Temat: Cykl komórkowy

Mechanizmy proliferacji, rozrostu i zmian wstecznych komórek

Cykl komórkowy to seria procesów zachodzących w żywej komórce, która w konsekwencji prowadzi do jej podziału.

Najważniejsze procesy w cyklu:

→ podwojenie materiału genetycznego

→ precyzyjne rozdzielenie DNA do komórek potomnych

→synteza RNA i białek (interfaza – G₁, i G₂)

Czas trwania cyklu:

→ 8 minut u larw owadów

→ 30 minut u bakterii

→ 4-12h – wczesne stadium zarodkowe

→ 24h – większość komórek ssaków

→ 1 rok – komórki trzustki

Faza G1:

→ synteza RNA i białek

→ komórki, które podejmują decyzje o podziale muszą pod koniec fazy G1 sforować punkt restrykcyjny cyklu

Faza G2 rozpoczyna się po zakończeniu replikacji DNA i trwa do momentu wejścia w mitozę:

→ trwa 2-4h/ synteza RNA, białek oraz dodatkowej błony komórkowej, która jest zużywana podczas cytokinezy

→ komórki wychodzące z G2 muszą sforsować punkt restrykcyjny fazy G2 – te mające zaburzenia, zwłaszcza uszkodzone genomy są zatrzymywane

Mitoza:

Profaza:

→ z chromatyny rozwijają się chromosomy w postaci długich nici

→ chromatydy łączą się ze sobą za pomocą centromeru

→ kolejno dochodzi do ich spiralizacji

→ zanika błona jądrowa i jąderko

→ każda z centrioli przemieszcza się do przeciwległego bieguna komórki; pomiędzy nimi formuje się wrzeciono kariokinetyczne

Metafaza:

→ chromosomy ustawiają się w płaszczyźnie równikowej tworząc płytkę metafazalną

Anafaza:

→ dochodzi do rozdzielenia chromosomów na 2 chromatydy (chromosomy potomne)

Telofaza:

→ w momencie kiedy chromosomy potomne komórki osiągną biegun, dochodzi do dekondensacji/długie nici które łącząc się ze sobą tworzą zrąb jądrowy

→ zanika wrzeciono kariokinetyczne

→ odtwarza się błona jądrowa i jąderko

Mejoza I:

•Profaza I

• Metafaza I:

→ wykształcenie się wrzeciona

→ ustawienie się w biwalenty w płaszczyźnie równikowej komórki

• Anafaza I:

→ rozdział chromosomów homologicznych

• Telofaza:

→ częściowa despiralizacja chromosomów

→ zanik wrzeciona podziałowego

→ odbudowa błony jądrowej i jąderka

→ niepełna cytokineza → skutkuje to powstaniem mostków cytoplazmatycznych

Proliferacja:

→ zdolność namnażania się komórek

→ regulowanie przez złożone mechanizmy kontroli cyklu komórkowego

Proliferacja komórek prawidłowych:

sygnały komórkowe

komórki powstrzymanie podziałów

Proliferacja komórek zmienionych nowotworowo:

Zwiększenie liczby komórek prowadzi do powiększenia tkanki lub narządu nazywamy mianem rozrostu.

Nowotwór to patologiczna forma rozrostu. (metastaza – powstawanie przerzutów)

Zmiany wsteczne:

→zanik

→zwyrodnienie

→martwica

Spermatogeneza składa się z:

→ spermatocytogenezy – przekształcenie się spermatogonii w spermatydy zawierające zredukowaną o połowę liczbę chromosomów

→ spermiogeneza – przekształcenie spermatyd w plemniki

Kanalik nasienny to miejsce spermatogenezy.

