KULTURY KORZENI TRANSFORMOWANYCH
Transformacja genetyczna - proces przenoszenia obcych fragmentów DNA (genów) do genomu biorcy i stabilną ich integrację
z tym genomem. Wprowadzony fragment DNA ulega ekspresji w genomie gospodarza, przez co możemy uzyskać rośliny
o nowych lub ulepszonych cechach. Rośliny transgeniczne - rośliny uzyskane za pomocą transformacji genetycznej.
Agrobacterium to rodzaj wolno żyjących bakterii glebowych, które atakują rośliny wnikając do nich przez zranione tkanki. W przypadku Agrobacterium tumefaciens zakażenie prowadzi do powstawania tumorowatych narośli na szyjce korzeniowej, natomiast Agrobacterium rhizogenes wywołuje chorobę objawiającą się powstawaniem w miejscu infekcji obfitej masy tzw. korzeni włośnikowatych.
Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wykorzystuje naturalną zdolność tych bakterii do przekazywania części swojego materiału genetycznego komórkom roślinnym. Tworzenie się korzeni włośnikowatych lub zrakowaceń korzeni jest objawem wbudowania do genomu rośliny-żywiciela odcinka bakteryjnego DNA zwanego T-DNA (z ang. transfer - przeniesienie). T-DNA zanim zostanie przetransportowane do komórki roślinnej wchodzi w skład plazmidu, zwanego
Ti w przypadku A. tumefaciens (z ang. tumor inducing), lub Ri - w przypadku A. rhizogenes (ang.root inducing).
Typowy odcinek T-DNA ma wielkość około 20 tys. p.z. i zawiera geny, których działanie w roślinie powoduje charakterystyczne objawy chorobowe - poza wspomnianymi już naroślami i korzeniami włośnikowatymi, należy do nich nagromadzanie się w tkankach porażonej rośliny nietypowych dla zdrowych roślin metabolitów, zwanych opinami (są to pochodne aa i kw. karboksylowych; jakkolwiek pod wpływem Agrobacterium wytwarzają je rośliny, dla roślin substancje te są nieprzyswajalne, natomiast stanowią doskonałą pożywkę dla bakterii). Geny wywołujące tworzenie się korzeni włośnikowatych lub zrakowaceń nazywane są onkogenami. Jeśli z plazmidu Ti lub Ri usunie się onkogeny i geny syntezy opin i zastąpi je jakimkolwiek innym DNA (nazwijmy je insertem), to - o ile tylko nie zostaną przy tym uszkodzone sekwencje graniczne - bakteria nie pozna się na podstępie i przekaże ten insert do rośliny.
W praktyce nie przeprowadza się ligacji użytkowego genu z bakteryjnym megaplazmidem. Bardzo duże cząsteczki DNA są niewygodne w obróbce - ponieważ występują w komórkach w małej liczbie kopii, więc trudno izolować je w większej ilości; typowe enzymy restrykcyjne tną je na wiele fragmentów, więc trudno wbudować do nich jakąkolwiek wstawkę DNA (insert); problemem byłoby też ponowne wprowadzenie do bakterii zmodyfikowanego megaplazmidu. Na ogół więc transgen wprowadzany jest do Agrobacterium w niewielkim plazmidzie, łatwo poddającym się manipulacjom. Plazmid ten może zawierać obie sekwencje graniczne i pomiędzy nie wklonowuje się transgen czy transgeny. Przy takim podejściu bakterie wycinają T-DNA bezpośrednio z niewielkiego plazmidu i przekazują go roślinie. Plazmid binarny można łatwo powielać, izolować i modyfikować nie tylko dlatego że jest mały, ale także dlatego że ma charakter wektora wahadłowego, to znaczy ulega powielaniu w dwóch gatunkach organizmów - w tym przypadku zarówno w bakteriach Agrobacterium jak i Escherichia coli (plazmid ten zawiera więc miejsca ori umożliwiające rozpoczęcie pracy polimerazom DNA obu gatunków bakterii; izolacja DNA i transformacja jest łatwiejsza i wydajniejsza w przypadku E. coli niż Agrobacterium, więc przygotowując konstrukt wykorzystuje się ten pierwszy rodzaj bakterii, a dopiero na końcowym etapie prac wprowadza się go do Agrobacterium).
W procesie przeniesienia fragmentu DNA do komórki roślinnej za pośrednictwem Agrobacterium można wyróżnić następujące etapy:
przygotowanie hodowli Agrobacterium - wprowadzenie odpowiedniego DNA do wektora wahadłowego i transformowanie tym wektorem komórek Agrobacterium; założenie hodowli bakterii na płynnej pożywce
inkubacja bakterii z fragmentami roślin poddawanych transformacji (często pochodzącymi z aksenicznych kultur in vitro); można tu wyróżnić etap koinkubacji - roślinne eksplantaty inkubowane są przez kilka minut do kilku godzin w zawiesinie bakterii - i etap kokultury - eksplantaty przeniesione są na agarową pożywkę pobudzającą regenerację roślin i nie hamującą wzrostu Agrobacterium
regeneracja roślin na pożywce zawierającej czynnik eliminujący Agrobacterium (antybiotyki z grupy penicylin np. karbenicylina i cefalosporyn); często pożywka ta zawiera też antybiotyk lub herbicyd pozwalający na wyselekcjonowanie transformantów (pożywka selekcyjna)
ukorzenianie transformantów; może wymagać zmiany zestawu fitohormonów (albo ich pominięcia); czasami konieczne jest też obniżenie stężenia czynnika selekcyjnego
testy potwierdzające obecność transgenów w zregenerowanych roślinach i całkowite wyeliminowanie Agrobacterium
przeniesienie roślin do ziemi, hartowanie; analizy molekularne, fizjologiczno-biochemiczne i genetyczne.
Alternatywnym żródłem wielu cennych produktów pochodzenia roślinnego, m.in. substancji aktywnych farmakologicznie, substancji aromatycznych, barwników, niektórych białek (enzymów) i specyficznych polisacharydów mogą być roślinne kultury in vitro, w tym korzenie transformowane (transgeniczne, włośnikowate). Korzenie transformowane, powstające
w wyniku transformacji plazmidowego DNA bakterii glebowych Agrobacterium rhizogenes, charakteryzują się szybkim przyrostem biomasy, stabilnością genetyczną, wydajną, utrzymującą się na stałym poziomie biosyntezą metabolitów.
Z genomem komórki rośliny integruje się fragment plazmidu Ri (T-DNA) pochodzący z komórki bakteryjnej i wywołana ekspresja zawartych w tym fragmencie DNA genów prowadzi do powstania na eksplantacie, w miejscu zakażenia, korzeni przybyszowych. Korzenie te po oddzieleniu od eksplantatu i eliminacji bakterii mogą rosnąć w kolbach lub różnego typu bioreaktorach, na stałym lub w płynnym podłożu bez dodatku regulatorów wzrostu. W przeciwieństwie do kultur komórkowych, kultury korzeni włośnikowych charakteryzują się znaczną stabilnością i mogą utrzymywać wydajną biosyntezę metabolitów podczas długotrwałego pasażowania. Produkcja metabolitów w tych kulturach jest zbliżona lub wyższa niż w korzeniach rośliny macierzystej.