II. Zdolności regeneracyjne i naprawcze organizmów na różnych etapach rozwoju ewolucyjnego i ich biologiczne podstawy
Regeneracja – zdolność do odtwarzania utraconych bądź uszkodzonych części ciała, narząó, tkanek lub komórek.
Wraz z rozwojem ewolucyjnym zwierząt organizm traci zdolność do regeneracji.
Czy to zjawisko spowodowane jest wyższym poziomem kompliokacji organizmu?
Czy w wyniku adaptacji do warunków życia utraciliśmy zdolność do regeneracji?
U kręgowców głównym sposobem gojenia jest bliznowacenie. Tkanka bliznowata szybko ogranicza miejsce urazu. Zapobiega rozprzestrzenianiu się zakażenia. W świecie zwierząt wyższych zdolność do regeneracji jest ograniczona do poszczególnych narządów lub tkanek. Regenerują się narządy i tkanki, które często ulegają uszkodzeniu lub zużyciu, np. wątroba lub kość.
Mechanizm regeneracji – obecność nisz z komórkami macierzystymi czy dedyferencjacja dojrzałych komórek po urazie?
Gąbki – posiadają pełną zdolność do regeneracji całego organizmu z konglomeratu komórek.
Jamochłony – stułbia posiada pełną zdolność do regeneracji organizmu, komóki totipotencjalne zlokalizowane są w całym organizmie.
Robaki płaskie – 30% dorosłego organizmu zbudowane jest z totipotencjalnych komórek embrionalnych, np. u planaria. Zdolność do regeneeracji odcinka głowowego i ogona z każdego elementu ciałą w ciągu dziesięciu dni. Zawsze zachowana polaryzacja organizmu.
Mechanizm: geny odpowiedzialne za formowanie odcinka głowowego lub ogona są wyciszane na drodze interferencji RNA. Proces ten regulowany jest przez szlak Hedgehog oraz Wnt/beta-katenina. Są to szlaki receptorowe regulujące ekspresję białek. Oba szlaki regulują /nieczytelne, rozmazane/ u ssaków.
Pozostałe bezkręgowce – stawonogi: regeneracja kończyn u pająków i krabów; szkarłupnie: regenarcja ciała rozgwiazdy z pojedynczego ramienia lub dysku centralnego.
Regeneracja:
- jest obecna u wszystkich przedstawicieli bezkręgowców
Czemu stopniowo zanika u kręgowców ?
- polaryzacja ciała
- wielkość ciała
- specjalizacja części ciała
Ryby:
- zebrafish-Danio pręgowany , słodkowodna ryba z rodziny karpiowatych
Mechanizm: (hipotezy)
- dedyferencja komórek po urazie i formowanie pierwotnej mezenchymy
- obecność nisz z komórkami totipotencjalnymi
- komórki somatyczne w trakcie cyklu komórkowego przechodzą etap podczas którego są totipotencjalne
Płazy i Gady
Zdolność do regeneracji:
- konczyn
- oczu
- ogona
- fragmentów ciała w okresie dojrzewania
Mechanizm regeneracji
Etapy regeneracji konczyn salamandry:
- nabłonek pokrywa miejsce amputacji
- formuje się blastema
BLASTEMA – heterogenna populacja komórek totipotenclanych zdolncyh do różnicowania się we wszystkie tkanki budujące konczyne.
Blastema in vitro:
Chrząstka
Kość
Mięśnie
Blastema- komórki blastemy przypominają komórki tkanki łącznej ssaków- miofibroblasty
Ssaki Najwyższy poziom rozwoju filogenetycznegonajmniejsze zdolności do regeneracji
Ssaki Zdolność do regeneracji zanika wraz z rozwojem osobniczym
-Noworodki torbaczy posiadają częściową zdolność do regeneracji rdzenia kręgowego po poprzecznym przecięciu
-Gojenie się beż blizny ran ciętych skóry u młodych szczurów
-Regeneracja opuszek palców u dzieci do lat 10.
-Regeneracja części palca po amputacji u dzieci do lat 2
W 1979 Rowlatt zaobserwowal, że we wczesnym okresie ciąży rana skóry płodu goi się przez regenerację, z odtworzeniem prawidłowej architektury tkanki.
Dopiero pod koniec rozwoju płodowego (między 2 a 3 trymestrem) dochodzi do zmiany sposobu gojenia z bezbliznowego na typowe dla okresu pourodzeniowego
W 3 trymestrze ciąży proces gojenia zmienia się w typowy dla skóry dojrzałej
Istnieje hipoteza, że rozwiniety układ immunologiczny ssaków przejmuje kontrole nad gojeniem i kierunkuje go w bliznowacenie.
U człowieka zdolności regeneracyjne posiadaja:
Kosci
Mięśnie
Komórki nerwowe
Nabłonek
Tarczyca
Gr. nadnerczowy
Wątroba
regeneracja dotyczy tylko niewielkich urazów i nie jest kompleksowa.
Defense Advances research Project agency
Program regeneracji kończyny u człowieka- defence scence Office
Sukces pierwszej fazy badania. Udało się uzyskać blasteme u człowieka.
Obecnie badania w drugiej fazie.
III. ZASADY INŻYNIERII TKANKOWEJ
INŻYNIERIA
BIOMATERIAŁY
BIOMECHANIKA
OBRAZOWANIE BIOMEDYCZNE
Etc
NAUKI O ŻYCIU
HODOWLA KOMÓREK/ TKANEK
BIOLOGIA ROZWOJU
BIOLOGIA MOLEKULARNA
CHIRURGIA TRANSPLANTACYJNA
Etc
Inżynieria tkankowa jest nową interdyscyplinarną dziedziną wykorzystującą podstawy inżynierii materiałów, biologii oraz medycyny celem stworzenia biologicznych substytutów, które odtworzą , podtrzymają lub poprawią funkcjonowanie uszkodzonej tkanki.
METODY REGENERACJI TKANEK
1.wszczepienie komórek
2. wszczepienie rusztowania
ZASADY INŻYNIERII TKANKOWEJ
Biopsja tkanki
Izolacja i hodowla komórek
Wysianie komórek na biomateriał
Hodowla komórek na biomateriale
Wszczepienie graftu
TYPY KOMÓREK WYKORZYSTYWANYCH W INŻYNIERII TKANKOWEJ
Komórki zróżnicowane
Komórki macierzyste
Komórki autologiczne
Komórki allogeniczne
Komórki izogeniczne
Komórki ksenogeniczne
BIOMATERIAŁY
Naturalne
Sztuczne
Kompozyty
Biodegradowalne
Niedegradowane
ELEKTROPRZĘDZENIE- proces otrzymywania włókien ze stopionych polimerów lub ich roztworów z zastosowaniem wysokiego napięcia. Powstające włókna mają średnicę od kilku nm do kilku mm.
IV. Komórki macierzyste „stem cells”
Trochę historii…
Obecność niehematopoetycznych komórek w szpiku kostnym zasugerował Conheim na podstawie obserwacji gojenia ran.
Conheim, 1876
Termin „komórka pnia” został zaproponowany przez Maksimova.
Maksimov, 1908
Obecność komórek multipotencjalnych w szpiku udowodnił Friedenstein.
Friedenstein, 1976.
Caplan nazwał te komórki mezenchymalnymi komórkami pnia.
Caplan, 1991.
Komórki macierzyste – definicja
Niskozróżnicowane komórki zdolne do samoodnowy i różnicowania w komórki potomne.
Loeffler & Roeder, 2002
Nie ma jednoznacznej definicji komórki macierzystej.
Ringe et al., 2002
KOMÓRKI MACIERZYSTE – WŁAŚCIWOŚCI
Samoodnowa – polega na przechodzeniu wielokrotnych podziałów komórkowych i pozostawaniu w stanie niezróżnicowanym.
Potencjał do różnicowania – polega na zdolności do tworzenia wyspecjalizowanych typów komórek.
Self Renewal
Stem Cell------- Mature Cell
Diferentiation
W jaki sposób dzielą się komórki macierzyste? Hipotezy
Symmetric self-renewal Proliferation and Maintenance of developmental potential S S S Result: increase in stem cell pool, no generation of differentiated progeny |
Asymmetric self-renewal Proliferation and Maintenance of developmental potential S S P Result: maintenance of stem cell pool, generation of differentiated progeny |
Lack of self-renewal Proliferation and Maintenance of developmental potential S P P Result: depletion of stem cell pool, generation of differentiated progeny |
Lack of self-renewal Proliferation and Maintenance of developmental potential S Result: maintenance of stem cell pool, no generation of differentiated progeny |
|---|
KOMÓRKA MACIERZYSTA – DOMOWNIK NISZY CZY WĘDROWIEC?
