Produkcja roœlinnych metabolitów
wtórnych w kulturach organów
transformowanych

Halina Wysokiñska, Aleksander Chmiel

Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej,
Uniwersytet Medyczny, £ódŸ

Secondary metabolites production in cultures of transformed plant
organs

S u m m a r y

Plant cell cultures in vitro produce secondary metabolites with varied effec-

tiveness. Despite industrial application of only few cell suspension cultures,
considerable progress in research on plant cell biotechnology has been made
over the last few years. Transformed organ cultures, especially hairy roots,
seem to be an interesting model for stable production of plant metabolites with
high yield. In this paper, cultures of hairy roots of Salvia sclarea, S. officinalis,
S. miltiorrhiza, S. przewalskii, and Centaurium erythraea, as well as transformed
shoots and plants of C. erythraea are presented. Also, production of secondary
metabolites in these cultures is discussed.

Key words:
plant cultures, transformed shoots, transformed roots, secondary metabo-

lite production.

1. Wstêp

Roœlinne metabolity wtórne s¹ szeroko wykorzystywane jako

farmaceutyki, substancje zapachowe i aromatyzuj¹ce, barwniki,
biopestycydy i dodatki do ¿ywnoœci. Szacuje siê, ¿e 25% leków
stosowanych w krajach uprzemys³owionych zawiera zwi¹zki,
które bezpoœrednio lub poœrednio (semisynteza) pochodz¹ z roœ-
lin (1). Metabolity wtórne s¹ niskocz¹steczkowymi zwi¹zkami
organicznymi o bardzo ró¿norodnej strukturze chemicznej. Nie

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Halina Wysokiñska,
Katedra Biologii
i Biotechnologii
Farmaceutycznej,
Uniwersytet Medyczny,
ul. Muszyñskiego 1,
90-151 £ódŸ;
e-mail:
[e-mail]

4 (75) 124–135 2006

odgrywaj¹ one istotnej roli w podstawowych procesach ¿yciowych roœlin (wzrost,
ró¿nicowanie, rozmna¿anie), ale mog¹ spe³niaæ inne wa¿ne funkcje, np. w interakcji
roœlina – œrodowisko. Liczba roœlinnych metabolitów wtórnych szacowana jest na
100 000 (2) do 200 000 (3). Ka¿dego roku wykrywa siê oko³o 1600 nowych zwi¹z-
ków (4), co jest zrozumia³e zwa¿ywszy, ¿e znanych jest oko³o 400 000 gatunków
roœlin wy¿szych, a dotychczas jedynie oko³o 10% z nich zbadano fitochemicznie. Je-
den tylko gatunek Arabidopsis thaliana mo¿e wytwarzaæ 5000 ró¿nego typu metabo-
litów (5,6). Dla porównania, liczba poznanych metabolitów wtórnych syntetyzowa-
nych przez drobnoustroje oceniana jest na ponad 20 000, a przez zwierzêta na
oko³o 2500 (7,8).

Metabolity roœlinne pozyskiwane s¹ najczêœciej przez ekstrakcjê z surowca roœ-

linnego pochodz¹cego z uprawy. Jednak zawartoœæ tych zwi¹zków w roœlinach jest
zazwyczaj niska (czêsto poni¿ej 1% suchej masy) i zmienna, uzale¿niona od warun-
ków œrodowiska. Niedogodnoœci¹ mo¿e byæ tak¿e ograniczona dostêpnoœæ surowca
roœlinnego; w wielu przypadkach cenne zwi¹zki pochodz¹ z roœlin rzadko wystê-
puj¹cych, chronionych lub rosn¹cych tylko w okreœlonych warunkach klimatycznych.
W konsekwencji mo¿e to prowadziæ do niedoboru wa¿nych dla lecznictwa zwi¹z-
ków, takich jak np. artemizyna – substancja o dzia³aniu przeciwmalarycznym wy-
twarzana przez Artemisia annua (bylica roczna) (9). Wszystkie te fakty przemawiaj¹
za wykorzystaniem do wytwarzania cennych metabolitów roœlinnych metod bio-
technologicznych. Do zalet tych metod nale¿¹ m.in. kontrolowane warunki hodowli
umo¿liwiaj¹ce otrzymanie jednorodnego materia³u roœlinnego, uniezale¿nienie siê
od stref klimatycznych i pór roku, a tak¿e mo¿liwoœæ znacznego zwiêkszenia pro-
duktywnoœci przez selekcjê wysoko wydajnych linii lub elicytacjê. Nie bez znaczenia
jest fakt, ¿e kultury in vitro mog¹ syntetyzowaæ nowe zwi¹zki, nie wykryte dotych-
czas w œwiecie roœlin. Gräther i Schneider (10) podaj¹, ¿e do po³owy 1999 r. z kultur
in vitro wyizolowano i okreœlono strukturê 322 nowych zwi¹zków, z których wiêk-
szoœæ nale¿y do terpenoidów (100), alkaloidów (72) i fenoli (144). Siedemnaœcie no-
wych taksanów wykryto w wyniku intensywnych badañ fitochemicznych kultur
in vitro roœlin z rodzaju Taxus (10). Najwiêcej nowych zwi¹zków znaleziono w kultu-
rach zawiesinowych, które s¹ najczêœciej wykorzystywanym modelem badawczym.
Oko³o 100 nowych zwi¹zków wykryto w tkankach kalusowych, 30 w kulturach ko-
rzeni nietransformowanych, a 20 w kulturach korzeni transformowanych.

