ĆWICZENIE 2
BUDOWA I FUNKCJE ENZYMÓW. ZASTOSOWANIE BADAŃ ENZYMATYCZNYCH W INŻYNIERII ŚRODOWISKA.
Zagadnienia szczegółowe:
budowa i mechanizm działania enzymów; kinetyka reakcji enzymatycznych; stała Michaelisa;
regulacja aktywności enzymatycznej; inhibitory enzymów; enzymy allosteryczne –
mechanizm działania; wpływ czynników zewnętrznych na aktywność enzymatyczną (pH,
temp.); jednostka aktywności enzymatycznej; podstawowe typy enzymów i rodzaje
katalizowanych przez nie reakcji; dehydrogenazy; test TTC – zasada i sposób wykonania
testu; metody wykrywania aktywności katalazowej, oksydazowej, ureazowej i
proteolitycznej.
Literatura zalecana:
Pawlaczyk-Szpilowa M.: Biologia i ekologia, Oficyna Wyd. Polit. Wroc., str.: 142-156.
Zad. 1. Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej osadu czynnego testem TTC. Badanie
wpływu czynników fizycznych i chemicznych na aktywność enzymatyczną (temperatura, pH,
związki toksyczne)
a. Badanie aktywności dehydrogenazowej w temp.10°C, 37 °C , 45°C i 100°C.
Do czterech probówek wlać pipetą po 1 cm3 buforu Tris o pH 8,4 i po 1 cm3 osadu
czynnego. Opisać probówki następująco: 10°C, 37 °C, 45°C i 100°C. Jedną z probówek
wstawić na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 100°C, po czym schłodzić w strumieniu wody
z kranu do temp. pokojowej. Następnie do wszystkich 4 probówek wprowadzić pipetą 0,4 cm3
roztworu TTC i umieścić probówkę „10°C ” w lodówce, probówki: „37°C” i „100°C”
w termostacie o temp. 37°C i probówkę „45°C” w łaźni wodnej o temp.45°C. Próby
pozostawić na 30 min.
b. Badanie aktywności dehydrogenazowej w odczynie o pH: 5; 8,4 i 10.
Opisać 3 probówki następująco: „pH 5”, pH 8,4” i „pH 10”. Do probówek wlać pipetą
odpowiednio po 1 cm3 buforu o pH: 5, 8,4 i 10. Następnie do wszystkich 3 probówek wlać po
1 cm3 osadu czynnego i po 0,4 cm3 roztworu TTC. Próby umieścić na 30 min. w termostacie
o temp. 37°C.
c. Badanie wpływu substancji toksycznej (octan ołowiu) na aktywność enzymatyczną.
Opisać 2 probówki następująco: „Pb” i „K” (kontrola).Do obu probówek wprowadzić
pipetą po 1 cm3 osadu czynnego. Następnie do probówki „Pb” wprowadzić 1 cm3 15%
roztworu octanu ołowiu (uwaga: TRUCIZNA !, używać pipety z gruszką) a do probówki „K”
1 cm3 buforu Tris o pH 8,4. Do obu probówek dodać po 0,4 cm3 r-u TTC. Próby inkubować
w temp. 37°C przez 30 min.
Po 30 min. inkubacji prób wg a, b i c, należy je przesączyć przez sączek bibułowy
i zmierzyć ekstynkcję przy długości fali l = 490 nm. Korzystając z krzywej kalibracyjnej dla
TF (produktu redukcji TTC) i wyników pomiarów spektrofotometrycznych prób badanych,
należy określić aktywność dehydrogenazową 1 cm3 osadu czynnego w badanych warunkach.
Aktywność wyrazić w Katalach na 1 cm3 ; 1Katal (Kat) odpowiada aktywności enzymu
zdolnej przekształcić 1mol substratu w produkt w ciągu 1 sekundy, czyli 1Kat = 1mol/s.
Określić wpływ badanych czynników na aktywność dehydrogenazową osadu czynnego.
Zad. 2. Wykrywanie aktywności katalazowej.
a. Osad czynny.
Do 2 probówek wprowadzić po 1 cm3 osadu czynnego. Jedną probówkę, opisaną „K”,
włożyć na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 100°C, po czym schłodzić w strumieniu wody
z kranu do temp. pokojowej. Następnie do obu probówek wprowadzić po 0,5 cm3 roztworu
H2O2 i obserwować pojawiające się zmiany.
b. Hodowle wybranych szczepów bakteryjnych na skosach agarowych.
Na powierzchnię skosu agarowego z kulturą bakterii wlać sterylnie 0,5 cm3 roztworu
H2O2 i obserwować pojawiające się zmiany. Wyjaśnić obserwowane zjawisko.
Zad. 3. Wykrywanie aktywności oksydazowej.
Do 2 probówek wlać po 2 cm3 osadu czynnego. Jedną probówkę wstawić do łaźni
z wrzącą wodą na 5 min., a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Do obu probówek wlać
po 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny. Próby inkubować w temp. 40°C przez 1godz.
Pojawienie się brunatnej barwy świadczy o aktywności oksydazowej próby.
Zad. 4. Wykrywanie aktywności ureazowej na podłożu mocznikowym.
Wprowadzić ezą próbkę osadu czynnego do pożywki. Inkubować w temp. 37°C przez 48
godz. W przypadku aktywności ureazowej pożywka zmieni kolor na amarantowy.
Zad. 5. Wykrywanie aktywności proteolitycznej
a. Określenie miana drobnoustrojów proteolitycznych osadu na pożywce z kazeinianem
potasu.
Miano jest to najmniejsza objętość próby, w której znajdują się drobnoustroje o
badanej aktywności (tu - proteolitycznej). Aby określić miano należy wykonać szereg
rozcieńczeń osadu w sterylnym roztworze fizjologicznym (0,1% NaCl) i uzyskane
rozcieńczenia posiać na podłoże z kazeinianem sodu. Próby inkubować 48 godz. w temp.
37°C. Na miano wskazuje największe rozcieńczenie, przy którym stwierdza się odbarwienia
w pożywce.
b. Posiew metodą kłutą na słupek żelatynowy.
Po tygodniu inkubacji w temp. 200C sprawdzić, czy żelatyna uległa upłynnieniu w wyniku proteolizy.