- Komórki macierzyste zasiedlają odpowiednie miejsca w tkankach zwane niszami komórek macierzystych
- Nisza komórki macierzystej jest miejscem, w którym komórki te utrzymują się w stanie gotowości do podziału komórkowego stają się aktywne w czasie gojenia i regeneracji tkanek.
Nisze komórek macierzystych:
W mieszku włosowym znajduje się w wybrzuszeniu mieszka (ang. folicular bulge)
Nisz komórek macierzystych keratynocytów znajduje się w warstwie podstawowej (ang. basal keratinocytes)
Klasyfikacja komórek macierzystych:
- komórki totipotencjalne- mają zdolność różnicowania się w komórki zdolne do zbudowania całego organizmu (zygota <4dni)
- komórki pluripotencjalne- (komórki moruli, węzła zarodkowego blastocysty oraz epiblastu) mogą różnicować się w komórki pochodzące ze wszystkich trzech listków zarodkowych
Opisy do zdjęć co po kolei powstaje: oocyt, zygota, stadium 4-komórkowe moruli, stadium 8-komórkowe moruli, morula, blastula.
- komórki multipotencjalne- mają zdolność do różnicowania się w linie komórkowe specyficzne dla danego listka zarodkowego
- komórki unipotencjalne- zdolne do różnicowania w jeden zdefiniowany typ komórek
Zarówno komórki multipotencjalne jak i unipotencjalne można wyizolować z tkanek organizmów dojrzałych i często określa się je wspólnym terminem ang. adult stem cells.
Komórki macierzyste pochodzenia endodermalnego: epitelialne płuc, przewodu pokarmowego, trzustki, owalne wątroby, komórki gruczołu piersiowego, urogenitalne (stercza, jajników, jądrowe).
Komórki macierzyste pochodzenia mezodermalnego: szpiku kostnego- hematopoetyczne, zrębu (mezenchymalne) mięśnia sercowego, mięśni szkieletowych i gładkich.
Komórki macierzyste pochodzenia ektodermalnego: neuronalne, naskórkowe (mieszków włosowych i naskórka), rogówki, siatkówki.
KOMÓRKI MACIERZYSTE
ZARODKOWE PŁODOWE DOROSŁEGO ORGANIZMU
-krew pępowinowa ROZRODCZE SOMATYCZNE
- płyn owodniowy -neuronalne
- łożysko, etc. - wątroby
- epidermalne
- mezenchymalne (zrąb szpiku kostnego)
-hematopoetyczne
(szpik kostny, krew
obwodowa)
KREW PĘPOWINOWA
Stanowi bogate źródło komórek macierzystych:
Hematopoietic Stem Cells – HSCs (głównie)
Mesenchymal Stem Cells- MSCs
Very Small Embryonic- Like Stem Cells – VSEL-(wykazujące ekspresję markerów pluripotencjalnych:Oct-4, Sox-2, Nanog)
Inne
UNIKALNE WŁAŚCIWOŚCI KOMÓREK MACIERZYSTYCH KRWI PĘPOWINOWEJ
Bardziej pierwotne i mniej ukierunkowane aniżeli komórki macierzyste z dorosłego organizmu
Większa zdolność do namnażania się
Mała dojrzałość immunologiczna
Komórki macierzyste krwi pępowinowej
Zastosowanie własnych zamrożonych komórek macierzystych eliminuje długotrwałe poszukiwania odpowiedniego dawcy, jak również ryzyko wystąpienia powikłań i nietolerancji po przeszczepie
Trochę historii..
Już w 1972 r. krew pępowinową podano 16-letniemu pacjentowi choremu na białaczkę (kilka tygodni później we krwi chłopca wykryto erytrocyty wywodzące się z komórek macierzystych dawcy)
1988r. w Paryżu wykonano transplantację krwi pępowinowej u dziecka chorego na anemię typu Fanconiego ( krew pochodziła od siostry).
BANKOWANIE KRWI PĘPOWINOWEJ W POLSCE
Lata 90-te to pierwsze próby bankowania krwi pępowinowej.
1993r. pierwszy udany przeszczep krwi pępowinowej chłopcu choremu na białaczkę limfoblastyczną (krew pochodziła od nowonarodzonej siostry chłopca).
Zdj. Pobranie krwi pępowinowej
Krew pępowinowa zostaje poddana preparatyce( w okresie nie przekraczającym 24 h)
Preparatyka krwi pępowinowej to proces wieloetapowy
PREPARATYKA KRWI PĘPOWINOWEJ
Określenie objętości pobranej krwi pępowinowej
Sedymentacja ( komórki jądrzaste zostają oddzielone od erytrocytów)
Zagęszczenie ( poprzez wirowanie)
BADANIE KRWI
Krew pępowinową poddaje się badaniom:
Zawartość komórek macierzystych
Posiew bakteriologiczny
Zawartość leukocytów
Morfologia ( przed i po preparatyce)
MROŻENIE KRWI PĘPOWINOWEJ
Dodanie krioprotektanta (np. DMSO SO(CH3)- zapobiega uszkodzeniom komórek w czasie mrożenia i przechowywania
PRZECHOWYWANIE
Koncentrat komórek macierzystych zamraża się w pojemnikach z ciekłym azotem
BANKI KRWI PEPOWINOWEJ - W PoIsce dziala 8 komercyjnych banków kwi pępowinowej. Tylko 3 państwowe banki kiwi pępowinowej
.KOSZTY : Pobranie krwi pępowinowej –ok. 3000 zlPrzechowywnieok. 350 zl rok
Bankowanie, agumenty na tak:
Natychmiastowa dostępność komérek.
Mniejsze ryzyko odrzucenia przeszczepu.
Mniejsze ryzyko wystąpienia choroby „przeszczep przeciw gospodarzowi”.
Ze wzglgdu na mniejszq dojrzałość immunologiczną komórek macierzystych krwi pępowinowej łatwiej jest znaleść odpowiedniego dawcę.
Metoda ta nie budzi wątpliwoéci natury etycznej.
BANKOWANIE- NIE!
Prawdopodobieństwo wykorzystania zdeponowanej krwi u własnego dziecka jest bardzo małe. 1: 10 000, 1:200 000.Do tej pory odnotowano około 20 przypadków na świecie wykorzystania krwi pępowinowej na własne potrzeby
BANKOWANIE- NIE!
Nie ma informacji potwierdzających przechowywanie komórek macierzystych dłużej niz 16 lat.
Zakażenia bakteryjne.
BANKOWANIE- NIE!
ilść lkomórek z krwi macierzystej jest niewielka. Leczenie autologicznymi (własnymi) komórkami nie zawsze jest wskazane. Nie ma pewnośći, iż banki krwi pęp. stosują skuteczne techniki zamrażania.
Transplantacja szpiku kostnego – zabieg polegający na wprowadzeniu zdrowego szpiku w miejsce przekształconego nowotworowo (białaczki) lub wadliwie funkcjonującego (aplazje, wrodzone niedobory odporności, zaburzenia metaboliczne). Za pierwsze trwałe udane przeszczepy w białaczkach (1970) w roku 1990 Nobla otrzymał E.Donall Thomas.
Zabieg przeszczepienia szpiku jest zabiegiem z zakresu inżynierii komórkowej. Przeszczepione komórki mają utworzyć narząd jakim jest szpik kostny. Największą trudnością jest przeprowadzenie biorcy przez okres aplazji szpiku (czyli okres, w którym w ogranizmie biorcy nie ma leukocytów, a także płytek krwi).
Do czynników warunkujących przyjęcie przeszczepu należą :
wystarczajaca liczba komórek macierzystych,
dostępność „gniazd” dla komórek macierzystych,
zgodnosć tkankowa (HLA) dawcy i biorcy (GVHD vs odrzucenie).