Dotychczas niewielki jest udzia³ roœlinnych kultur in vitro w produkcji metaboli-

tów wtórnych na skalê przemys³ow¹. Przyk³adem s¹ podjête pod koniec lat 80.
XX w. przez japoñsk¹ firmê Nitto Denko Corporation, próby otrzymywania ginseno-
zydów z kultur zawiesinowych Panax ginseng, które doprowadzi³y do opracowania
technologii realizowanej w bioreaktorach o pojemnoœci 2 m

3

, a nastêpnie 20 m

3

(11). Innym przyk³adem jest przemys³owa produkcja paklitakselu w kulturach Taxus
spp. W niemieckiej firmie Phyton Gesellschaft für Biotechnik mbH prowadzone by³y
próby w bioreaktorach o pojemnoœci 75 m

3

(12). Brak jest potwierdzenia realizacji

tej technologii. Tymczasem od kilku lat koreañska firma SamYang Genex Corp. ofe-

Produkcja roœlinnych metabolitów wtórnych w kulturach organów transformowanych

BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 124-135 2006

125

ruje jako produkt handlowy lek Genexol, zawieraj¹cy paklitaksel z bioreaktorowych
kultur zawiesinowych Taxus sp. (13).

Niewielkie wykorzystanie kultur in vitro do produkcji metabolitów wtórnych wy-

nika m.in. z nie zawsze jeszcze wystarczaj¹cej ich wydajnoœci, ma³ej stabilnoœci ge-
netycznej i biochemicznej, co wymaga ci¹g³ej selekcji i zwiêksza koszty wytwarza-
nia produktu. Na koszty procesu niekorzystnie wp³ywa równie¿ fakt, ¿e komórki
zwykle nie wydzielaj¹ po¿¹danych substancji do pod³o¿a, lecz gromadz¹ je w waku-
olach czy innych organellach, w wyniku czego potrzebne jest poddanie uzyskanej
biomasy procesowi ekstrakcji (14). Niska wydajnoœæ lub brak zdolnoœci do biosynte-
zy niektórych metabolitów w kulturach zawiesinowych ma czêsto zwi¹zek z bra-
kiem zró¿nicowanych struktur. Ten problem mo¿na wyeliminowaæ stosuj¹c kultury
organów.

Znaczny postêp w wykorzystaniu metod biotechnologicznych do wytwarzania

metabolitów sta³ siê mo¿liwy pod koniec lat 80. XX w., kiedy otrzymano kultury ge-
netycznie transformowanych organów. Kultury takie rosn¹ szybciej i pozwalaj¹ osi¹-
gaæ znacznie wy¿sze przyrosty biomasy ni¿ kultury organów nietransformowanych.
Kultury organów transformowanych obejmuj¹ kultury pêdów tzw. teratomy pêdowe
i kultury korzeni transformowanych, zwanych równie¿ w³oœnikowatymi lub transge-
nicznymi.

2. Kultury transformowanych pêdów

Kultury transformowanych pêdów otrzymuje siê w wyniku transformacji tkanek

roœlinnych niektórymi szczepami Agrobecterium tumefaciens. Najczêœciej wykorzysty-
wane s¹ oktopinowe i nopalinowe szczepy z genem izopentylotransferazy (gen ipt)
(15). Produkt tego genu zmienia w komórkach stosunek auksyn do cytokinin, w wy-
niku czego na eksplantatach powstaje tkanka tumorowa, z której regeneruj¹ siê
pêdy. Ich morfologia jest zmieniona w porównaniu z pêdami normalnymi; okreœla
siê je czêsto mianem teratom pêdowych. Dotychczas teratomy pêdowe otrzymano
dla niewielkiej liczby roœlin; nale¿¹ do nich m.in. przedstawiciele rodziny Solanaceae:
Atropa belladonna i Duboisia leichnardhi x D. myoporoides. Obie kultury maj¹ zdolnoœæ
biokonwersji hioscyjaminy w skopolaminê (16). Teratomy pêdowe otrzymano rów-
nie¿ z Pimpinella anisum (17), Mentha citrata, Coleus forskohlii, Nicotiana tabacum (18)
i Artemisia annua (19). Biosynteza metabolitów wtórnych w tych kulturach jest zró¿-
nicowana. Teratomy pêdowe Solanum dulcamara syntetyzuj¹ glikoalkaloidy w iloœci
1% suchej masy, tj. 5 razy wiêcej ni¿ roœlina macierzysta (20).