Kolejne stadia:

→ zaczynając od błony podstawnej

• spermatogonia

• spermatocyty I i II rzędu

• spermatydy

• plemniki

Spermatogeneza w ujęciu cyklu komórkowego:

1. Pierwotne komórki płciowe – dają początek spermatogenezie i oogenezie

- powstają w woreczku żółtkowym

- umieją się przemieszczać do gonad

- w momencie transportu otrzymują sygnał w co ostatecznie ma się zróżnicować

Wniosek:

• spermatocyt I rzędu daje 4 spermatydy (23 chromosomy) w wyniku mejoz

Rola mejozy w cyklu komórkowym:

• wymiana składu genetycznego chromosomów (ramion homologicznych) od ojca i matki w procesie crossing-over (prowadzi do zmiany składu genetycznego chromosomów)

• zredukowane o ½ liczba chromosomów (z diploidalnej do haploidalnej)

Temat: Regulacja cyklu komórkowego

Homeostaza organizmu zależy od równowagi między komórkami dzielącymi się i umierającymi.

Istotnym czynnikiem w procesie nowotworzeni jest obniżenie zdolności komórek do prawidłowego umierania.

Doprowadzić to może do:

→ nieprawidłowego zwiększenia żywotności komórek

→ wydłużenie czasu ich życia

→ utrwalenie zaistniałych mutacji

→ zaburzenie cyklu komórkowego

Zdarzenie zachodzące w kolejnych fazach cyklu komórkowego są zorganizowane tzn. inicjacja każdego etapu jest możliwa dopiero po prawidłowym zakończeniu etapu poprzedzającego.

Istotnym elementem regulacji cyklu komórkowego jest obecność wewnętrznych punktów kontrolnych – ich przejście komórka realizuje poprzez ekspresję swoistych genów.

Szczególne znaczenie ma regulacja cyklu między:

• G1/S

• G2/M

• podczas mitozy przy tworzeniu wrzeciona kariokinetycznego i rozdziale chromatyd do komórek potomnych – zapewnia prawidłowe funkcje wrzeciona

Regulacja – cell cycle regulation:

• cykliny powstają okresowo

• kompleksy kinaz z cyklinami – są regulatorami aktywacji białek

Cykl komórkowy jest regulowany m. in. przez aktywację receptorów białkowych:

- białka te są kodowane przez geny w komórce:

→ geny których produkty białkowe, które będą napędzać cykl to protoonkogeny

→ geny których produkty białkowe, które będą hamować cykl to geny supresorowe

Produkty białkowe tych genów są enzymami:

1. kinazy (fosforyzują białka)

2. fosfatazami (defosforylują białka)

3. Białka regulatorowe – albo aktywują / hamują kinazy i fosfatazy albo łączą się z innymi białkami

Protoonkogeny to dominujące kodujące białka, które odpowiadają za proliferację, różnicowanie i hamowanie apoptozy.

Ligand – zewnętrzna cząsteczka aktywująca receptor

Protoonkogeny to najczęściej:

• czynniki transkrypcyjne

•czynniki kontrolujące replikację DNA

• receptory i ich ligandy (czynniki wzrostowe)

• elementy wewnątrzkomórkowe szlaków komórkowych

• regulatory cyklu komórkowego

Protoonkogeny staje się onkogenem w wyniku:

• mutacji

→punktowych

→translokacje chromosomowe

•amplifikacji

Mutacja punktowa:

→ powoduje powstanie nadmiernie aktywnych białek

Amplifikacja (wzmocnienie):

→ białko w nadmiarze ale o prawidłowej aktywności

Translokacje chromosomowe:

→ białko o prawidłowej aktywności w dużej ilości

→ białka fuzyna prawidłowe w dużej ilości lub nadmiernie aktywne i łącza się

Białko fuzyna:

→ ma znaczenie prognostyczne w białaczce

→ powstają w wyniku fuzji, 2 geny kodowały odrębne białka i połączyły się te 2 białka

(chromosom Philadelphia – diagnostyka nowotworów)

Białka RAS:

• rodzina białek zaangażowanych w transdukcję sygnałów (GTP-azy)

• mutacja obecna w około 20-40% nowotworów prowadzą do permanentnej aktywności białka nawet przy braku obecności %?%%?%?%??