Źródła komórek krwiotwórczych :
szpik kostny (komórki hematopoetyczne i mezenchymalne) BMT,
krew obwodowa (można, ale trzeba je zmobilizować, czyli przemieścić ze szpiku)PBSCT
krew pępowinowa (mało komórek) CBT
wątroba płodowa (trudno dostępny materiał)
Krwiotwórcze komórki macierzyste : somatyczne komórki macierzyste zdolne wytworzyć wszystkie komórki krwi, występują w ilości 1/25 -100 tys komórek szpiku, ich przeszczepienie jest istotą wszystkich zabiegów przeszczepiania komórek krwiotwórczych. Charakterystyka ; CD34, CD133, Lin-, C-kit, BCRP
Wskazania do przeszczepiania komórek krwiotwórczych
Hematologiczne choroby nowotworowe (ostre i przewlekłe białaczki, chłoniaki ziarnicze i nieziarnicze, zespoły mielodysplastyczne, szpiczak mnogi)
Hematologiczne choroby nie-nowotworowe (wrodzone i nabyte anemie aplastyczne, hemoglobinopatie, talasemie, wrodzone niedobory immunologiczne)
Nie-hematologiczne choroby nowotworowe (neuroblastoma, mięsak Ewinga, glioma, guzy tkanek miękkich,guzy germinalne, nowotwory narządowe)
Wrodzone zespoły metaboliczne i endokrynologiczne (adrenolekodystrofia, lizosomalne choroby spichrzeniowe)
Choroby o podłożu autoimmunologicznym (reumatologiczne, neurologiczne, hematologiczne)
Proces przeszczepiania komórek krwiotwórczych
Pobranie komórek krwiotwórczych od dawcy
Preparatyka komórek poza organizmem
Odpowiednie przygotowanie biorcy (postępowanie mieloablacyjno-immunosupresyjne)
Podanie komórek do organizmu biorcy
*Przeszczepienie- to zabieg
*Przeszczep- to materiał tkankowy
Aspiracja szpiku kostnego
Metoda wielokrotnych ukłuć kości biodrowej
Pobiera się < 5% szpiku (do 20 ml/kg należnej masy ciała, w praktytce do 1500ml)
Selekcja komórek- CliniMACS
Selekcję komórek in vitro wykonuje się najczęściej metodą immunomagnetyczną
Selekcja Pozytywna:
Np. Wyodrębnienie populacji komórek wyłącznie o fenotypie CD34+ lub CD133+
Selekcja negatywna:
Np. Usunięcie komórek CD20+ u pacjentów poddanych zabiegowi autologicznej transplantacji z powodu chłoniaka nieziarniczego linii B-komórkowej.
Mezenchymalne komórki macierzyste:
Dojrzały szpik kostny zawiera subpopulację komórek kreślanych jako meenhymalne komórki pnia lub meenhymalne komórki progenitorowe (ang. Mesenchymal Progenitor Cells – MSCs):
MSCs stanowią niewielki odsetek komórek jednojądrzastych szpiku kostnego- 0,01-0,001%.
Mezenchymalne Komórki Macierzyste
Dojrzały Szpik Kostny zawiera subpopulację komórek określanych jako mezenchymalne komórki pnia lub mezenchymalne komórki progenitorowe (ang. MSCs.
MSCs stanowią niewielki odsetek komórek jednojądrzastych szpiku kostnego = 0.01-0.001%.
MSCs posiadają zdolność do różnicowania się w określone tkanki mezenchymalne takie jak kość, chrząstka, tłuszcz, ścięgna, mięśnie i szpik.
Komórki mezenchymalne szpiku –MSC różnicuję się w adipocyty pod wpływem dexametazonu, indometacyny i insuliny.
Hodowla z kropelkami, które po zabarwieniu są lipidami obojętnymi (B).
Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej w 2006 roku zaproponowało minimalne kryteria definiowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych.
Mezenchymalne komórki Macierzyste to komórki które:
Przylegając do plastiku, hodowli w standardowych warunkach (adherentne)
Zdolne do różnicowania In vitro w adipocyty, osteoblasty i chondrocyty,
Wykazujące ekspresję markerów powierzchniowych takich jak CD73, CD90, CD 105, nie wykazujące ekspresji markerów lini hematopoetycznej CD11b, CD14, CD34, CD79a oraz ludzkiego antygenu leukocytarnego HLA-DR.
Szpikowe Embrionalno-Podobne Komórki Macierzyste
Bardzo małe embrionalno-podobne komórki macierzyste (VSELs)
Multipotencjalne komórki progenitorowe organizmów dorosłych (MAPCs)
Izolowane ze szpiku indukowane wieloliniowo komórki organizmów dorosłych (MIAMI)
Multipotencjalne komórki macierzyste organizmów dorosłych (MASCs)
Omnicyty
Dane dotyczące zależności pomiędzy opisanymi nisko zróżnicowanymi komórkami macierzystymi organizmów dorosłych, izolowane ze szpiku kostnego (VSELs, MAPCS, komórkami MIAMI, MASCS, omniCytes są skąpe.
Wydaję się, że mogą to być nakładające się populacje komórek uzyskane za pomocą różnych metod izolacji i hodowli.
Zdolność komórek MSCs do syntezy cytokin działających anty-apoptotycznie, proangiogennie, redukujących bliznowacenie i reakcję zapalną zwiększa zakres potencjalnych aplikacji klinicznych tych komórek.
Wykres nieczytelny .
Inne Źródła MSCs
Szpik kostny jest najczęściej wykorzystywanym źródłem komórek mezenchymalnych komórek macierzystych.
Komórki o podobnej morfologii i charakterystyce zlokalizowane również w innych tkankach m.in. w tkance tłuszczowej, krwi pępowinowej, płynie owodniowym, płucach czy wątrobie.
V. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste
Uzyskanie embrionalnych komórek macierzystych (ES) wiąże się z koniecznością zniszczenia nadmiaru zarodków, które pozostają po zabiegu zapłodnienia in vitro.
KLONOWANIE TERAPEUTYCZNE
Sukces związany z klonowaniem organizmów przybliża możliwości zastosowania tej techniki w medycynie regeneracyjnej.
Pozbawiona jądra komórka jajowa+ jądro komórki somatycznej = zarodek (ze zdj)
Czy klonowanie terapeutyczne można kontrolować?
Przeszkody uniemożliwiające zastosowanie macierzystych komórek embrionalnych w eksperymentach in vivo i leczeniu
Ograniczone możliwości kontrolowania różnicowania tych komórek, co może skutkować różnicowaniem w nieprawidłowym kierunku po przeszczepieniu
Formowanie nowotworów zbudowanych z trzech listków zarodkowych (potworniaki) po przeszczepieniu zarodkowych komórek macierzystych
Jak uniknąć konieczności niszczenia ludzkich zarodków lub klonowania terapeutycznego z użyciem ludzkich komórek?
Pozbawiona jądra komórka jajowa + jądro komórki somatycznej = czynniki cytoplazmatyczne reprogramujące jądro i powstanie komórki zdolnej wytworzyć zarodek (ze zdj)
Identyfikacja czynników reprogramujących -> zmiana fenotypu komórki zróżnicowanej na macierzystą, a następnie ponowne różnicowanie komórki (ze zdj)
INDUKOWANE PLURIPOTENCJALNE KOMÓRKI MACIERZYSTE
Shinya Yamanaka i John Curdon – Nagroda Nobla 2012
JAK INDUKOWAĆ PLURIPOTENCJĘ?
Skuteczność tylko 1%komórek.
Użycie protoonkogenów = ryzyko transformacji nowotworowej.
OCT-3/4, SOX2 to czynniki kluczowe w utrzymaniu pluripotencji
KLF$ i c-MYC to czynniki protoonkogenne
BADANIA NA iPS
Tabela1. Przykładowe źródła indukowanych, pluripotencjalnych komórek macierzystych
| Rodzaj materiału wyjściowego | Autorzy | Zastosowanie |
|---|---|---|
| Fibroblasty | Takahashi i Yamanaka 2006 | Oct ¾, Sox2, Klf4, c-Myc/Oct3/4 |
| Yu i wsp 2002 | Sox2, Nanog, Lin28 | |
| Fibroblasty płodowe | Takahashi i Yamanaka 2006 | Oct 3/4, Sox2, Klf4, c-Myc |
| Komórki hematopoetyczne | Yu i wsp 2007 | Oct 3/4, Sox2, Nanog, Lin28 |
| Mezenchymalne komórki macierzyste | Yu i wsp 2007 | Oct 3/4, Sox2, Nanog, Lin28 |
| Hepatocyty | Aoi i wsp 2008 | Oct 3/4, Sox2, Klf4, c-Myc |
| Komórki nabłonkowe żołądka | Aoi i wsp 2008 | Oct 3/4, Sox2, Klf4, c-Myc |
| Komórki izolowane ze skóry właściwej |
|
|
|
|
|
Indukowane Pluripotencjalne Komórki Macierzyste iPS – Problemy?
Przeszkody uniemożliwiające zastosowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) w leczeniu:
Ograniczone możliwości kontrolowania różnicowania tych komórek, co może skutkować różnicowaniem w nieprawidłowym kierunku po przeszczepieniu (niestabilny genom)
Wydajność transferu od 1:1000 000 do 1:1000 komórek
Niektóre iPS starzeją się bardzo szybko
Jeżeli wektorem jest wirus to na stałe pozostanie w genomie komórki
Klf4 i c-Myc są onkogenami
OTRZYMYWANIE iPS, CZYNNIKI EPIGENETYCZNE
Metylację DNA oraz modyfikacje histonów są głównymi mechanizmami epigenetycznymi. Pełnią funkcję regulatorów ekspresji genów u ssaków a tym samym odgrywają kluczową rolę w procesach różnicowania i rozwoju komórek.