W kulturze transformowanych pêdów A. annua (19) wykryto ponad 0,06% artemi-

zyny w przeliczeniu na such¹ masê, podczas gdy hodowane in vitro pêdy nietransfor-
mowane wytwarzaj¹ zaledwie 0,02% tego izoprenoidu. Jednak¿e obie te iloœci s¹
znacznie ni¿sze ni¿ w liœciach roœliny macierzystej, które zawieraj¹ prawie 1% arte-
mizyny (21).

Halina Wysokiñska, Aleksander Chmiel

126

PRACE PRZEGL¥DOWE

3. Kultury transformowanych korzeni

Znacznie czêœciej ni¿ teratomy pêdowe dla wytwarzania metabolitów wtórnych

wykorzystywane s¹ kultury korzeni w³oœnikowatych. Korzenie te otrzymuje siê
w wyniku transformacji genetycznej szczepami Agrobacterium rhizogens. Integracja
z genomem komórki roœliny fragmentu plazmidu Ri (T-DNA) z komórki bakteryjnej
i ekspresja zawartych w tym fragmencie DNA genów (m.in. rol genów a, b, c, d) pro-
wadzi do powstania na eksplantacie, w miejscu zaka¿enia, korzeni przybyszowych.
Korzenie te po oddzieleniu od eksplantatu i eliminacji bakterii mog¹ rosn¹æ w kol-
bach lub ró¿nego typu bioreaktorach, na sta³ym lub w p³ynnym pod³o¿u bez dodat-
ku regulatorów wzrostu. W przeciwieñstwie do kultur komórkowych, kultury korze-
ni w³oœnikowych charakteryzuj¹ siê znaczn¹ stabilnoœci¹ i mog¹ utrzymywaæ wy-
dajn¹ biosyntezê metabolitów podczas d³ugotrwa³ego pasa¿owania (22). Produkcja
metabolitów w tych kulturach jest zbli¿ona lub wy¿sza ni¿ w korzeniach roœliny ma-
cierzystej. W tabeli 1 przedstawiono zebrane z ostatnich dziesiêciu lat przyk³ady
kultur korzeni transformowanych produkuj¹cych znaczne iloœci metabolitów wtór-
nych.

T a b e l a 1

Przyk³ady wysoko produktywnych kultur korzeni transformowanych

Roœlina

Szczep A. rhizogenes

Metabolity

Literatura

Linum flavum

LBA 9402, TR 105

koniferyna, 58 mg/g s.m.

(23)

Lupinus mutabilis

AR1601

izoflawony, 2× wiêcej ni¿ korzenie nietransformowane

(24)

Camptotheca acuminata ATCC 15834,

R-100

kamtotecyna, 1 mg/g s.m.
hyroksykamptotecyna, 0,15 mg/g s.m.

(25)

Solanum mauritanum

LBA 9402

solasodyna, 184

mg/g s.m.

6× wiêcej ni¿ korzenie roœliny macierzystej

(26)

Puerearia phasoloides

ATCC 15834

pueraryna, 1,19 mg/g s.m. (w kolbach) i 5,57 mg/g s.m.
(w bioreaktorze)
5× wiêcej ni¿ w korzeniach nietransformowanych

(27)
(28)

Tylophora indica

A4

tyloforyna
2× wiêcej ni¿ w korzeniach roœlin nietransformowa-
nych

(29)

Physalis minima

ATCC 15834

glukozyd solasodyny,
9,11

mg/ g s.m., 20× wiêcej ni¿ korzenie i 3× wiêcej

ni¿ liœcie

(30)

Ocimum basilicum

MAFF 03-01724

kwas rozmarynowy, 14% s.m.
3,5× wiêcej ni¿ liœcie

(31)

Valerianella lacustra

A4, ATCC 15834

walepotriaty (po elicytacji MeJA), 50× wiêcej ni¿ w roœ-
linie

(32)

Ambrosia maritima

ATCC 15834

poliacetyleny, 9,6× wiêcej ni¿ w kulturze zawiesinowej

(33)

Produkcja roœlinnych metabolitów wtórnych w kulturach organów transformowanych

BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 124-135 2006

127

4. Prace w³asne

Wytwarzanie metabolitów wtórnych w kulturach korzeni transformowanych jest

równie¿ przedmiotem badañ w naszej Katedrze. Spoœród otrzymanych dotychczas
kultur (tab. 2) omówione zostan¹ kultury badane w ostatnich latach.