• członkowie: +/- Ras, K-Ras, N-Ras

• mutacje punktowe Ras są najczęstszą patologią aktywności protoonkogenu

Szlak sygnałowy białka RAS

Aktywacja białka RAS może być wynikiem mutacji punktowej kodonów 12,13,61 genów H-Ras, K-Ras, N-Ras:

→ 90% - gruczolakoraki trzustki

→ 50% - rak dwunastnicy

→ 30% - rak płuc

Protoonkogen RET:

- koduje receptorową kinazę tyrozynową.

• ekspresja: komórki C tarczycy i tkanka nerwowa współczulna przewodu pokarmowego

• ekspresja: guzy neuroendokrynne, rak rdzeniowaty tarczycy, guz chromochłonny, neuroblastoma

• aktywacja receptora indukuje zmiany ekspresji wielu genów wzmagając tempo proliferacji i migracji

Badania genetyczne protoonkogenu RET prowadzona u chorych z rakiem rdzieniowatym tarczycy umożliwia wczesne wykrycie i podjęcie działań.

Geny supresorowe nowotworów to geny:

• działające hamująco na procesy proliferacji komórkowej(geny bromkowe)

• działają stabilizująco na procesy utrzymujące stabilność genetyczne komórki(opiekuńcze)

Rola genów supresorowych w procesie nowotworzeni ujawnia się dopiero po inaktywacji obu alleli danego genu

Mutacja inaktywująca w obszarze genów supresorowych powoduje nadmierną proliferację

Geny supresorowe: TP53 – strażnik genomu, RB1(retinoblatoma1)

Prawidłowe białko P53 jest kinazowym negatywnym regulatorem cyklu komórkowego:

• rola: kontrola integralności genomu – „strażnik genomu”

P53 w prawidłowych warunkach jest połączone mdm2 i jest nieaktywne

Udział białka P53 w kontroli naprawy DNA polega na modulowaniu aktywności helikaz (enzymy usuwające uszkodzone DNA)

W przypadku gdy reperacja DNA zawodzi, białko P53 usuwa je w procesie programowanej śmierci komórki, dlatego białko P53 jest nazywane „genem ku śmierci”

Przy mutacji białka P53 komórka podlega nowym proliferacjom mimo uszkodzonego DNA

„Teoria dwóch zdarzeń” – aby gen supresorowe (Rb) utracił funkcję konieczne są mutacje w obu allelach.

Białko pRB:

• wykazuje zróżnicowane ufosforylowanie determinujące jego aktywność

• w G1 znajdują się w formie nieufosforylowanej / powstaje po każdorazowym zakończeniu mitozy

• kontrolują przejście fazy G1 w fazę S

Fosforylacja pRB = zwolnienie blokady cyklu

Rak pęcherza moczowego:

Temat: Regulacja cyklu komórkowego II

● Regulacja cyklu kom. polega na oddziaływaniu w odpowiednim czasie czynników pobudzających i hamujących

● Przechodzenie przez cykl komórkowy jest regulowane poprzez fosforylację odpowiednich białek enzymatycznych

● Cykliny pełnią rolę regulacyjnych podjednostek dla CDK-1 ich nazwa pochodzi z cyklicznej zmiany stężenia w poszczególnych fazach cyklu komórkowego

Wyróżnia się:

● Cykliny mitotyczne (klasy A i B)

● Cykliny G1 – Di E

Cykliny :

● G2 –> A, B i D

● Mitoza –> B i D

● G1 –> D i E

● Faza syntezy –> A, B i D

Osiągają swoje odpowiednie stężenia

Cyklina B jest najważniejsza

Cykliny	kinazy cyklino zależne	inhibitory kinaz cyklinozależnych
D1,2,3	CDK 4,6	białka INK4(p16,15,18,19)
E	CDK4	rodzina CipKip (p21^Cip1, 27^Kip1, 57^Kip2)
A	CDK 1,2	rodzina CipKip (p21^Cip1, 27^Kip1, 57^Kip2)
B	CDK 1	rodzina CipKip (p21^Cip1, 27^Kip1, 57^Kip2)