Cechą charakterystyczna euchromatyny zawierającej aktywne transkrybowane geny jest niski poziom metylacji DNA i jednocześnie wysoki poziom acetylacji histonów.
www.c linicaltrails.gov
22 styczeń 2013
4407 badań klinicznych z wykorzystaniem komórek macierzystych
Od czerwca 2005roku badania kliniczne zarejestrowane w bazie MEDINE opatrzone są numerem „NCT” + 8-cyfrowy kod np. NCT00000419
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: OPARZENIA I OWRZODZENIA PODUDZI
Keratynocyty + fibroblasty + kolagen = apligraft®
Czasowo stosowane opatrunki:
Biobrane® (silikon)
transCyte®(alogeniczne fibroblasty + kolagen)
integra® (kolagen wołowy + silikon)
Substytuty stałe skóry:
AlloDerm® (bezkomórkowa macierz skóry)
Apligraft®, Stratagraft (alogeniczne keratynocyty i fibroblasty + kolagen)
Dermagraft® (alogeniczne fibroblasty + PGA)
Epicel® (hodowany naskórek autologiczny)
Naskórek autologiczny
1.Clinical Efficacy and Safety of Autologous Cultured Keratinocyte Cell on Severe Burn Wood NCT00978705
2.Application of cultured Autologous Keratinocytes for Burn Wound Healing (KC) III faza NCT00932156
3.Autologous Engineered Skin Substitutes for Closure of Skin Wounds NCT00591513
4.StrataGraftTM Skin Tissue *Human Donor Skin) In The Surgical Management Of Complex Skin Defects CT00618839
5.Dermal Substitute and Topical Negative Pressure in Burns (VAC-M) NCT00548314
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: BIELACTWO NABYTE - AMI (Autologous Melanocyte Implantation)
1. Vitiligo Skin Transplantation (MKTP) NCT00830713
2.Autologous Transplantation of Melanocytes for Treatment of Vitiligo Skin NCT00631865
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: USZKODZENIE CHRZĄSTKI STAWOWEJ – ACI (Autologous Chondrocyte Implantation)
(rysunki) artroskopia -> ->hodowla in vitro->-> ->MRI
1. Observation of the Result After Autologous Chondrocytes Treatment NCT01056900
2. Study of the Treatment of Articular Repair (STAR) NCT00158613
3. Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Articular Cartilage Defects NCT00891501
4. Stem Cell Transplantation for the Treatment of Knee Osteoarthritis NCT00550524
5.Mesenchymal Stem Cells to Heal Articular Cartilage Defects NCT00885729
6.Peripheral Blood-drived Stem Cell on Damaged Knee Cartilage (PBSC) NCT01076673
7.Mesenchymal Stromal Stem Cells and Osteoarthritis NCT01038596
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: NEO-CHRZĄSTKA W CHIRURGII (chondrocyty hodowane na rusztowaniach 3D)
(zdjęcia) Neo-chrzastka zbudowana in vitro
Naturalna chrząstka
Drukowanie rusztowań przestrzennych do hodowli komórek (CT or MRI scan->digitized 3D image->Scaffoid Design via Customized Software-> Scaffoid Fabrication via Micro-Assembley by using a 4-Axes Robot)
1.Validity Study of a Nasal Valve Implant NCT00837525
2.Tissue Engineering Microtia Auricular Reconstrution NCT00958802
3.Follow-up Study of Chondrogen® Delivered by Intra-Articular Injection Following Meniscectomy NCT00702741
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: NEO-KOŚĆ
Rusztowanie kostne musi zawierać makropory(a) i minipory (b) dla odpowiedniej penetracji komórek.
Badania przedkliniczne (model owcy): komórki macierzyste + rusztowanie (PLGA + kolagen)
1.Procurement of Tissue Samples for Cell Cultures and Analyses NCT00435877 (BM)
2.Osseous Setting Improvement With Co-implantation of Osseous Matrix and Mesenchymal Progenitors Cells From Autologous Bone Marrow NCT00557635
3.Mesenchymal Stem Cell for Osteonecrosis of the Femoral Head NCT00813267
Podłoże pod implant zębowe (komórki macierzyste tkanki tłuszczowej (zdj)
1.Bone Tissue Engineering Using Autologous Bone Repair Cell (BRC) Therapy for Sinus Floor Bone Augmentation (I i II faza) NCT00980278(BM)
2.Regenerative Endodontic Techniques NCT00595595 (progenitory śluzówki)
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: REGENERACJA TKANKI MIĘŚNIOWEJ (prążkowanej, serca i gładkiej) (regeneracja tkanek o uporządkowanym ułożeniu komórek)
(Zdjęcia) mioblasty, ułożenie przypadkowe(b) i uporządkowane(c)
F-Aktyna, ułożenie przypadkowe (b) i uporządkowane (c)
Koncepcja regeneracji wspomaganej
Przeszczepienie komórek macierzystych mięśni,
Proces regeneracji zachodzi w oparciu o istniejącą strukturę macierzy zewnątrzkomórkowej.
1. Steam Cell Therapy to Improve the Muscle Function of Patients With Partly Denervated Muscles of the Arm NCT00755586(BM)
Droga podania komórek macierzystych
Dożylna
Do tętnic wieńcowych (po rekanalizacji)
Metoda otwarta
Komórki
Świeży szpik
Macierzyste szpiku hodowane in vitro
Około 300 Badań zarejestrowanych w Clinical.Trails.gov
1.MYHEART (Myogenesis Heart Efficiency and Regeneration Trial) NCT00054678
2.Cardiac Steam Cell Infusion in Patients With Ischemic CardiOmyopathy (SCIPIO) NCT00474461
3.Combination Stem Cell (MESENDO) Therapy for Utilization and Rescue of Infarcted Myocardium NCT005488613
4.Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell Implantation for Moderate to Severe Peripheral Arterial Disease NCT00919516
5.Combination stem Cell Therapy for the Treatment of Severe Coronary Ischemia (CI) NCT00643981
1.Cell Therapy for Coronary Heart Disease This study has been terminated. NCT00289822
2.Cell Therapy in Chronic Ischemic Heart Disease. This study has been terminated NCT00362388
3.Autologous Progenitor Stem Cell Therapy for Congestive Heart Failure Patients Undergoing Coronary Artery Bypass Grafting (CABG) Surgery. This study has been terminated NCT00130377
“….no effects of intracoronary injection of autologous mononuclear BMC on global left ventricular function…” N Engl J Med 2006;355;1199-209
“stem cell therapy for heart failure: are arrhythmias a real safety concern?” Circulation 2009l119;2735-40
WYSILKOWE NIETRZYMANIE MOCZU U KOBIET
Zwężenie światła cewki moczowej dzięki implantom zbudowanym z chondrocytów i komórek mięśni gładkich.
Regeneracja zwieracza cewki poprzez przeszczepienie komórek macierzystych (mioblastów, mesenchymalnych szpikowych).
Autologous myoblast ant fibroblasts versus collagen for treatment of stress urinary incontinence in women: a randomized controlled trial.
Itd ;)
1.Autologous Cell Therapy for Female Stress Urinary Incontinence (2 faza) NCT01008943 (autologous muscle derived cells)
2. A New Therapeutic Strategy for Urethral Sphincter Insufficiency NCT0047069 (squeletic muscular cells)
3. Innovacell (Innsbruck Biotechnologie)
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: REKONSTRUKCJA GRUCZOŁU PIERSIOWEGO
Regeneracja tkanek uszkodzonych radioterapią (wielopunktowe transplantacje komórek macierzystych)
1.Study of Autologous Fat Enhanced Regenerative Cell Transplanted to Reconstruct Breast Deformities After Lumpectomy (RESTORE-2) NCT00616135
2. Regenerative Tissue Matrix for Breast Reconstruction NCT01027637
3. Breast Reconstruction and Augmentation With Brava Enhanced Autologous Fat Micro Grafting NCT00466765
1.Islet Cell Transplantation Alone and CD34+ Enriched Bone Marrow Cell Infusion in Patients With Diabetes Mellitus: Steroid-Free Regimen NCT00021801
2. Islet Cell Transplantation Alone in patients With Type 1 Diabetes Mellitus: Steroid-Free Immunosuppression NCT00306098
3.Islet Transplantation in Type 1 Diabetes Patients Using the Edmonton Protocol of Steroid-Free Immunosuppression NCT00566813
4.Pancreatic Isles Cell Transplantation – A Novel Approach to Immunosuppression NCT00530686
5.Pancreatic Islet Cell Transplantation NCt00214786
6. Allogenic Islet Cell Transplantation NCT00160732
7. The Impact of Pancreatic Islet Cell Allotransplantation on Cognitive Function in Type 1 Diabetes Mellitus Nct00590876
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: UKŁAD NERWOWY
Regeneracja nerwów obwodowych
Wstawki chitozanowe.