T a b e l a 2

Kultury korzeni transformowanych otrzymane w Katedrze Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej

Gatunek

Rodzina

Szczep A. rhizogenes

Metabolity

Catalpa ovata

Bignoniaceae

LBA 9402

werbaskozyd, izowerbaskozyd

Hyssopus officinalis

Lamiaceae

LBA 9402

kwas rozmarynowy

Paulownia tomentosa

Bignoniaceae

LBA 9402

werbaskozyd

Arnica montana

Asteraceae

LBA 9402

pochodne tymolu, olejek eteryczny, kwas chlorogenowy

Salvia sclarea

Lamiaceae

LBA 9402

diterpeny, triterpeny, sterole, kwas rozmarynowy, tan-
szinony

S. officinalis

Lamiaceae

A4, ATCC 15834

S. miltiorrhiza

Lamiaceae

A4

S. przewalskii

Lamiaceae

A4

Centaurium erythraea

Gentianaceae

LBA 9402

glikozydy sekoirydoidowe

4.1. Korzenie transformowane S. sclarea

Korzenie transformowane S. sclarea (sza³wia muszkato³owa) otrzymano po zaka-

¿eniu wyhodowanych in vitro pêdów szczepem Agrobacterium rhizogenes LBA9402
(34). Kultury prowadzono w p³ynnym pod³o¿u ½B5 (pod³o¿e wg Gamborga, ze
zmniejszon¹ do po³owy zawartoœci¹ makro- i mikroelementów) uzupe³nionym sa-
charoz¹ (30 g/l), w kolbach Erlenmeyera, w ciemnoœci i na œwietle (40

mmol m

-2

s

-1

).

Z tych kultur wyizolowano cztery abitanowe diterpeny, które zidentyfikowano jako:
salwipison, ferruginol, etiopinon i 1-ketoetiopinon (rys. 1). Wykazano, ¿e kultury
korzeni prowadzone na œwietle wytwarzaj¹ 2,4 razy wiêcej diterpenów (25,37 mg/g
s.m.) ni¿ korzenie hodowane w ciemnoœci (10,9 mg/g s. m.). W tych pierwszych za-
wartoœæ diterpenów by³a 11-krotnie wy¿sza ni¿ w kulturach korzeni nietransformo-
wanych i 8 razy wy¿sza ni¿ w korzeniach roœliny macierzystej. Dodatkowo korzenie
w³oœnikowate hodowane na œwietle osi¹gaj¹ maksymalny poziom diterpenów 30.
dnia cyklu wzrostu, czyli o 5 dni szybciej ni¿ korzenie prowadzone w ciemnoœci
(34).

Halina Wysokiñska, Aleksander Chmiel

128

PRACE PRZEGL¥DOWE

Wp³yw œwiat³a na produkcjê metabolitów w kulturach korzeni transformowa-

nych by³ obserwowany przez wielu badaczy. Œwiat³o stymulowa³o np. wytwarzanie
steroidowych saponin (akuleatyzydu A i B) w kulturach korzeni w³oœnikowatych
Solanum aculeatissmum (35) i zwiêksza³o produkcjê solasodyny (aglikon glikoalkalo-
idów wykorzystywany do pó³syntezy hormomów p³ciowych i kortykosteroidów)
w kulturach korzeni transformowanych Solanum khasianum (36). Jednak¿e Argolo
i wsp. (37) stwierdzili, ¿e rosn¹ce w ciemnoœci kultury korzeni w³oœnikowatych Solanum
aviculare akumuluj¹ 4,2 razy wiêcej solasodyny w porówaniu z kulturami hodowany-
mi na œwietle. Wysoka produkcja diterpenów w prowadzonych na œwietle korze-
niach w³oœnikowatych S. sclarea ma prawdopodobnie zwi¹zek z obecnoœci¹ chloro-
plastów, które przez wielu autorów proponowane s¹ jako miejsce biosyntezy tego
typu zwi¹zków (38). Dominuj¹cym diterpenem w korzeniach transformowanych
S. sclarea jest etiopinon, którego zawartoœæ w kulturach prowadzonych na œwietle
i w ciemnoœci stanowi, odpowiednio, 45 i 37% sumy diterpenów. Jest to wa¿ne
bior¹c pod uwagê wyniki badañ biologicznych, na podstawie których wykazano, ¿e
etiopinon charakteryzuje siê znaczn¹ aktywnoœci¹ przeciwbakteryjn¹ (39,40) i udo-
wodnion¹ w badaniach in vitro aktywnoœci¹ cytotoksyczn¹ (40) oraz zdolnoœci¹ do
indukcji apoptozy (41). Inny diterpen o dzia³aniu bakteriostatycznym i bakteriobój-
czym wobec niektórych bakterii gramdodatnich – salwipison (39), wytwarzany jest
w kulturach korzeni transformowanych w znacznie ni¿szych iloœciach (3,1 mg/g
s. m. w korzeniach hodowanych na œwietle i 2,5 mg/g s. m. w kulturach rosn¹cych
w ciemnoœci).

Kultury korzeni transformowanych S. sclarea prowadzono równie¿ w 10-litro-

wym bioreaktorze aeroponicznym (fot. 1). Po 30. dniach hodowli obserowano
16-krotny przyrost œwie¿ej i i 14-krotny suchej masy w stosunku do inokulatu. Oka-
za³o siê jednak, ¿e te warunki nie sprzyjaj¹ wytwarzaniu diterpenów, których zawar-
toœæ by³a 2,2 raza ni¿sza ni¿ w korzeniach rosn¹cych w kolbach Erlenmeyera.

