 nm/min

MinA:0

MaxA:3

Zmieniamy początkowa i końcową długość fali: 240-280

Skala:5nm

c2 = 1/2 c1 = 0,056 mol/dm³

MaxA=257,7nm

A=1,088nm

c3 = 1/2 c2 = 0,028 mol/dm³

MaxA=257,7nm

A=257,7nm

Em= A/cxl

Em1 = 2,014/ 0,0113 = 17,823

Em2 = 1,088/ 0,056 = 19,428

Em3 = 0,624/ 0,028 = 22,28

Błędy eksperymentalne:

-niezmieniony tips

Wnioski:

Wartości tablicowe:

Phe

Em= 0,22 lub 222 l/mol xcm