Ochrona przed tworzeniem się tkanki bliznowatej po URK.
1.Autologous Mesenchymal Stem Cell Transplant for Parkinson’s Disease NCt00976430
2.Embryonic Dopamine Cell Implants for Parkinson’s disease : A Double-Blind Study NCT00038116
3.Phase2, Double-Blind, Randomized, Controlles Multi-Center Clinical Trial of the Safety and Efficacy of Transplanted Fetal Porcine Cells in Patients With Parkinson’s Disease NCT00226460
4.Development of iPS From Donated Somatic Cells of Patients With Neurological disease NCT00874783
5.Rajavtihi Neuronal Adult Stem Cells Project (RNASc) NCT00927108
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: STWARDNIENEI ROZSIANE
1.Stem Cell Therapy for Patients With Multiple Sclerosis ailing Interferon A Randomized Study NCT00273364 HSCs
2.Hematopoietic Stem Cell Therapy for Patients With Multiple Sclerosis NCT00278655
3.Autologous Stem Cell Transplant for Multiple Sclerosis (MS/BMT) NCT01099930
4.High- Dose Immunosuppression and Autologous Transplantation for Multiple Sclerosis (HALT MS) Study NCT00288626 HSCs
5. Donor Stem Cell Transplantation for the Treatment of Multiple Sclerosis NCT00497952
6.Autologous Mesenchymal Stem Cell From Adipose Tissue in Patients with Secondary Progressive Multiple Sclerosis (CMM/EM/2008) NCT01056471
7.Mesenchymal Stem Cell in Multiple Sclerosis (MSCIMS) NCT00395200
8.Mesenchymal Stem Cell for the Treatment of MS NCT00781872
10mln osób mogłoby odzyskać wzrok dzięki wszczepieniu rogówki
Bezkomórkowa rogówka (zdj)
Po transplantacji (a)
12 miesięcy później (B)
H&E(C)
Trichrom Massona(D)
Nie wykazano makrofagów(E)
Nie wykazano waskularyzacji(F)
1.Cultivates Stem Cell Transplantation for the Treatment of Limbal Stem Cell Deficiency (LECT) NCT00845117
2.Comparison of the Effects on Promoting Corneal Epithelial Wound Healing Between human Auto-Serum and Cord Blood Serum NCT00598299
3.Transplantation of Tissue Cultured Human Amniotic Epithelial Cells Onto Damaged Ocular Surfaces NCT00344708
4. Transplantation of Cultibated Limbal Epithelim on Amniotic Membrane for Limbal Stem Cell Deficiency NCT00348114
5.The Application of Oral Mucosal Epithelial Cell Sheets Cultivated on Amino Membrane in Patients Suffering From Corneal Stem Cell Insufficiency or Symblepharon. This study has been terminated. (due to unstable cell sheet quality. We didn’t use this tech on patient. NCT00491959
Niewydolność rąbkowych komórek macierzystych –stan w którym na skutek upośledzenia podziałów RKM powierzchnia nabłonka rogówki zastąpiona zostaje nabłonkiem spojówkowym.
ZASTOSOWANIE KLINICZNE: DUŻE NARZĄDY
Regeneracja kluczowych narządów o skomplikowanej budowie
Wspomaganie regeneracji
1.Improvement of Liver Function in Liver Cirrhosis Patients After Autologous Mesenchymal Stem Cell Injection a Phase I-II Clinical Trial NCT00420134
2.Intrahepatic Reinfusion of CD133+ Stem Cell in Cirrhotic Patients (Cirrhosis133) NCT01025622
3.Adult Stem Cell Therapy in Liver Insufficiency NCT00147043
Systemy wspomagania funkcji wątroby
1. phase 2 Evaluation of the ELAD System in the Management of Acute Liver Failure NCT00030225
Duże narządy
Przygotowanie jednego wszczepu o średnicy 14cm(150cm2) wymaga przygotowania 140 szalek całkowicie porośniętych komórkami, każda o średnicy 15cm, czyli 2,5cm2 komórek (!)
Wycinek biopsyjny trzeba „powiększyć” w laboratorium aż 25 000 razy
BADANIE NA MODELU ZWIERZECYM vs. BADANIE KLINICZNE
Doświadczeń na małych ssakach nie można odnieść do ludzi
Milion komórek dla myszy >>>milion komórek dla człowieka
Cm2 matrycy bez komórek u myszy regeneruje ¾ pęcherza moczowego, u człowieka zasiedlenie takiej matrycy nie ma znaczenia
Modele doświadczalne obejmują urazy „zdrowych” tkanek, brak modeli chorób przewlekłych i trudno gojących się ran
Brak możliwości dokładnego śledzenia udziały przeszczepionych komórek w procesie regeneracji narządów
Konstrukcja in vitro niektórych tkanek możliwa ale narządów wątpliwa
Trudności w regeneracji tkanek przewodzących impulsy
Biologia komórek macierzystych - ?
VII. Autologiczna hodowla keratynocytów w leczeniu ran oparzeniowych.
Leczenie rozległych oparzeń ma na celu jak najszybsze pokrycie ubytków naskórka i skory właściwej, by do minimum ograniczyć utratę płynów i białka przez uszkodzone powłoki ciała
Pokrycie ran oparzeniowych i ich epitelializacja ( naskórkowanie) zapobiega rozwojowi zakażeń.
Szybsze uzyskanie gojenia raz zmniejsza śmiertelność chorych
Pomysł hodowania naskórka powstał najprawdopodobniej jeszcze w XIX wieku
- Jacques Louis Reverdin w 1864 roku w Paryżu przeszczepiał niewielki płatki naskórka ( 4mm2) uzyskując w ten sposób epotelializacje ziarninujących ran
- Carl August Ljunggren w 1897 roku w Moskiwe przedstawił wyniki pracy dotyczącej utrzymywania w laboratorium fragmentów naskórka i późniejszych ich przeszczepianiu
- metodę hodowli keratynocytów „in vitro” z uzyciem odżywczej warstwy komórek ( fibroblastów mysich 3T3) i czynników wzrostu opisali w 1975 roku Rheinwald i Green
- pierwszy raz zastosowano autologiczne hodowle keratynocytów w leczeniu oparzeń w 1981 roku ( O’Connor i wsp.)
FDA (Food & Drug Administration) zezwala na wykonywanie przeszczepów komórek autologicznych ( AKT- Autologous Keratynocytes Transplantation) jako metody leczenia w przypadku:
ran oparzeniowych
przewlekłych owrzodzen podudzi i niewydolności zylnej i cukrzycy
Barierami, które ograniczają dostęp do metod leczenia przy uzyciu inżynierii tkankowej są :
- długi okres namnażania komórek
- trunosc w otrzymaniu odpowiednio grubej warstwy „pseudotkanki” i pseudonaskórka
- efekt starzenia się hodowli
- wysokie koszty
- niebezpieczeństwa
- czas od założenia hodowli pierwotnej komórek autologicznych do momentu otrzymania płatków „pseudonaskórka” ogranicza użycie tej metody w przypadkach nagłych
Leczenie chorego oparzeonego wymaga jak……. Pokrycia ubytków naskórka i skóry powst…… oparzenia. (złe zdjęcie..)
W leczeniu chorego oparzonego liczy się każdy dzień.
Czynnik czasu jest w tym przypadku niezwykle istotny
Utrata płynów przez otwarte rany chorego oparzonego jak i możliwości zakażenia raz nakazują jak najszybsze uzyskanie pokrycia zniszczonej skory
12 godzinne pierwotne kolonie keratynocytów przyklejone do warstwy odżywczej mysich fibroblastów 3T3 tworzą „gniazda”
Po 15-18 dniach hodowla pokrywa jedną warstwą prawie 100% powierzchni butelki
Brak komórek 3T3
Po 24 dniach hodowla stanowi strukturę częściowo wielowarstwową . jest to najlepszy okres, aby położyć przygotowane płatki na rany oparzeniowe.
Przed wykonaniem przeszczepienia, wyhodowane komórki powinny stanowić zwartą widoczną w butelce hodowlanej błonę.
Po przyniesieniu pseudo- naskórka na sale operacyjną należy go wydobyć z butelki hodowlanej
(zdjęcie urządzenia o nazwie „cel factory” w którym wykorzystuje się specjalne pojemniki o powierzchni wzrostu zwielokrotnionej setki razy.)
- powierzchnia wzrostu komórek w butelce hodowlanej wynosi od 25 do 250 cm2 zaleznie od jej wielkości
- najmniejsze urządzenie typu „cel factory” ma powierzchnię wzrostu 8500cm2.
Wyhodowana „tkanka” zbudowana z keratynocytów nie zastępuje zniszczonej skóry
„Pseudonabłonek” zastępuje tylko naskórek.