Z korzeni transformowanych S. sclarea oprócz diterpenów wyizolowano jeszcze

dwa pentacykliczne triterpeny, di- i trihydroksypochodne kwasu ursolowego: kwas

Produkcja roœlinnych metabolitów wtórnych w kulturach organów transformowanych

BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 124-135 2006

129

Rys. 1. Diterpeny w kulturze korzeni transformowanych S. sclarea: 1) salwipison (12-hydroksy-

-4,5-seko-5,10-friedo-4(18),5(10),6,8,12-abietapentaen-11,14-dion), 2) ferruginol (12-hydroksyabieta-
-8,11,13-trien), 3) etiopinon (4,5-seko-5,10-friedo-abieta-4(18),5,6,8,13-pentaen-11,12-dion), 4) 1-keto-
etiopinon (1-keto-4,5-seko-5,10-friedo-abieta-4(18),5,6,8,13-pentaen-11,12-dion).

2

a, 3a,-dihydroksyursolowy i kwas 2a, 3a, 24-trihydroksyursolowy (rys. 2). Pierw-

szy z nich wyizolowano z korzeni hodowanych na œwietle, drugi produkuj¹ korzenie
prowadzone w ciemnoœci. W obu kulturach, metod¹ GC-MS, wykryto kwas ursolowy
i kwas oleanolowy oraz trzy sterole (

b-sitosterol, stigmasterol i kampesterol (34).

Halina Wysokiñska, Aleksander Chmiel

130

PRACE PRZEGL¥DOWE

Fot. 1. Korzenie transformowane S. sclarea w bioreaktorze.

4.2. Korzenie transformowane S. miltiorrhiza i S. przewalskii

Salvia miltiorrhiza (sza³wia czerwonokorzeniowa) jest wa¿n¹ roœlin¹ lecznicz¹ wy-

korzystywan¹ g³ównie w Azji. Surowcem s¹ korzenie tej roœliny, a g³ównymi sk³adnika-
mi diterpeny, typu abietanu, z ugrupowaniem fantrenochinonowym, zwane tanszino-
nami. Diterpeny te stosowane s¹ g³ównie w chorobach uk³adu kr¹¿enia. Stwierdzono,
¿e korzenie sza³wii czerwonokorzeniowej transformowane szczepem A. rhizogenes A4,
i hodowane w ciemnoœci, w p³ynnym pod³o¿u ½B5 wytwarzaj¹ cztery tanszinony: tan-
szinon I, tanszinon IIA, kryptotanszinon i dihydrokryptotanszinon. Suma tych diterpe-
nów wynosi³a prawie 18 mg w przeliczeniu na gram suchej masy i by³a zbli¿ona do za-
wartoœci tych zwi¹zków w korzeniach 2-letnich roœlin rosn¹cych w gruncie (16,2 mg/g
s.m.) i a¿ 5-krotnie wy¿sza ni¿ w kulturze korzeni nietransformowanych (3,7 mg/g
s.m.), hodowanych równie¿ w pod³o¿u ½B5, ale z dodatkiem auksyny (IAA 0,1 mg/l).
W kulturze korzeni transformowanych S. miltiorrhiza dominowa³ kryptotanszinon, któ-
rego zawartoœæ wynosi³a 5,8 mg/g s.m., czyli by³a dwukrotnie wy¿sza od zawartoœci
tego diterpenu w korzeniach roœliny macierzystej (2,6 mg/g s.m.).

Tanszinony wytwarzane s¹ równie¿ w korzeniach roœlin z gatunku S. przewalskii

(sza³wia przewalskiego). Jest to endemit wystêpuj¹cy w po³udniowo-wschodnich
Chinach. Jednak¿e otrzymane po transformacji szczepem A. rhizogenes A4, korzenie
w³oœnikowate tej roœliny wytwarzaj¹ jedynie niewielkie iloœci diterpenów; suma tan-
szinonu IA, tanszinonu IIA, kryptotanszinonu i dihydrotanszinonu wynosi³a ok.

Produkcja roœlinnych metabolitów wtórnych w kulturach organów transformowanych

BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 124-135 2006

131

Rys. 2. Metabolity triterpenowe w kulturze korzeni transformowanych S. sclarea: 1) kwas ursolowy,

2) kwas oleanolowy, 3) kwas 2

a,3a-dihydroksy-urs-12-en-28-owy, 4) kwas 2a,3a,24-trihydrok-

sy-urs-12-en-28-owy.

R

1

R

2

R

3

R

4

R

5

1

H

bOH

CH

3

CH

3

H

2

H

bOH

CH

3

H

CH

3

3

aOH

aOH

CH

3

CH

3

H

4

aOH

aOH

CH

2

OH

CH

3

H

4 mg/g s.m. i by³a prawie 4-krotnie ni¿sza ni¿ w korzeniach 2-letnich roœlin ros-
n¹cych w gruncie. Niska zawartoœæ diterpenów mo¿e mieæ zwi¹zek z morfologi¹
i stadium rozwojowym hodowanych in vitro korzeni; by³y one cienkie, ¿ó³tawe o bu-
dowie pierwotnej. Natomiast na podstawie obserwacji z korzeniami zebranymi
z roœlin hodowanych w gruncie wykazano, ¿e miejscem akumulacji tanszinonów jest
g³ównie zewnêtrzna skorkowacia³a czêœæ korowa korzenia.