● Cykliny A i B prawdopodobnie utrzymują stan hiperfosforylacji białka RB w dalszych fazach cyklu komórkowego

Odłączenie grupy fosforanowej od białka RB następnie dopiero wtedy, gdy komórka wchodzi ponownie w fazę G1 lub w fazę spoczynkową G0

Zdjęcie cyklu z cyklinami i procesem fosforylacji białka RB

Cykliny fazy G1

● Cykliny fazy G1 aktywne we wczesnych fazach cyklu komórkowego

Wykryto 3 cykliny klasy D:1,2,3 oraz cyklinę E – tworzą one komponenty z odpowiednimi kinazami z rodziny CDK

Kompleksy złożone z cyklin D i E oraz odpowiednich kinaz fosforylują białko RB

Podczas fazy S dochodzi do gwałtownego obniżenia stężenia cykliny E (ciągle w wartościach fizjologicznych)

Ekspresja cyklin D jest uzależniona raczej od zewnętrznych bodźców mitogennych niż od fazy cyklu

● Cyklina D jest funkcjonalnie związana z CDK 4 i 6 i działa głównie we wczesnej i środkowej fazie G1

Cyklina E:

● Jest białkiem składającym się z 395 a-a , kodowanym przez gen znajdujący się na chromosomie 19

● Cyklina E jest obecna w komórce od późnej fazy G1 do wczesnej fazy syntezy

● Najwyższe stężenie tej cykliny stwierdza się w okolicy pkt restrykcyjnego

● Białko to pełni kluczową rolę w promocji komórki do fazy S ulegając zwrotnej aktywacji przez czynnik EF2

● W warunkach prawidłowych liczba komórek, które wykazują ekspresję cykliny E, gwałtownie się zmniejsza po wejściu komórek do fazy S cyklu

● Cyklina E może występować w kilku izoformach wynikających z alternatywnego składania mRNA (splicing)

Cyklina E jako główny czynnik regulujący przejście komórki z fazy G1 do fazy S, kontroluje

► Proces replikacji DNA

► Proces duplikacji centrosomów

► Aktywację transkrypcji

● W komórkach różnych nowotworów może dochodzi do zmian w ekspresji cykliny E

● Najczęściej mechanizm tych zmian polega na amplifikacji genu który koduje to białko lub zaburzenia regulacji ekspresji cykliny E w poszczególnych fazach cyklu komórkowego

Można przypuszczać, że mutacje prowadzące do podwyższenia stężenia cyklin pełnią ostatnią rolę w mechanizmie niekontrolowanych podziałów komórkowych

Kluczowym procesem podczas regulacji cyklu komórkowego jest proces fosforylacji

Fosforylacji dokonują kinazy zależne od cyklin (CDK), które fosforylują grupy serynowe i treoninowe białek i są aktywowane przez cykliny

Spośród grupy kinaz szczególną role odgrywa CDK1 która przenosi grupy fosforanowe z ATP na różne białka, jest kinazą białkową

Cyklina B łączy się CDK2 -> dochodzi do fosforylacji Thr161, 14, Tyr 15 -> dalej jest de-P i białko jest aktywne

Cykliczna aktywacja CDK przez cykliny stwarza warunki samonapędzającego się cyklu/wczesne stadia embriogenezy:

● Krótki czas trwania

● Istnienie wewnętrznego napędu przejawiającym się :

→ cyklicznymi zmianami stężenia cyklin

→ brak wpływu czynników zewnętrznych

→ zredukowane fazy G1 i G2

Hamowanie cyklu jest pod kontrolą inhibitorów CDK czyli CKI – uniemożliwiają one:

● wiązanie się cyklin z CDK

● blokują wiązanie kompleksu cyklina/CDK z substratem

Rodziny CKI:

● rodzina białka P21: p27, p57

● rodzina białka INK4: p15,16,18,19

Stężenie CKI w komórce zwłaszcza białka p21 jest regulowane na poziomie transkrypcji pobudzanej przez białko p53

W warunkach prawidłowych p21 charakt. Się niskim poziomem ekspresji i pobudza cykl kom.