Najczesciej laboratorium jest w stabnie dostarczyć tylko jedną warstwę komórek
Próba rekonstrukcji ubytków pełnej grubości skóry może przebiegać w dwóch etapach:
Hodowla fibroblastów na rusztowaniu z estrów hialuronianu ( skóra własciwa)
Po wygojeniu pierwszej warstwy komórek zostaje na nią przeszczepiona wyhodowana warstwa keratynocytów ( naskórek)
Dla chorych oparzonych jest to zbyt długi okres oczekiwania na przeszczep
Celem budowania struktur o większej objętości i odporności stosuje się różnego rodzaju rusztowania dla komórek np.:
- kolagenu , elastyny, fibryny
- glikosaminoglikanów (GAG)
- kwasów organicznych : polimlekowego (PLA), poliglikolowego (PGA)
- błony owodni , martwej skóry
- polimerów silikonowych
Posiadanie komórek na matryce z PGA, PLA czy PCL pozwala na otrzymanie struktur o większej grubości oraz stwarza możliwość dotarcia składników pożywki do wszystkich komórek > Matryca z komórkami po przeszczepieniu ulega modelowaniu
Metody namnażania komórek „in vitro” nie pozwalają na otrzymanie tkanki o objętości większeni niż kilkanaście mm3, ze względu na brak unaczynienia
Celem poprawienia odżywiania komórek w hodowli „in vitro” stosuje się różnego rodzaju systemu przepływowe ( bioreaktory) zastępujące przepływ krwi
Hodowle pierwotne komórek bardzo szybko starzeją się
Jeżeli pobrane komórki są uszkodzone (np. UV) to proces ten nastepuje już po 4-5 tyg.
ZAGROŻENIA:
- największym zagrozeniem w przypadku zastosowania Autologicznej Hodowli Keratynocytów w leczeniu jest możliwość zakażenia prionami
- Odczynniki i matryce używane w hodowli powstają na bazie produktów wołowych ( FBS-surowica wołowa, EGF- czynnik wzrostu naskórka, ekstrakty z przysadki wołowej, kolagen)
Koszt otrzymania 1cm2 „pseudonaskórka” zbudowanego z pojedynczej warstwy wynosi około 2-5$
Jeśeli oparzony wymaga pokrycia 20% powierzchni ciała to 3.400 cm2 x 2$ = 6.800$ Czyli około 30000pln
Zastosowanie Autologicznej Hodowli Keratynocytów w leczeniu świeżych ran oparzeniowych jest metodą jak najbardziej pożądaną i stwarza dodatkowe szanse na przeżycie chorych w ciężkich stanach
Metoda ta jednak nadal posiada duży balas organiczeń technicznych, finansowych i bezpośrednich niebespieczensw biologicznych związanych z przeszczepem
Ze względu na materiał zastosowany w tych produktach dzięki się je na czasowo pokrywające (materiał sztuczny lub nieprzyswajalny immunologicznie) oraz pokrywające ranę na stałe ( materiał wchłanialne)
Czasowo stosowane opatrunki : Allograft, Biobrane i TransCyte
Substytuty stałe skóry: Integra , AlloDerm, Apigraf, Dermagraf oraz Epicel
Allograft
- jest to sorka mrożona pobierana ze zwlok przechowywana w bankach tkanke
- znaczne obniżenie odporności biorcy pozwala na pozostawienie allograftu w ranie nawet do kliku tyg.
- ryzyko przeniesienia chorob zakaznych
- zastosowanie allograftu pozwala na przygotowanie przeczepu autologicznego
BIOBRANE
- to siatka nylonowa połaczona cienką membraną silikonową która stanowi bariere dla drobnoustrojow
- opatrunek może być nakładany bezpośrednio na rany
- zabezpiecza także przeszczep autologiczny
TransCyte
- jest substytutem skóry przygotowanym z fibroblastów noworodka ( napletka) na membranie polimerowej pokrytej kolagenem wyizolowanym ze świni
- membrana ta zapewnia wymiane gazową oraz sterylne warunki w obrębie rany. Hodowane fobroblasty są źródłem czynników wzrostu potrzebnych do naskórkowania
- TransCyte podobnie jak Biobrane powinien być usunięty podczas zauważalnego gojenia
INTEGRA
- została dopuszczona do leczenia ran pooparzeniowych przez FDA w 1996 r.
- znajduje ona szczególnie zastosowanie wówczas gdy brak jest odpowiedniej powierzchni do pobrania fragmentu skóry do przeszczepu własnego
- składa się z podwójnej blaszki: kolagenu wołowego oraz warstwy silikony, która czasowo zastępuje naskórek
- kolagen jest usieciowany chondroityną i glikozaminoglikanami. Zewnętrzną warstwa silikonowa jest po 2 lub 3 tygodniach usuwana
- w ten sposób rana jest przygotowana do przyjęcia przeszczepu z wyhodowanych komórek autologicznych bądź autoprzeszczepu naskórka
AlloDerm
- należy do grupy stałych substytutów skóry
- jest to bezkomórkowa macierz skóry pozbawiona naskórka pobrana ze zwlok
- AlloDerm nakłada się na przygotowaną uprzednio rane pooparzenową łącznie z przeszczepem autologicznym
Apligraf:
- jest dwuwarstwowym ekwiwalentem skóry składającym się z kolagenu allkogenicznych fibroblastów i keratynocytów
- nie jest stosowany w leczeniu oparzen a jedynie owrzodzen podudzi o podłożu cukrzycowym i w owrzodzeniach zylnych
- keratynocyty i fibroblasty pochodzą z napletków noworodków
Dermagraft
- jest subtytutem skóry zawierającym fibroblasty ufiksowane na siatce z kwadu poliglikolowego
- są to wyhodowane fibroblasty pochodzące od noworodków
- zastosowanie tej siatki powoduje ze graft jest wchłanialny i można go stosować na stałe
- znajduje zastosowanie tylko do leczenia owrzodzen konczyn dolnych. Fibroblasty są źródłem czynnikow wzrostu , kolagenu i białek
Epicel:
- produkt otrzymywany z płatków naskórka
- został on zarejestrowany jako produkt biotechnologiczny do leczenia ran oparzeniowych w 1988 przez firme Genzyme Tissue Repair Corporation, Cambridge , MA
- metoda otrzymywania Epicel-u jest jednak bardzo droga. Wyhodowanie pseudonaskrórka pokrywającego 1 % powierzchni ciała kosztuje około 10000 $
EPIDEX
- otrzymuje się z pierwotnej hodowli keratynocytów autologicznych
- w celu jego wytworzenia hoduje się komórki macierzyste mieszka włosowego pochodzące z zew. Warstwy pochewki korzenia włosa. Z pochewki włosa izoluje się komórki macierzyste
- wyizolowane komórki umieszcza się nad warstwą hodowanych allogenicznych keratynocytów, wydzielających czynniki wzrostu
- czynniki te stymulują przekształcanie się komórek macierzystych w komórki warstwy podstawnej naskórka
- keratynocyty różnicują się podobnie jak w prawidłowym naskórku
- wyhodowanie 1cm2 naskórka z 20 mieszków włosowych trwa około miesiąc. Fragmenty naskórka mają grubość około 0,1 mm
- wielkość skrawków jest porównywalna z wielkością skrawków otrzymywanych tradycyjnym sposobem hodowli komórek naskórka
- epidex nie był do tej pory stosowany w leczeniu ran oparzeniowych u ludzi
METODY FARMAKOLOGICZNE W LECZENIU BIELACTWA
Inhibitory cyklooksygenazy
Melagenina
Fenyloalanina
DOPA
5-fluorouracyl
Alfa-MSH
Leki przeciwtrądowe
Dziegcie
Cyklofosfamid
Penicylamina
Mechloretamina
KWALIFIKACJA PACJENTA DO LECZENIA CHIRURGICZNEGO
Nieskuteczne leczenie zachowawcze
Postać ogniskowa lub segmentowa w okresie stabilnym
Trudno repigmentujące zmiany w zakresie grzbietów dłoni i stóp, łokci, czoła, granicy skóry owłosionej i nieowłosionej głowy
PRZESZCZEP NASKÓRKOWY (suction blister)
Wytworzenie pęcherzy w obrebie plam pozbawionych barwnika przy pomocy nadtlenku azotu.