4.3. Korzenie transformowane S. officinalis

Korzenie transformowane S. officinalis (sza³wia lekarska) otrzymano w wyniku za-

ka¿enia pêdów bakteriami A. rhizogenes A4 i ATCC15834. Uzyskano ok. 10 klonów,
które charakteryzowa³y siê szybkim wzrostem w pod³o¿u Lloyda i McCowna. Stwier-
dzono, ¿e korzenie te s¹ dobrym Ÿród³em kwasu rozmarynowego (depsyd kwasu ka-
wowego i

a-hydroksydihydrokawowego), zwi¹zku o dzia³aniu przeciwutleniaj¹cym,

przeciwzapalnym i antywirusowym. Produkcja kwasu rozmarynowego waha³a siê od
16 do 33 mg/g suchej masy. Najbardziej produktywny klon wytwarza³ dwa razy wiê-
cej tego zwi¹zku ni¿ kultury korzeni nietransformowanych (19 mg/g s.m.). Zawar-
toœæ kwasu rozmarynowego zale¿a³a od szczepu Agrobacterium u¿ytego do transfor-
macji i analizowanego klonu (42). Stwierdzono, ¿e klony uzyskane w wyniku trans-
formacji szczepem ATCC 15834 wytwarzaj¹ wiêcej kwasu rozmarynowego ni¿ klony
transformowane szczepem A4. Rodzaj u¿ytego szczepu wp³ywa³ równie¿ na wzrost
i morfologiê korzeni (fot. 2).

Halina Wysokiñska, Aleksander Chmiel

132

PRACE PRZEGL¥DOWE

Fot. 2. Wygl¹d korzeni w³oœnikowatych S. officinalis, otrzymanych po transformacji szczepami

A. rhizogenes ATCC15834 i A4; skala = 1 cm.

Zale¿noœæ miêdzy produkcj¹ metabolitów wtórnych a rodzajem szczepu bakte-

ryjnego by³a ju¿ wczeœniej obserwowana w kulturach korzeni transformowanych
Hyoscyamus albus (43). W naszych badaniach wykazano równie¿ ró¿nice w biosynte-
zie kwasu rozmarynowego miêdzy klonami zapocz¹tkowanymi tym samym szcze-
pem Agrobacterium. Mog¹ one wynikaæ z ró¿nic w wielkoœci i lokalizacji fragmentów
T-DNA zintegrowanych z genomem komórki roœlinnej (44,45). Nie zaobserwowano
natomiast istotnego wp³ywu warunków hodowli (œwiat³o, ciemnoœæ) na wytwarzanie
kwasu rozmarynowego w kulturach korzeni transformowanych S. officinalis.

4.4. Korzenie i pêdy transformowane C. erythraea

Centaurium erythraea (tysi¹cznik pospolity) jest znany z biosyntezy m.in. glikozy-

dów sekoirydoidowych, g³ównie gentiopikrozydu, swerozydu i swertiamaryny. Zwi¹z-
ki te wykazuj¹ dzia³anie przeciwgrzybowe, przeciwbakteryjne, ¿ó³ciopêdne i hepa-
tochronne (46). Stosowane s¹ równie¿ w przemyœle spo¿ywczym, jako sk³adniki li-
kierów i napojów energetyzuj¹cych. W korzeniach transformowanych C. erythraea
rosn¹cych w ci¹gu 4 tygodni w p³ynnym pod³o¿u Lloyda i McCowna (z sacharoz¹
30g/l) znaleziono 10-14 mg/g s.m. gentiopikrozydu, swerozydu i swertiamaryny (47).
Wœród nich dominowa³ gentiopikrozyd, który stanowi³ 80% sumy wykrytych sekoiry-
doidów. W porównaniu z korzeniami roœlin rosn¹cych w gruncie zawartoœæ sekoiry-
doidów w kulturach korzeni w³oœnikowatych by³a 2-krotnie wy¿sza, ale znacznie
ni¿sza ni¿ w pêdach roœliny, które s¹ g³ównym miejscem akumulacji tego typu
zwi¹zków. W preparacie handlowym Centaurii herba, który zawiera³ kwitn¹ce pêdy
tysi¹cznika wykryto ok. 37 mg glikozydów sekoirydoidowych w przeliczeniu na 1 g
suchego surowca.

