LABOLATORIUM Z BIOFIZYKI

Ćwiczenie nr: 4 „Chromatografia żelowa”

1. Cel doświadczenia.

Celem ćwiczenia było wykonanie rozdziału barwników: DCPIP i safraninu T na żelowej kolumnie chromatograficznej

1. Wstęp teoretyczny.

W doświadczeniu korzystano z kolumny chromatograficznej wypełnionej żelem. Chromatografia żelowa polega na rozdziale składników mieszaniny stanowiącej eluent według wielkości cząsteczek. Większe cząsteczki wypływają szybciej, mniejsze cząsteczki wolniej. Skorzystano z prawa Lamberta-Beera , które umożliwia obliczenie stężeń roztworów, na podstawie ekstynkcji promieniowania, gdy znamy współczynnik absorbancji danego związku. Prawo to wyraża się wzorem A =  ε • l • c , gdzie A to absorbancja, ε to współczynnik absorbancji, l to długość próbki, a c to stężenie molowe.

1. Sprzęt i materiały:

• spektrofotometr Spekol 11

• pipety automatyczne 1cm³ i 200mm³

• komory teflonowe do uwalniania

• ependorfy 1,5ml³

• kolumna chromatograficzna wypełniona żelem Sephadex G50

• roztwór DCPIP $\varepsilon_{DCPIP\ \ 600nm} = 21000\frac{1}{M \bullet \text{cm}^{3}}$

• roztwór safraninu T $\varepsilon_{safraninu\ T\ \ 520nm} = 25000\frac{1}{M \bullet \text{cm}^{3}}$

• destylowana H₂0

1. Opis ćwiczenia.

1. Przebieg pomiarów:

• Pobraliśmy po 50 [mm³] DCPIP oraz 50 [mm³] Safraninu T i wymieszaliśmy w ependorfy.

• Powstałą mieszaninę za pomocą zakraplacza nanieśliśmy na powierzchnie żelową kolumny chromatograficznej.

• Nie połączyliśmy kolumny ze zlewka wypełnioną wodą destylowaną ( konsekwencje umieszczone we wnioskach), z dołu wężyk odprowadzał mieszaninę z kolumny.

• Odmierzaliśmy do każdej z ependorfek około 30 kropel= 1 [ml], ale po przelaniu do kuwetek zajęły nam około 0,5 [cm³]. Następnie przelewaliśmy je do kuwetek i dolewaliśmy 1,5 [cm³] wody.

• Przygotowaliśmy dla każdej z substancji roztwór max. absorbancji dodając 50 [mm³] substancji i dolewając do pełna 1,9 H₂0 destylowanej.

Związek	Ekstyncja	C	ΔC	ε
	520 mm	600 mm	[mol/dm^3]	[mol/dm^3]
DCPIP	0,574	0,957	3,80·10^-5	4,29·10^-7
Safranin T	1,653	0,046	5,5·10^-5	3,80·10^-7

Tabela1. Wyniki absorbancji maksymalnej dal badanych związków

1. Przygotowanie roztworów porównawczych:

• Roztwory maksymów absorbancji dla poszczególnych związków rozcieńczyliśmy wodą w pewnym stosunku, aby uzyskać różne stężenia, a te porównać z wartościami absorbancji uzyskanymi z chromatografii kolumnowej.

V [cm]	A [-]	Stężenie [mol/dm^3]
związku	H20	T
0,7	1,3	0,572
0,5	1,5	0,477
0,3	1,7	0,314
0,1	1,9	0,153
reszta	1,95	0,236

Tabela2. Wyniki absorbancji dla kolejnych próbek kalibracji sprawdzający stężenie

Wykres 1. Przedstawia zależność stężenia (Cm) od absorbancji (A) danych z Tabeli 2.

1. Opracowanie wyników:

• Korzystając z przekształconego prawa Lambera-Beera obliczyliśmy stężenia zbadanych kuwetek .

L.p.	czas	Ekstyncja	Stężenie [mol/dm^3]	ilość moli [mol]
	t [min]	t [s]	520 mm	600 mm
1	0,35	35	0,034	0,144
2	1,25	85	0,034	0,093
3	2,20	140	0,037	0,092
4	3,09	189	0,064	0,063
5	4,10	250	0,069	0,048
6	5,12	312	0,071	0,045
7	6,01	361	0,063	0,027
8	6,49	409	0,059	0,022
9	7,55	475	0,056	0,025
10	9,05	545	0,04	0,012
11	10,16	616	0,034	0,006
12	11,37	697	0,028	0,005
13	12,54	774	0,017	0,003
14	14,07	847	0,012	0,001
15	15,14	914	0,009	0,001
16	16,30	990	0,005	0,000
17	17,39	1059	0,002	0,000
Suma	2,11·10^-5	2,33·10^-5	4,16·10^-5	4,59·10^-5

Tabela3. Zmierzone ekstynkcje próbek po określonym czasie i obliczone stężenia molowe oraz liczba moli

Wykres 2. Przedstawia zależność czasu retencji od absorbancji (A) danych z Tabeli 3.

• Nie znając t₁ dla DCPIP nie mogę obliczyc rozdzielczości kolumny.

• Posiadając t₂ =

1. Wnioski:

Doświadczenie wykazało, że:

Dcpip uwalnia się szybciej z roztworu wodnego niż zżelowanego.

Membrana poliwęglanowa przepuszcza szybciej niż membrana celulozowa.

Dcpip uwalnia się najszybciej z roztworu wodnego przykrytego membraną celulozową (strumień dyfuzji dla tej próbki jest największy, prognozowany czas uwolnienia całęj substancji najkrótszy, natomiast kąt nachylenia prostej na wykresie stężenia od czasu jest największy-stężenie w tej próbce rosło najszybciej)

Wyniki tego doświadczenia są obarczone dużym błędem, wynikającym z niedokładności sprzętu oraz samego wykonania pomiaru. Jeżeli chodzi o sprzęt, to należy uwzględnić niedokładność stopera, spektroskopu, pipet, zlewek i falkonów. niedokładność ludzkiej reakcji. Natomiast błędy jakie zostały popełnione podczas wykonywania pomiaru to np. zbyt powolne pobieranie (pobranie próbek powinno trwać jak najkrócej natomiast w rzeczywistości trwało ok. 4s). Poza tym na wykresie dla roztworu zżelowanego 2 punkty odbiegają od normy, ich absorbancja jest zbyt wysoka. Prawdopodobnie wynika to z tego, że po pobraniu poprzedniej próbki która miała większe stężenie nie wypłukaliśmy dokładnie pipety, dlatego absorbancja w tych punktach jest tak nienaturalnie duża.

Poza tym nie można do końca ufać wynikom pomiaru absorbancji. Kuweta w spektrofotometrze ma pojemność 2 ml Najodpowiedniejsza ilością substancji która należało wlać jest 1,8 ml Nasze próbki miały tylko ok. 1 ml, ponieważ zabrakło nam czasu i nie zdążyliśmy ich rozcieńczyć aby uzyskać wymaganą ilość. Ten fakt miał duże znaczenie przy pomiarze absorbancji, ponieważ kuweta tylko do połowy była wypełniona substancją, drugą połowę stanowiło powietrze. A wiadomo, że powietrze przepuszcza więcej światła niż badany roztwór. przez co absorbancja badanych próbek wyszła inna niż powinna.

Bibliografia:

[1] - http://www.biofiz.am.wroc.pl/bfstr65.html

[2] – http://wikipedia.pl