Płytka 8-dołkowa
Przeszczepianie naskórka z miejsca donorowego w miejsce docelowe(Zdj)
Postępowanie po zabiegu:
Zabezpieczenie miejsca transplatacji opatrunkiem BACTIGRAS lub GRASSOLIND NEUTRAL
Zmiana opatrunku w 2 i 4 dobie po transplantacji
Zdjęcie opatrunku po 7 dniach od transplantacji i rozpoczęcie fotochemoterapii PUVA wg ogólnie przyjętych metod (3xw tygodniu. Oxsolaren 0,6mg/kg m.c. lub Geralen 1,2mg/kg m.c.), aż do uzyskania repigmentacji
Stosowanie emolientów w miejscu transplantacji
TRANSPLANTACJA AUTOLOGICZNYCH HODOWANYCH MELANOCYTÓW
Wytworzenie(suction blisters)
Uzyskanie zawiesiny komórek naskórka
Założenie hodowli komórkowej
Izolacja melanocytów
Wymiana medium hodowlanego i pasażowanie melanocytów
Transplantacja zawiesiny melanocytów
Fotochemoterapia PUVA (Psoraln Ultra-Violet A) fotochemioterapia klasyczna z wykorzystaniem doustnych psoralenów
IX. PIEROTNE HODOWLE ALLOGENICZNYCH I AUTOLOGICZNYCH CHONDROCYTÓW ZASTOSOWANIE W LECZENIU
ZASTOSOWANIE PIERWOYNYCH HODOWLI CHONDROCYTÓW W LECZENIU CHORÓB
Urologia- leczenie odpływu pęcherzowo- moczowodowego oraz wysiłkowego nietrzymania moczu (FDA)
Chirurgia plastyczna i laryngologia – uzupełnienie defektów kostnych twarzoczaszki
Ortopedia- augmentacja uszkodzonej chrząstki powierzchni stawowych
LECZENIE ODPŁYWU PĘCHERZOWO-MOCZOWODOWEGO ( Vesicouretheral reflux- VUR)
Odpłwy pęcherzowo-moczowy polega na cofaniu się moczu z pęcherza do moczowodów i układu kielichowo-miedniczkowego powodując postępujące uszkodzenie nerek prowadzące do ich niewydolności
U podłoża pierwotnego refluksu leżą zmiany anatomiczne ujść moczowodów do pęcherza prowadzące do niewydolności zastawki ujścia moczowodu
LECZENIE ODPŁYWU PĘCHERZOWO-MOCZOWODOWEGO
Leczenie zachowawcze- antybiotykoterapia, gdy zmiany w okolicy ujścia moczowodu mają charakter zaburzeń funkcjonalnych
Leczenie chirurgiczne metodą otwartą przez otwarcie pęcherza moczowego oraz sposobem laparoskopowym- obie te metody polegają na wytworzeniu tak długiego kanału w ścianie pęcherza moczowego, który tworzyłby mechanizm zastawkowy
SZTUCZNE MATERIAŁY STOSOWANE W ENDOSKOPOWYM LECENIU ODPŁYWU PĘCHERZOWO-MOCZOWODOWEGO
1.Teflon ( politetrafluoroetylen) Matouschek 1981
2. Macroplastique ( zawiesina mikrokuleczek silikonowych w povidonie) Shulman, 1994
3. Alkohol poliwinylowy, Merguerian, 1990
4. Bioaktywne szkło (tlenek Ca+ silikonian Ca+ tlenek Na) Waalker, 1992
5. Deflux system, mikrosfery dextranomeru zawieszone w hialuronianie sodowym, Sternberg, 1995
6. Rozprężający balonik (hydroksyetlowymetylowy akrylat HEMA) Atala, 1992
KSENOGENICZNE MATERIAŁY STOSOWANE W ENDOSKOPOWYM LECZENIU DOPŁYWU P-M
Kolagen wołowy o krzyżowych włóknach powstałych po działaniu aldehydu glutanowego (Contigen, Zyderm, Zyplast)
Obce antygeny!!!
Choroby prionowe!!!
Mała skuteczność
Obecnie w Europie i US zabroniony
AUTOLOGICZNE MATERIAŁY STOSOWANE W ENDOSKOPOWYM LECZENIU ODPŁYWU P-M
Tłuszcz autologiczny, Peer, 1965
Autologiczny kolagen otrzymany ze skóry, Cendron, 1995
Autologiczne chondrocyty, Atala, 1993
Autologiczne miocyty gładkie, Atala,1994
WŁAŚCIWOŚCI CHONDROCYTÓW PRZYDATNE W LECZENIU
Chondrocyty posiadają zdolność do produkcji macierzy międzykomórkowej (ECM-extracellular matrix) zbudowanej z glikozoaminoglikanów (GAG) i kolagenu typu II
Obecność macierzy międzykomórkowej nadaje pożądanych właściwości przeszczepowi z hodowanych komórek, takich jak twardość i zachowanie objętości i kształtu
Efekt ten można osiągnąć dzięki zachowaniu fenotypu komórek
PIERWOTNA HODOWLA CHONDROCYTÓW
Chondrocyty wyizolowane w celu założenia hodowli ulegają często odróżnicowaniu się (dedifferentiation) i przekształcają się w komórki fibroblasto-podobne, tracąc pierwotny fenotyp oraz zdolność do produkcji GAG i kolagenu typ II(ECM)
Odróżnicowanie się zachodzi w przypadku utrzymywania hodowli w pojedynczej warstwie (monolayer) przez długi okres czasu, szczególnie gdy komórki posiane są bardzo rzadko
Powodzenie leczenia przy użyciu pierwotnej hodowli chondrocytów zależy od tego czy przeszczepione komórki mają zdolność do produkcji ECM, czyli posiadają pierwotny fenotyp komórki chrzęstnej
UTRZYMANIE FENOTYPU KOMÓRKI CHRZĘSTNEJ MOŻNA OSIĄGNĄĆ PRZEZ:
Utrzymywanie komórek przez krótki czas in vitro
Hodowanie komórek w dużej gęstości komórek na jednostkę powierzchni
Hodowanie komórek na podłożu przestrzennym hydrożeli (3D- alginian, klej fibrynowy, agaroza)
Schemat przedstawiający doświadczenie z użyciem autologicznych chondrocytów w leczeniu refluksu ( Atala, 1993)
Chrząstka ucha-> chondrocyty->alginat->komórki + polimer->pęcherz moczowy
Po 6 tygodniach otrzymujemy około 107 komórek, które można wszczepić w ścianę pęcherza moczowego
WYSIŁKOWE NIETRZYMANIE MOCZU ( Stress Urinary Incontinence)
Wysiłkowe nietrzymanie moczu- stan w którym występuje niezależne od woli wyciekanie moczu z cewki moczowej
U podstawy leżą zmiany związane z niewydolnością mechanizmu podwieszającego pęcherz moczowy lub mechanizmu zwieraczowego cewki moczowej lub współwystępowania obu tych zaburzeń
Zmiany te mogą występować po urazach, np. porody lub zabiegi chirurgiczne w obrębie dróg moczowych i nasilają się z wiekiem
LECZENIE WYSIŁKOWEGO NIETRZYMANIA MOCZU
Ćwiczenia przepony miednicy
Operacje otwarte i laparaskopowe podwieszenie cewki moczowej-rekonstrukcja prawidłowych stosunków anatomicznych
Minimalnie inwazyjne sposoby podwieszania cewki moczowej i wytworzenie kąta między pęcherzem a cewką
Metody endourologiczne
SZTUCZNE ORAZ AUTOLOGICZNE MATERIAŁY, KTÓRE MOŻNA ZASTOSOWAĆ W ENDOSKOPOWYM LECZENIU WYSIŁKOWEGO NIETRZYMANIA MOCZU
Teflon (politetrafluoroetylen)
Macroplastique (zawiesina mikrokuleczek silikonowych w povidonie)
Alkohol polivinylowy
Bioglass (tlenek Ca+ silikonian Ca+ tlenek Na)
Deflux system (mikrosfery dextranomeru zawieszone w hialuronianie sodowym)
Rozprężający balonik (hydroksyetlowymetylowy akrylat HEMA)
Kolagen (ksenogeniczny i autologiczny)
ORTOPEDIA
Zastosowanie autologicznej hodowli chondrocytów w leczeniu uszkodzeń chrząstki stawowej polega na przygotowaniu odpowiedniego implantu z hodowanych komórek wysianych na długo-wchłanialnej matrycy z:
Kwasu poliglikolowego (PGA)
Kwasu polimlekowego (PLA)
Polikapronolaktonu (PCL)
Innych polimerów
ORTOPEDIA
Matryce wchłaniają się przez kilka miesięcy stanowiąc odpowiednie podparcie dla rosnących komórek chrząstki
Autologiczne komórki są pobierane w czasie diagnostycznej artroskopii i utrzymywane in vitro przez okres 10 tygodni