Zdolnoœæ korzeni w³oœnikowatych C. erythraea do organogenezy i regeneracji

p¹ków wykorzystano aby otrzymaæ kultury transgenicznych pêdów. Kultury tych pê-
dów hodowane na sta³ym lub w p³ynnym pod³o¿u Murashige i Skooga uzupe³nio-
nym IAA (0,1 mg/l) i BAP (1 mg/l) wytwarza³y 34-48 mg/g s.m. gentiopikrozydu, swe-
rozydu i swertiamaryny. Podobnie jak w korzeniach, przewa¿a³ gentiopikrozyd (65%
sumy sekoirydoidów), chocia¿ w pêdach rosn¹cych in vivo zawsze dominuje swertia-
maryna. Dalsze zwiêkszenie zawartoœci sekoirydoidów otrzymano po regeneracji
ca³ych transgenicznych roœlin. Roœliny te ró¿ni³y siê morfologicznie od roœlin nie-
transformowanych (syndrom w³oœnikowatoœci). Ró¿nice dotyczy³y liczby rozga³ê-
zieñ pêdu, morfologii liœci i systemu korzeniowego oraz budowy kwiatostanów
(krótsze, bardziej rozga³êzione, z wiêksz¹ liczb¹ p¹ków kwiatowych). Najwiêcej se-
koirydoidów wytwarzaj¹ 10-tygodniowe roœliny rosn¹ce w doniczkach (tab. 3). Wy-
kryto w nich 280 mg/g s.m. gentiopikoryzydu, swerozydu i swertiamaryny, czyli po-
nad 7-krotnie wiêcej ni¿ w surowcu Centaurii herba.

Produkcja roœlinnych metabolitów wtórnych w kulturach organów transformowanych

BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 124-135 2006

133

T a b e l a 3

Zawartoœæ sekoirydoidów w kulturach transgenicznych organów i zregenerowanych z nich roœlinach
Centaurium erythracea

Materia³ roœlinny

Zawartoœæ sekoirydoidów (mg/g s.m.)

gentiopikoryzyd

swerozyd

swetiamaryna

suma

kultury korzeni*:
K4M
K18

6,2
11,6

œlad
œlad

2,5
2,5

8,7
14,1

kultury pêdów**:
na pod³o¿u sta³ym
w pod³o¿u p³ynnym

31,0
25,5

12,0
5,5

5,5
2,7

48,5
33,7

roœliny***:
pêdy 10-tygodniowe
pêdy 20-tygodniowe
korzenie 10-tygodniowe

51,5
7,6
79,1

31,3
1,1
6,5

107,3
26,1
4,8

190,1
34,8
90,4

Preparat handlowy****

4,4

2,4

30,7

37,4

***

* korzenie hodowano w ci¹gu 4 tygodni w p³ynnym pod³o¿u Lloyda i McCowna w ciemnoœci,

**

** pêdy hodowano w ci¹gu 4 tygodni w pod³o¿u Murashige i Skooga uzupe³nionym IAA (0,1 mg/l) i BAP (1 mg/l),

*

*** transformowane roœliny ros³y w glebie w warunkach szklarniowych,

**** wysuszone ziele Centaurii herba.

W pêdach roœlin transgenicznych, podobnie jak w pêdach roœlin nietransformo-

wanych rosn¹cych w gruncie przewa¿a³a swertiamaryna. Istotne ró¿nice w poziomie
sekoirydoidów zaobserwowano miêdzy korzeniami roœlin transformowanych ros-
n¹cych w glebie a korzeniami transformowanymi hodowanymi w warunkach in vitro.
Te pierwsze wytwarzaj¹ 6-9-krotnie wiêcej sekoirydoidów ni¿ te drugie (tab. 3). Na
podstawie przedstawionych wyników dowodzi siê, ¿e transformacja za pomoc¹
A. rhizogenes zwiêksza biosyntezê glukozydów sekoirydoidowych, natomiast nie wy-
wo³uje zmian w iloœciowym stosunku poszczególnych sekoirydoidów. W korzeniach
roœlin transformowanych i nietransformowanych dominuje gentiopikrozyd, a w pê-
dach swertiamaryna.

Praca wykonana w ramach zamawianego projektu badawczego PBZ-KBN-092/PO5/2003.

Literatura

1.

Payne G. F., Bringi V., Prince C., Shuler M. L., (1991), Plant Cell and Tissue Culture in Liquid System,
Eds. S Payne G. F., Bringi V., Prince C., Shuler M. L., 1-10, Hasner.

2.

Oksman-Caldentey K. M., Inze D., (2004), Trends Plant Sci., 9, 433-440.

3.

Dixon R. A., Strack D., (2003), Phytochemistry, 62, 815-816.

4.

Sajc L., Grubisic D., Novakovic G. V., (2000), Biochem. Eng. J., 4, 89-99.

Halina Wysokiñska, Aleksander Chmiel

134

PRACE PRZEGL¥DOWE

5. von Roepenack-Lahaye E., Degenkolb T., Zerjeski M., Franz M., Roth U., Wessjohann L., Schmidt J.,

Schell D., Clemens S., (2004), Plant Physiol., 134, 548-559.

6. Facchini P. J., Bird D. A., St-Pierre B., (2004), Trends Plant Sci., 9,116-122.
7. Berdy J., (2005), J. Antibiol., 58, 1-26.
8. Oksman–Caldentey K. M., Saito K., (2005), Curr. Opin. Biotechnol., 16, 174-179.
9. Cyranoski D., (2004), Nature, 432, 259.

10. Gräther O., Schneider B., (2001), Progress in Botany, 62, 266-304.
11. Vansree M., Chen-Yue L., Shu-Fung L., Satiish M., N., Chien Y., L., Hsin-Sheng T., (2004), Bot. Bull.

Acad. Sin., 45, 1-22.

12. Doran P. M., (1993), Adv. Biochem. Engin., 98, 115.
13. http://www.genexol.com./eng/
14. Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gonteir E., (2001), Plant Sci., 161, 839-851.
15. Floryanowicz-Czekalska K., Wysokiñska H., (2000), Acta Soc. Bot. Polon., 69, 131-136.
16. Subroto M. A., Hamill J. D., Doron P. M., (1996), J. Biotechnol., 45, 45-57.
17. Salem K. M., Charlwood B. V., (1995), Plant Cell Tissue Organ Cult., 40, 209-215.
18. Jha S., (1995), Proc. Indian. Natn. Sci. Acad., 61, 63-72.
19. Ghosh B., Mukherjee S., Jha S., (1997), Plant Sci., 122, 193-199.
20. Ehmke A., Ohmstede D., Eilert U., (1995), Plant Cell Tissue Organ Cult., 43, 191-197.
21. Paniego W. B, Giulietti A. M., (1996), Enzyme Microb. Technol., 18, 526-530.
22. Wysokiñska H., Chmiel A., (1997), Acta Biotechnol., 17, 131-159.
23. Lin H., Kwok K. H., Doran P. M., (2003), Biotechnology Lett., 25, 521-525.
24. Babaoglu M., Davey M. R., Power J. B., Sporer F., Wink M., (2004), Plant Cell Tissue Organ Cult., 78,

29-36.

25. Lorence A., Medina-Bolivar F., Nessler C. L., (2004), Plant Cell Rep., 22, 437-441.
26. Drews F. E., von Staden J., (1995), Plant Growth Regulation, 17, 27-31.
27. Shi H. P., Kintzios S., (2003), Plant Cell Rep., 21, 1103-1107.
28. Kintzios S., Makri O., Pistola E., Matakiadis T., Shi H. P., Economou A., (2004), Biotechnology Lett.,

26, 1057-1059.

29. Chaudhuri K. N., Ghosh B., Tepfer D., Jha S., (2005), Plant Cell Rep., 24, 25-35.
30. Putalin W., Prasarnsiwamai P., Tanaka H., Shoyama Y., (2004), Biotechnology Lett., 26, 545-548.
31. Tada H., Murakamii Y., Omoto T., Shimomura K., Ishimaru K., (1996), Phytochemistry, 42, 431-434.
32. Kittipongpatana N., Davis D. L., Poter J. R., (2002), Plant Cell Tissue Organ Cult., 71, 65-75.
33. Zid S. A., Orihara Y., (2005), Plant Cell Tissue Organ Cult., 81, 65-75.
34. KuŸma £., Skrzypek Z., Wysokiñska H., (2006), Plant Cell Tissue Organ Cult., 84, 152-160.
35. Ikenaga T., Oyama T., Maranaka T., (1995), Plant Cell Rep., 14, 413-417.
36. Jacob A., Malpathak W., (2004), Current Science, 87, 1442-1447.
37. Argolo A. C., Charlwood B. V., Pletsch M., (2000), Planta Med., 66, 448-451.
38. McGarvey D. J., Croteau R., (1995), Plant Cell, 7, 1015-1026.
39. KuŸma £., Ró¿alski M., Walencka E., Ró¿alska B., Wysokiñska H., (2006), Phytomed., (w druku).
40. Hernandez-Perez M., Rabanal R. M., Arias A., de la Torre M. C., Rodriguez B., (1997), Pharm. Biol.,

37, 1-6.

41. Ró¿alski M., KuŸma £., Krajewska U., Wysokiñska H., (2006), Z. Naturforsch., 61c, 483-488.
42. Grzegorczyk I., Królicka A., Wysokiñska H., (2006), Z. Naturforsch., 61c, 351-356.
43. Zehra M., Benerjee S., Sharma S., Kumor S., (1999), Planta Med., 65, 60-63.
44. Mano Y., Nabeshima S., Matsui C., Ohkawa H., (1986), Agric. Biol. Chem., 50, 2715-2722.
45. Batra J., Dutta A., Singh D., Kumar S., Sen J., (2004), Plant Cell Rep., 23, 148-154.
46. Kumarasamy Y., Nahar L., Cox P. J., Jaspars M., Saker S. D., (2003), Phytomed., 10, 344-347.
47. Pi¹tczak E., Królicka A., Wysokiñska H., (2006), Plant Cell Rep., (w druku).

Produkcja roœlinnych metabolitów wtórnych w kulturach organów transformowanych

BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 124-135 2006

135