Wydział: BiNoŻ

Kierunek: Biotechnologia
semestr: IV

gr. dziekańska: 3

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Wpływ pH, temperatury, aktywatorów i inhibitorów
na szybkość reakcji enzymatycznych

Data wykonania ćwiczenia: 14.04.2010

Data oddania sprawozdania: 29.03.2010 Maja Szczepaniak
Marcin Szustak
Tomasz Styś

WSTĘP TEORETYCZNY

Enzymy, katalizatory układów biologicznych, są godnymi specjalnej uwagi urządzeniami molekularnymi, które określają wzorzec przekształceń chemicznych. Pośredniczą również w przekształceniu różnych form energii. Najbardziej znaczącą właściwością enzymów jest ich siła katalityczna i specyficzność. Reakcja katalityczna zachodzi w szczególnym miejscu enzymu zwanym miejscem aktywnym. Niemal wszystkie enzymy są białkami.

Białka, jako klasa makrocząsteczek, niezwykle efektywnie katalizują różnorodne reakcje chemiczne dzięki swej zdolności wiązania w sposób specyficzny szerokiego wachlarza typów cząsteczek. Używając pełnego repertuaru sił oddziaływujących miedzy cząsteczkami, enzymy zestawiają ze sobą substraty w optymalnej orientacji przestrzennej, co jest istotnym wstępem do tworzenia i rozrywania wiązań chemicznych. Istotą ich działania jest katalizowanie reakcji przez stabilizacje stanów przejściowych, które na drogach reakcji są stanami o najwyższej energii. Przez selektywność tej stabilizacji enzymy decydują o tym, która z możliwych kilku reakcji chemicznych zostanie zrealizowana.

Aktywność enzymatyczna może być zatrzymana lub obniżona przez cząsteczki zwane inhibitorami. Wiele leków i trucizn jest inhibitorami enzymów. Z kolei aktywatory enzymatyczne to cząsteczki zwiększające aktywność enzymów. Ponadto aktywność enzymów zależy od parametrów fizykochemicznych środowiska reakcji, takich jak: temperatura, pH, obecność niektórych jonów i innych.

źródło:

• „Biochemia” Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer

• www.wikipedia.pl

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

2.1. Wpływ pH na aktywność α-amylazy.

Sposób wykonania: Do 6 probówek odmierzyliśmy po 1 cm³ roztworów buforowych
o pH: 3,4,5,6,7 i 8. Następnie do każdego z nich dodaliśmy 2cm³ roztworu skrobi. W międzyczasie przygotowaliśmy płytki porcelanowe z zagłębieniami, do których wprowadziliśmy po 2 krople roztworu I₂ w roztworze KI. Do probówek z buforami
w odstępach co 30 sekund dodawaliśmy 1 cm³ roztworu α-amylazy. Otrzymane roztwory w równych odstępach, co 30 sekund umieszczaliśmy na przygotowanych wcześniej porcelanowych płytkach. Czynności powtarzaliśmy, aż do uzyskania na jednej z próbek jasnobrunatnego zabarwienia. Po uzyskaniu takiej próbki do wszystkich probówek dodaliśmy 3 krople jodu w jodku potasu i wymieszaliśmy.

Obserwacje:

pH	Zabarwienie hydrolizatu w reakcji z jodem	Stopień hydrolizy skrobi (rodzaj produktu)
3	Fiołkowe	amylodekstryny, erytrodekstryny
4	Czerwonobrunatne	erytrodekstryny
5	Bladoróżowe	achrodekstryny, maltoza, erytrodekstryny
6	Fiołkowe	amylodekstryny, erytrodekstryny
7	Fioletowy	amylodekstryny
8	Granatowy	Skrobia niezhydrolizowana

Wnioski: Optymalnym środowiskiem w którym α-amylaza najszybciej i najefektywniej hydrolizuje skrobie jest pH 5. Jak widzimy pH ma bardzo wielki wpływ na to czy enzym działa dlatego regulując pH organizm pośrednio reguluje aktywność enzymatyczną ustroju. Ponieważ enzym jest białkiem dlatego pH ma wpływ na to czy jest on anionem, kationem bądź Amfionem, a to z kolei zmienić może konformacje grupy prostetycznej i zmienić reaktywność jonu. Należy również pamiętać że białkowa budowa enzymu pod wpływem silnie kwaśnego lub zasadowego środowiska może ulec denaturacji.

2.2. Wpływ temperatury.

Sposób wykonania: Do 6 probówek dodaliśmy po 1cm³ koloidalnego roztworu skrobi oraz 0,5 cm³ buforu optymalnego o pH 5. Inkubowaliśmy każdą probówkę w ciągu 5 minut w temperaturach: pokojowej (26), 40, 50, 60, 70, 80°C. Po ustaleniu się w probówkach stałej temperatury dodaliśmy do nich po 0,5 cm³ α-amylazy, wymieszaliśmy i inkubowaliśmy w danych temperaturach przez kolejne 3 minuty. Dokładnie po 3 minutach od dodania enzymu pobraliśmy 0,5 cm³ roztworu i dodaliśmy do uprzednio przygotowanej probówki zawierającej 0,5 cm³ roztworu DNS. Następnie wymieszaliśmy zawartość i umieściliśmy ją na 5 minut we wrzącej łaźni wodnej, po czym schłodziliśmy i dodaliśmy do niej 4 cm³ wody destylowanej. Wymieszaliśmy i mierzyliśmy absorbancji przy długości fali 540 nm wobec próby odczynnikowej zawierającej 0,5 cm³ wody zamiast mieszaniny reakcyjnej.

Obserwacje i obliczenia:Obliczenia dla uzyskanych wartości absorbancji 0,072 i 0,083 dla fali długości λ=540 nm w temperaturze pokojowej

Roztwór wzorcowy: A₅₄₀ 0,1 – 0,2 mg maltozy/ cm³

0,072 – x mg maltozy/ cm³

0,083 – y mg maltozy/ cm³

x = 0,144 mg maltozy/ cm³

y = 0,166 mg maltozy/ cm³

temperatura hydrolizy [°C]	Pokojowa 26	40	50	60	70	80
stężenie cukrów redukujących [mg maltozy/ cm^3]	Wyniki doświadczalne	0,144	0,304	0,528	0,914	0,456
		0,166	0,328	0,515	0,802	0,694
						0,53
						0,54
	średnia	0,155	0,316	0,5215	0,858	0,555

Tabela obrazująca ilość cukrów redukujących uwalnianych podczas reakcji z α-amylazą w różnych temperaturach

Wnioski: Największą szybkość reakcji rozkładu skrobi przez α-amylazę obserwujemy w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Odbieganie od tej temperatury znacznie zmniejsza nam efektywność reakcji – powstaje znacznie mniej cukrów redukujących a zatem skrobia zostaje znacznie słabiej zhydrolizowana. Temperatura w reakcjach chemicznych powoduje nam przyspieszenie reakcji jednak, gdy bierzemy pod uwagę reakcję enzymatyczną musimy mieć na uwadze to, że enzym jest białkiem – a zatem posiada strukturę wrażliwą na wysoką temperaturę dlatego po uzyskaniu maksimum w temperaturze 60 °C szybkość reakcji dramatycznie spada – białko jest denaturowane i niemożliwa jest już hydroliza skrobi. Doświadczenie prowadzone było w optymalnym pH 5 wyznaczonym z poprzedniego doświadczenia. Temperatura przyspiesza reakcję – powoduje większe prawdopodobieństwo na to, że cząsteczki się zderzą. Wysoka temperatura niszczy strukturę enzymu.

2.3.2. Badanie termostabilności α-amylazy.

Sposób wykonania: Do 6 probówek odmierzyliśmy po 1 cm³ roztworu α-amylazy i 1 cm³ buforu o pH 5 po czym każdą z probówek inkubowaliśmy przez 10 minut w łaźniach o temperaturach: pokojowej, 40, 50, 60, 70, 80°C. Po 10 minutach roztwór enzymu schłodziliśmy pod bieżącą wodą do temperatury pokojowej, po czym dodaliśmy 2 cm³ koloidalnego roztworu skrobi i dokładnie wymieszaliśmy. Następnie inkubowaliśmy probówki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, po czym pobraliśmy po 0,5 cm³ mieszanin i wprowadziliśmy do probówki z 0,5 cm³ roztworu DNS. Następnie wymieszaliśmy i umieściliśmy na 5 minut we wrzącej łaźni wodnej, schłodziliśmy i dodaliśmy 4 cm³ wody destylowanej i ponownie wymieszaliśmy. Następnie mierzyliśmy przy długości fali 540 nm absorbancję wobec próbki odczynnikowej, zawierającej 0,5 cm³ wody destylowanej zamiast mieszaniny reakcyjnej.

Obserwacje i obliczenia:

Obliczenia dla uzyskanych wartości absorbancji 0,297 i 0,241 dla długości fali λ=540 nm w temperaturze pokojowej dla 10 minutowej inkubacji:

Roztwór wzorcowy: A₅₄₀ 0,1 – 0,2 mg maltozy/ cm³

0,297 – x mg maltozy/ cm³

0,241 – y mg maltozy/ cm³

x = 0,594 mg maltozy/ cm³

y = 0,482 mg maltozy/ cm³

temperatura preinkubacji [°C]	26	40	50	60	70	80
stężenie cukrów redukujących mg maltozy/ cm3	Wyniki doświadczalne	0,594	0,54	0,214	0,144	0,086
		0,482	0,542	0,19	0,138	0,086
	Średnia	0,538	0,541	0,202	0,141	0,086

Tabela obrazująca ilość cukrów redukujących uwalnianych podczas reakcji z α-amylazą w zależności od temperatury preinkubacji

Wnioski: Po 10 minutach inkubacji α-amylazy jedynie w warunkach pokojowych oraz 40 °C enzym nie zmienił swojej aktywności. Obserwujemy to poprzez zbliżoną ilość cukrów redukujących wydzielonych w reakcji enzymatycznej w tych temperaturach. Jednakże 10 minutowe ogrzewanie w wyższych temperaturach sprawiło znaczny spadek enzymatycznych właściwości związku. Ponieważ α-amylaza jest białkiem z utworzona przez słabe wiązania wodorowe konformacja przestrzenna i centrum aktywne pod wpływem działania wysokich temperatur bądź też pod wpływem długotrwałego działania temperatury ulega zniszczeniu. Przy 80°C praktycznie cały enzym uległ denaturacji przez co nie zdołał on już dokonać hydrolizy skrobi. Termo stabilność jest to maksymalna temperatura, w której może znajdować się enzym nie tracąc swoich zdolności enzymatycznych.

2.3.3. Wpływ aktywatorów i inhibitorów na α-amylazy.

Sposób wykonania: Do 3 probówek dodaliśmy 3cm³ koloidalnego roztworu skrobi i kolejno do pierwszej dodaliśmy 0,5 cm³ wody destylowanej, do drugiej 0,5 cm³ roztworu NaCl, do trzeciej 0,5 cm³ CuSO₄, a do wszystkich po 1 cm³ roztworu α-amylazy śliny. Następnie za pomocą jodu w jodku potasu badaliśmy na płytkach porcelanowych stopień hydrolizy skrobi w próbkach. W momencie gdy w próbce na płytce jeden z hydrolizatów nie barwi nam na granatowo mieszaniny dodaliśmy do wszystkich probówek 4 krople jodu w jodku potasu
i natychmiast wymieszaliśmy.

Obserwacje: Próbka zawierająca wodę destylowana miała barwę fiołkową. Próbka z chlorkiem sodu była jasnoróżowa, natomiast zawierającą siarczan (IV) miedzi (II) dał nam barwę granatową

Wnioski: W probówce z solą chlorku sodu widzimy najefektywniejszy przebieg reakcji – skrobia praktycznie całkowicie została rozłożona na maltozę i achrodekstryny. Reakcja dała nam lepsze efekty nawet niż próbka odniesienia zawierająca wodę. Jony chlorkowe działają tylko na α-amylazę ślinową jako aktywator przyśpieszając reakcję. Jony miedzi (II) powodują zablokowanie działania enzymu czego skutek obserwujemy widząc granatową barwę powstałą na skutek nierozłożonej skrobi z jodem. Jony miedzi są inhibitorami α-amylazy.