Po namnożeniu implant jest przyszywany w miejscu ubytku podczas kolejnego zabiegu artroskopowego
CHRURGIA PLASTYCZNA
Zastosowanie autologicznej hodowli chondrocytów w ubytkach chrzęstno-kostnych twarzoczaszki polega na przygotowaniu odpowiedniego implantu z hodowli komórek wysianych na długo wchłanialną matrycę z kwasu poliglikolowego (PGA) i kwasu polimlekowego(PLA ) lub polikapronolaktanu (PCL)
Matryce wchłaniają się przez kilka miesięcy stanowiąc odpowiednie podparcie dla rosnących komórek chrząstki
Zamiast płytki okostnej można używać przygotowanej błony kolagenowej ,,Chondo-Gide”
X.Przeszczap wysp trzustkowych
WSKAZANIA DO PRZESZCZEPIENIA WYSEPEK TRZUSTKOWYCH
Przeszczep autologiczny
Zapalenie trzustki
Nowotwór łagodny
Uraz trzustki
Przeszczep alogeniczny
Cukrzyca typu 1 (chwiejna cukrzyca)
LECZENIE CUKRZYCY TYPU I
Konwencjonalne sposoby leczenia cukrzycy (insulinoterapia)
Przeszczep izolowanych wysp trzustkowych
Przeszczep trzustki
ZALETY PRZESZCZEPIANIA WYSEPEK TRZUSTKOWYCH
Prosta imało inwazyjna metoda przeszczepiania
Zabieg przeszczepiania wysepek można przeprowadzać wielokrotnie
Wysepki mogą być przechowywane w warunkach hodowli in vitro
Wysepki mogą być przechowywane w ciekłym azocie lub jego oparach
RODZAJE PRZESZCZEPÓW ALOGENICZNYCH WYSP TZUSTKOWYCH
Przeszczep samych wysepek
Przeszczep wysepek z nerką
Przeszczep wysepek po uprzednim przeszczepieniu nerki
Przeszczep wysepek z wątrobą
DAWCA WYSEPEK TRZUSTKOWYCH
Dawcy wielonarządowi
Wiek 15-70lat
BMI
Kreatynina<2,5 ng/ml
NHBCD <10min
CIT maksymalnie 12h
Trzustki przechowywane w UW,PFC/UW bądź roztworze HTX
PRZECHOWYWANIE TRZUSTKI
Metodą dwuwarstwową PFC/UW (obrazek)
Wypływ wpływ O2 95%
CO2 5%
Trzustka w Roztworze UW gęstość 1,03g/ml
Perfluorocarbon (PFC) gęstość 1,93g/ml
Od dołu lód
ZDJĘCIA: izolowanie wysp trzustkowych; wyizolowana wyspa trzustkowa wybarwiona ditizonem
Opracowanie chirurgiczne trzustki
Cewnikowanie przewodu trzustkowego
Rozszerzenie trzustki
Trawienie enzymatyczne
Umieszczenie fragmentów trzustki w komorze trawiącej Ricodiego
Analiza mikroskopowa
Zatrzymanie trawienia enzymatycznego – w wyniku trawienia enzymatycznego otrzymuje się mieszaninę komórek
Oczyszczanie w gradiencie gęstości
Obliczanie IEQ Islet EQuivalent
| Średnica wysepek (µm) | Liczba wysepek (n) | IEQ czynnik konwersji | IEQ | ||
| 50-100 | n 1 | X | 0.167 | = | IEQ1 |
| 101-150 | n 2 | X | 0.667 | = | IEQ2 |
| 151-200 | n 3 | X | 1.685 | = | IEQ3 |
| 201-250 | n 4 | X | 3.500 | = | IEQ4 |
| 251-300 | n 5 | X | 6.315 | = | IEQ5 |
| 301-350 | n 6 | X | 10.352 | = | IEQ6 |
| 351-400 | n 7 | X | 15.833 | = | IEQ7 |
| >400 | n 8 | X | 22.750 | = | IEQ8 |
IEQ=Σ IEQ
Wyspy trzustkowe spełniają kryterium do przeszczepu jeżeli ich żywotność wynosi więcej lub równe 70%
Indeks stymulacji glukozą >1
W celu wyznaczenia indeksu stymulacji glukozą stosuje się:
-test statyczny inkubacji glukozą
-perfuzję
Przygotowanie wysepek do przeszczepu:
Wysepki rozpuszcza się w 150ml medium transplantacyjnego i umieszczanie w woreczku infuzyjnym
Maksymalne stężenie heparyny w medium transplantacyjnym 70U/kg m.c.b
Max. Objętość całkowita komórek, którą można przeszczepić to 8ml
Biorca wysepek trzustkowych:
18-55 lat
Początek cukrzycy do 40 r.ż
Poziom peptydu c <0.3ng/l
Insulinozależni przez okres >5lat
Wahania glikemii pomimo leczenia insuliną
Przynajmniej 1 epizod ostrej hipoglikemii (<50mg/dl) w ciągu 3 ostatnich lat
WYSEPKI TRZUSTKOWE SĄ PRZESZCZEPIANE DO WĄTROBY PRZEZ INFUZJĘ DO ŻYŁY WROTNEJ
Materiały wykorzystywane do zamknięcia żyły wrotnej:
-pianki żelowe Gelfoam
-spirale wewnątrznaczyniowe
-pasta kolagenowo-trombionowa D-stat
Monitorowanie czynności po przeszczepie polega na oznaczaniu:
Stężenia glukozy
-paskowy test glukozowy
-profil glikemii
-dożylny test obciążania glukozą
Stężenia HbA1c
Stężenie peptydu c
Stężenia frukozoaminy
Definicja insulionozależności po przeszczepieniu wysepek
Biorcy są traktowani jako niezależni od insuliny jeżeli w 75 +/- 5 dni po przeszczepie:
HbA1c < 6,1%
Glukoza osocza <126 mg/dl
Peptyd c >0,5 ng/ml
Protokół immunosupresyjny Miami przeszczep samych wysepek trzustkowych:
1.Izolacja wysepek (-3 tydzień)
2. hodowla w MM1 (-3, -2,-1,0 tydzień)
3.Przeszczep wysepek (0 tydzień)
4.Sirolimus (12-15ng/ ml lub 10-12 ng/ml od -1 tydzień od przeszczepu przez całe życie )
5. Tacrolimus (4-6 ng/ml od -1 przez całe życie)
6.Daclizumab 1 mg/kg od -1 , raz na miesiąc po ostatniej infuzji przez pierwszy rok , dwa razy na miesiąc przez drugi rok)
7.Infliximab 10mg/kg od 0 przez 7dni
Biorcy przeszczepów protokół immunosupresyjny Miami:
16 pacjentów
Typ 1 cukrzycy
Peptyd c <0,3 ng/ml
Epizody hipoglikemii
| Średnia +/- SD | Zakres | |
|---|---|---|
| Wiek biorcy | 41+/-10 | 25-60 |
| Czas trwania cukrzycy | 27+/-13 | 9-47 |
| BMI | 25+/-1.7 | 22-28 |
| Waga | 70+/-13 | 53-97 |
-Analiza histologiczna przeszczepionych wysepek miesiąc po przeszczepie
-Zmiany tłuszczowe w wątrobie po przeszczepie
Perspektywy leczenia cukrzycy przez przeszczep komórek trzustki:
Poszukiwanie alternatywne źródeł komórek produkujących insulinę
Opracowanie nowych metod zapobiegających odrzucenie przeszczepu
Przeszczep wysyp trzustkowych 1999-2007
>50 ośrodków : >1500 przeszczepów
Camillo Riccordi – dyrektor Diabetes Reasarch Institute
Wskazania do rekonstrukcji pęcherza moczowego:
Urotelialny rak pęcherza moczowego- 98%
Śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego
Gruźlica dolnych dróg moczowych
Zaburzenia neurogenne pęcherza moczowego
Wynicowanie pęcherza moczowego
Zastawka cewki tylnej
Idiopatyczna nadwrażliwość mięśnia wypieracza
Inne
Metody odprowadzenia moczu po cystektomi radykalnej:
-Niekontynentne
Wszycie moczowodów do skóry bezpośrednio lub przy pomocy wstawki z jelita (operacja Brickera)
-Kontynentne
Szczelny zbiornik jelitowy
Powikłania
-zaburzenia elektrolitowe
-zaburzenia równowagi osmotycznej
-zaburzenia neurologiczne
-demineralizacja kości
-zwiększanie wydzielania śluzu i kamica
-zakażenia układu moczowego
-nowotworzenie
Ortotopowy pęcherz moczowy
Hodowla komórek pęcherza :
-biopsja tkanki 1-2 cm2
-hodowla in vitro nabłonka urotelialnego i tkanki mięśniowej
-wysianie komórek na rusztowanie (70-150 cm2) z kolagenu i PGA(n=3) lub BAM (n=4)
W 99 % przypadków nie można zastosować metody zaproponowanej przez A.Atalę
Komórki macierzyste mieszków włosowych są pluripotencjalne
Komórki te mogą dać początek zarówno urothelium jak i mięśniom gładkim