Pod wpływem czynników stresowych dochodzi do wzrostu ekspresji p21, co skutkuje inhibicją kompleksu cyklina/CDK

W większości komórek nowotworowych białko p21 nie funkcjonuje jako białko kontrolne co ma związek z mutacja p53 – wówczas obserwuje się zahamowanie apoptozy poprzez blokadę kaspazy 3 i czynnika ASK1

Faza G1 jest fazą ,w której czynniki regulujące wzrost i podział komórki mające zasadnicze znaczenie

Zaburzenia cyklu w tej fazie wywołane dysregulacją w układzie cyklina/aktywność kinazy zależnej od cyklin prowadzą do inicjacji nowotworzenia

Przejście G1-S:

► Zaangażowane są: CDK4 i 6, cykliny D1,2,3

► Pełna aktywność kompleksów cykliny/CDK pojawia się prze niskim stężeniu p27 i nieczynności białka RB

Czynniki fazy S (SPF):

► Współdziałają z kompleksami cyklina E/CDK2 i cyklina A/ CDK@

► Faza G2 pozostaje pod kontrolą kompleksu cyklina A/CDK1

Przejście G2-M:

● Rozpoczęcie mitozy zależy od kompleksów cykl B1, B2/CDK1 nazywane jako MPF

● Do pojawienia się pełnej aktywności kompl. B/CDK potrzebna jest fosforylacja i defosforylacja CDK1

Wyjście komórki z mitozy:

● Zestaw białek wyjścia z mitozy to kompleks MEN powodujący inaktywację kompleksu Cyklina B/CDK1

Zewnętrzna regulacji cyklu komórkowego:

- cytokiny: PDGF, EGF, FGF, TGF, TNF + nazwy skrótów

Cytoplazmatyczne fragmenty receptorów dla cytokin posiadają aktywność kinaz, które odpowiadają za autofosforylację

Fosforylowane fragmenty receptorów mogą wiązać białka posiadające grupę SH2 która rozpoznaje dysfosforylowane fragmenty receptorów

Białka posiadające grupę SH2:

→ Fosfolipaza C

→ Kinaza tyrozynowa

→ Białka Ras aktywujące kinazy MAP i ERK ()powodujące aktywacje genów biosyntezę białek i cos jeszcz

Temat: Mechanizmy śmierci komórki – autofagia, apoptoza, nekroza, onkoza

Główne cechy odróżniające kom apoptotyczne od martwiczych:

● proces aktywny

● wymagający uruchomienia uśpionych szlaków biochemicznych oraz syntezy nowych białek

● dotyczy pojedynczych komórek

Martwica jest:

● Procesem pasywnym

● Wywołanym czynnikami zewnątrzpochodnymi powodującymi rozległe uszkodzenia komórek

● Obejmuje skupiska komórek

● Zachodzi masowo w jednym określonym momencie

Efektem finalnym jest reakcja zapalna! W wyniku wylania substancji z wewnątrz

Komórki martwicze są obrzmiałe:

→ Rozmycie błony komórkowej

→Wylanie się cytoplazmy do przestrzeni pozakomórkowej

→ Pękanie błon otaczających lizosomy i mitochondria

Komórki apoptotyczne kurczą się:

→ błona komórkowa zostaje uwypuklona

→ podział komórki na wiele obłonionych fragmentów zwanych ciałkami apoptotycznymi/zawierają cytoplazmę i funkcjonalne organelle

Zmiany w strukturze jądra komórkowego:

● chromatyna zostaje skondensowana obwodowo, a kształt jądra komórkowego pozostaje długo niezmieniony

Kaspazy:

► Proteazy cysteinowe

► występują w cytoplazmie większości komórek jako nieaktywne proenzymy, mające postać pojedynczego łańcucha polipeptydowego

Aktywacja kaspaz następujące wskutek dwóch reakcji enzymatycznych:

1. Podział łańcucha polipeptydowego proenzymu na łańcuch długi i krótki i odcięcie N-końcowej prodomeny

2. Agregacja łańcuchów krótkich i długich tworzących aktywy tetramer mający 2 miejsca katalityczne

Kaspazy rozpoczynają proces apoptozy (inicjatorowe): 8,9,10

Kaspazy aktywowane przez proteolizę zależna od innych enzymów/efektorowe lub egzokutorowe : 3,6,7

W komórkach występują endogenne inhibitory apoptozy , czyli AP:

● są to drobnocząsteczkowe białka wiążące kaspazy

● zapobiegają apoptozie, której przyczyną może być spontaniczna aktywacja kaspaz

Jednym z ważniejszych IAP jest białko surwiwina/blokuje aktywność kaspazy 3 i 7/ - pojawia się w komórkach wchodzących w mitozę i asocjuje z mikrotubulach wrzeciona mitotycznego

Np. ekspresja surwiwiny w jądrach raka jajnika

Szlak zewnątrzpochodny apoptozy:

→ Biorą udział białko Fas (CD95) – zlokalizowane w błonie komórce docelowej razem z ligandem

→ Białko adaptorowe

→ Prokaspaza 8

Zewnętrzny szlak programowanej śmierci opiera się głownie na receptorach błonowych oraz ligandach

Do receptorów śmierci zaliczamy białka nadrodziny TNF:

► TNFR1

► TNFR2

►Fas/CD95 – ta rodzina jest nazywana rodziną receptorów śmierci

► TRAIL

Po związaniu odpowiedniego liganda z receptorem błonowym sygnał śmierci jest przekazywany do białka adaptorowego FADD, które posiada domenę DD (death domain) i łączy się z domeną DD receptora

Na N-końcowym łańcucha polipeptydowego białka FADD znajduje się domena DED (death efector domain), która umożliwia połączenie z odcinkiem DED prokaspazy 8 lub 10

Aktywowane kaspazy zapoczątkowują działanie kaskady kaspaz wykonawczych prowadzących do śmierci komórki

Szlak receptorowy może się łączyć ze szlakiem wewnętrznym poprzez białko Bid, które ulega proteolizie w wyniku powstaje tBid

Skrócona postać peptydu przemieszcza się do powierzchni mitochondrium i wpływa na uwalnianie cytochromu c.

Szlak wewnątrzpochodny apoptozy:

► Mitochondrium z cytochromami c w błonie wewnętrznej

► Białka adaptorowe (np. Apaf-1) – łączą się z cytochromem c

► Inaktywowana prokaspaza 9

Szlak mitochondrialny jest aktywowany w wyniku:

● wzrost stężenia reaktywnych form tlenu

● stresu oksydacyjnego

● uszkodzeń DNA

● zaburzeń transportu elektrolitów

● wzrost stężenia jonów wapnia w cytoplazmie – ważny przekaźnik II rzędu

Najważniejszym elementem tego szlaku są megakanałów (PTP) umiejscowione na styku dwóch błon mitochondrialnych

Endonukleaza G oraz flawoproteina AIF przemieszcza się do jądra komórkowego i wpływają na apoptotyczne zmiany jądra.

Regulatory apoptozy czyli białka z rodziny Bcl-2

● inhibitory apoptozy:

Blc-2, Blc-xl, Bcl-w, mcl-1

● białka promujące programowaną śmierć komórki:

Bid, Bad, Bak, Bax, Noxa

Białko p53 i apoptoza:

Białko p53 może wpływać na zahamowanie ekspresji białek antyapoptotyczne m.in. Bcl-2 i surwiwiny

Apoptoza bywa też nazywana „cichą śmiercią” komórek:

● ciałka apoptotyczne są szybko usuwane z tkanek / obecność na ich powierzchni fosfatydyloseryn

● aktywacja apoptozy wiąże się z uaktywnieniem błonowego białka – floppazy / dokonuje translokacji fosfatydyloseryny z powierzchni wewnątrzkomórkowej na powierzchnię zewnątrzkomórkową błony

Temat: