Produkcja antybiotyków

Wiele drobnoustrojów i roślin wydziela produkty nie związane z podstawowym

metabolizmem tych organizmów. Produkty takie zwane są

metabolitami wtórnymi. Bakterie i grzyby wytwarzają wiele tego rodzaju

„wtórnych metabolitów". Dużo z tych substancji znalazło istotne za-

stosowania jako leki, dodatki pokarmowe czy czynniki stymulujące.

W związku z tym wiele drobnoustrojów zyskało ogromne znaczenie

ekonomiczne. Odkrycie penicyliny i innych antybiotyków dało początek

nowej dziedziny mikrobiologii przemysłowej. Badania nad antybiotykami

oraz rozwój ich półsyntetycznych pochodnych przyniósł wielkie korzyści

w terapii medycznej. Praktycznie nie ma ograniczeń, jeśli chodzi o nowe

odkrycia, modyfikacje i zastosowania wtórnych metabolitów. Dalsze

możliwości w tej dziedzinie tkwią w selekcji mutantów z defektywnymi

mechanizmami regulacji metabolicznej.

Organizmy i odkrycia

Symbiotyczne i antagonistyczne stosunki między drobnoustrojami znane

są od XIX wieku. Punktem wyjścia do wyjaśnienia podstaw antybiozy

było zaobserwowanie przez A. Fleminga (1928), że kolonia grzyba

(Penicillium notatum) hamowała wzrost gronkowca. Związek wydzielany

przez Penicillium i dyfundujący do agaru nazwano penicyliną. Od tamtego

czasu otrzymano wiele związków o właściwościach antybiotyczych.

Antybiotyki zdefiniowane są jako substancje pochodzenia biologicznego,

które w małych stężeniach hamują wzrost drobnoustrojów. Rozróżnia się

aktywność hamującą wzrost (efekt bakteriostatyczny i fungistatyczny)

i aktywność „zabójczą" (efekt bakteriobójczy lub grzybobójczy), objawiającą

się zmniejszeniem liczby żywych komórek.

Drobnoustroje wytwarzające antybiotyki. Zdolność wytwarzania antybiotyków

wykazują głównie grzyby należące do grupy Aspergillales,

promieniowce i kilka innych bakterii. Spośród bakterii Streptomycetes

zadziwiają chemiczną różnorodnością wytwarzanych antybiotyków. Do

tej pory dobrze scharakteryzowano około 2000 antybiotyków, z których

w lecznictwie stosuje się około 50. Całkowita liczba dotychczas opisanych

antybiotyków jest znacznie większa, a są grupy drobnoustrojów, m.in.

bakterie trudne do hodowania i niektóre niższe grzyby, których dotychczas

nie zbadano pod kątem produkcji antybiotyków.

Znaczenie antybiotyków dla organizmu produkującego. O znaczeniu

antybiotyków dla organizmu producenta w jego środowisku glebowym

w zasadzie prawie nic nie wiadomo. Antybiotyki zazwyczaj powstają

w specjalnych szlakach syntetycznych będących częścią tzw. metabolizmu

wtórnego. Wtórne metabolity są produkowane w wyniku mechanizmów

syntezy i przez enzymy nie będące niezbędne do wzrostu i podstawowych

funkcji komórki. Stąd też wydawałoby się, że aparat genetyczny służący

syntezie antybiotyków byłby czymś uciążliwym dla organizmu i zatem

wyeliminowanym w trakcie ewolucji. Wychodząc z założenia, że jedynie

korzystne cechy zostają zachowane, antybiotyki muszą w naturalnym

środowisku ich producenta nadawać mu jakieś cechy korzystne, być może

we współzawodnictwie o ograniczone substraty. Jednakże tego rodzaju

stosunki antagonistyczne są prawie niemożliwe do wykazania w glebie,

gdyż ilości wytwarzanych antybiotyków są bardzo niewielkie, a w wielu

wypadkach hamują one nawet wzrost producenta.

Stopniowo przyjmowany jest pogląd, że w trakcie ewolucji czasem

zostaje zachowany jakiś bezużyteczny materiał genetyczny, nawet jeśli

wydaje się utrapieniem dla danego organizmu w dostępnych warunkach

eksperymentalnych. Być może przyroda jest nieco bardziej zachowawcza

niż sądzono we wczesnym okresie biologii molekularnej. Obecnie

antybiotyki i inne wtórne metabolity, których użyteczność dla organizmu

producenta nie jest zrozumiała, zaliczane są do produktów „powstających

na placu zabaw metabolizmu" lub uważane za „odpady metabolizmu".

Produkty tego typu pokazują jednakże, iż nawet wtórny metabolizm

bakterii, grzybów i roślin może być owocnym tematem badań w kierunku

zrozumienia ewolucji drobnoustrojów.

Wykazanie produkcji antybiotyku. Pierwsze antybiotyki wykryto w zasadzie

przez przypadek, obserwując strefy zahamowania wzrostu organizmów

będących w zasięgu ich działania. Tak więc na płytce z agarem

odżywczym, gęsto posianym szczepem indykatorowym (wskaźnikowym),

wzrost w pobliżu kolonii grzyba lub promieniowca ulega zahamowaniu.

Antybiotyk, dyfundując z organizmu producenta do agaru, powoduje

pojawienie się strefy zahamowania gęstego wzrostu bakteryjnego szczepu

wskaźnikowego (ryc. 10.4). Jako organizmy wskaźnikowe wykorzystuje

się w badaniach reprezentatywne drobnoustroje. Jakościowo można

wykazać produkcję antybiotyku przez dany organizm nanosząc go na

środek odpowiedniej płytki agarowej, a następnie posiewając szczepy

wskaźnikowe w postaci linii promieniście rozchodzących się od środka

(ryc. 10.5). Określenie, po odpowiednim czasie inkubacji, linii zahamowania

dla poszczególnych szczepów daje obraz zakresu aktywności

danego antybiotyku. Antybiotyki wykazują charakterystyczne różnice

skuteczności wobec gramdodatnich i gramujemnych bakterii, drożdży,

dermatofitów i innych organizmów.

Większość antybiotyków odkryto w trakcie intensywnego „skriningu".

Poszczególne etapy tej metody przedstawiono na rycinie 10.6.

Ilościowe oznaczenia. Główne metody ilościowego określenia siły

antybiotyku to dyfuzja na płytkach (ryc. 10.7) oraz mniej dokładna

metoda seryjnych rozcieńczeń. W metodzie płytkowej wypełnia się

szalki, do dokładnie odmierzonej wysokości, podłożem agarowym zawierającym

organizm wskaźnikowy (inokulum). Po zastygnięciu agaru

roztwory badanego antybiotyku wprowadza się albo do studzienek

wydrążonych w agarze, albo do metalowych cylinderków umieszczonych

na jego powierzchni. W trzeciej metodzie stosuje się krążki bibuły

nasączone roztworem antybiotyku. Jeśli wynik jest pozytywny, po

odpowiednim czasie inkubacji pojawiają się strefy zahamowania wzrostu.

Średnica strefy jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku.

Ważne jest zapewnienie stałości wszystkich warunków, tj. składu

podłoża, grubości warstwy agaru, stężenia organizmu wskaźnikowego

w inokulum, czasu inkubacji i temperatury (ryc. 10.7).

W metodzie seryjnych rozcieńczeń badany antybiotyk rozcieńcza się

w stosunku 1: 2 w zaszczepionym roztworze odżywczym. Po odpowiednim

czasie inkubacji najmniejsze rozcieńczenie, które całkowicie zahamowało

wzrost bakterii, określane jest jako „minimalne stężenie hamujące"

antybiotyku = MIC (wobec konkretnego organizmu testowego).

Znanych jest kilka metod określania synergistycznego lub antagonistycznego

działania różnych substancji oraz badania ich skuteczności

wobec innych organizmów (np. pierwotniaki, glony, robaki, komórki

w hodowli tkankowej, wirusy).

Antybiotyki ważne w lecznictwie

W tym miejscu zostaną omówione jedynie nieliczne pożyteczne antybiotyki.

Naczelne miejsce nadal zajmuje penicylina (β-laktam) wytwarzana

przez Penicillium notatum, P. chrysogenum i kilka innych grzybów,

szczególnie od czasu pojawienia się penicylin półsyntetycznych. Te

ostatnie uzyskuje się rozszczepiając cząsteczkę penicyliny acylazą i wprowadzając

do powstałego kwasu 6-aminopenicylanowego jeden z licznych

łańcuchów bocznych (ryc. 10.8). Etap metabolizmu bakteryjnego hamowany

przez penicylinę omówiono wcześniej (rozdz. 2.2.4). Penicylina jest

w zasadzie nietoksyczna dla ludzi, z wyjątkiem małego odsetka osób,

u których rozwijają się reakcje alergiczne. Wiele bakterii wytwarza

enzym zwany penicylinazą (β-laktamaza), który rozszczepia pierścień

β-aktamowy penicyliny czyniąc antybiotyk nieskutecznym. Wiele spośród

półsyntetycznych penicylin wytwarzanych z kwasu 6-aminopenicylanowego

jest niewrażliwych na działanie penicylinazy. W dodatku, są na tyle

stabilne w środowisku kwasowym, że mogą być podawane doustnie.

Cefalosporyny są wydzielane przez gatunki grzyba Cephalosporium.

Cefalosporyna C zawiera pierścień β-laktamowy i wykazuje podobieństwo

do penicyliny; jest zaliczana do grupy antybiotyków β-laktamowych (ryc.

10.9). Niektóre cefalosporyny półsyntetyczne są produkowane przez

podstawienie kwasu 7-aminocefalosporanowego, uzyskanego z cefalosporyny,

różnymi grupami bocznymi. Działanie półsyntetycznych cefalosporyn

jest podobne do działania półsyntetycznych penicylin.

Streptomycynę wyizolowano z podłoża hodowlanego Streptomyces

griseus, lecz syntetyzują ją też inne gatunki Streptomyces. Cząsteczka

składa się z trzech ugrupowań: N-metylo-L-2-glukozoaminy, metylopentozy

i pochodnej inozytolu zawierającej dwie reszty guanidylowe (ryc. 10.9).

Streptomycyna jest skuteczna wobec wielu bakterii gramujemnych i kwasoopornych

niewrażliwych na działanie penicyliny. Może ona jednak

powodować u ludzi dość poważne skutki uboczne o charakterze alergii.

Streptomycyna z powodzeniem jest stosowana również w praktyce

weterynaryjnej i w chorobach roślin.

Chloromycetynę (chloramfenikol) po raz pierwszy odkryto w hodowli

Streptomyces venezuelae, lecz obecnie jest otrzymywana syntetycznie

(ryc. 10.9). Jest to bardzo stabilny antybiotyk, skuteczny wobec wielu

bakterii gramujemnych, krętków, riketsji, promieniowców i dużych

wirusów.

Tetracykliny są wydzielane przez różne promieniowce, także przez

Streptomyces aureofaciens. Są one spokrewnione chemicznie i są pochodnymi

szkieletu naftacenowego. Do najlepiej znanych należą chlorotetra-

cyklina (aureomycyna), oksytetracyklina (terramycyna) i tetracyklina.

Charakteryzują się szerokim spektrum aktywności i są dobrze tolerowane

przez ludzi.

Pochodzenie antybiotyków makrolidowych (erytromycyna, karbomycyna

A, pikromycyna itp.) jest zróżnicowane. Antybiotyki te mają

stosunkowo dużą masę cząsteczkową, wynikającą z obecności wieloczłonowego

pierścieniowego laktonowego.

Pierwszym antybiotykiem wyizolowanym z hodowli promieniowców

(w 1940 r.) była aktynomycyna. Jest to właściwie mieszanina kilku

związków zawierających fenoksazonowy chromofor, lecz podstawionych

różnymi łańcuchami polipeptydowymi (ryc. 10.9).

Ostatnią grupę w tym krótkim omówieniu tworzą antybiotyki polipeptydowe

(gramicydyna S, polimyksyny, bacytracyna, rystocetyna itp.).

Polimyksyna Β składa się z pierścienia zbudowanego z siedmiu aminokwasów

oraz łańcucha bocznego połączonego z pierścieniem wiązaniem

peptydowym (ryc. 10.10). Antybiotyki polipeptydowe charakteryzują się

dużym powinowactwem do błony cytoplazmatycznej, w związku z czym

są toksyczne zarówno dla bakterii, jak i dla organizmów eukariotycznych.

Cecha ta silnie ogranicza ich użyteczność. Niektóre z antybiotyków

polipeptydowych, z powodu ich zdolności selektywnego transportu jonów

przez błony biologiczne (rozdz. 7.7), znajdują zastosowanie w badaniach

naukowych jako jonofory. Na przykład, walinomycyna ułatwia transport

potasu przez błony. Antybiotyk ten jest zbudowany z dwunastoczłonowego

pierścienia zawierającego walinę i 2-hydroksyizowalerianę. Jego struktura

przestrzenna pozwala na umiejscowienie atomu potasu wewnątrz cząsteczki.

Z powodu obecności waliny i izowaleriany kompleks walinomycy-

na-K+ charakteryzuje się lipofilnością i łatwo przechodzi przez błonę

lipidową. Dodatek walinomycyny do zawiesiny komórek powoduje zatem

utratę jonów potasu.

W przemyśle farmaceutycznym stosującym nowoczesne technologie

w produkcji antybiotyków nigdy nie używa się oryginalnych organizmów,

lecz mutanty zapewniające znacznie większą wydajność procesu. Pleśń

badana przez Fleminga dawała około 3 μg penicyliny w 1 ml hodowli,

podczas gdy obecnie stosowane szczepy produkują jej co najmniej 2000

razy więcej. Tak wysoka wydajność jest wynikiem mutacji i selekcji

bardziej aktywnych szczepów, lepszych podłoży hodowlanych oraz efektem

badań w kierunku optymalizacji procesu produkcyjnego. W miarę poznawania

szlaków produkcji wielu antybiotyków rozwijają się dalsze

badania zmierzające do zwiększenia wydajności w wyniku izolacji

i selekcji mutantów.

Mikotoksyny

Mikotoksyny są wtórnymi metabolitami grzybów, trującymi dla ludzi

i zwierząt. Znanym producentem mikotoksyn jest buławinka czerwona

Claviceps purpurea (rozdz. 5.4). Wytwarza ona alkaloidy, pochodne

kwasu lizergowego (ergotamina, ergotoksyna) o dużym znaczeniu

w leczeniu schorzeń sercowo-naczyniowych i migren. Są one również

używane jako środki halucynogenne. Podczas gdy wspomniane alkaloidy

nadal są produkowane przez sztuczne zakażenie zboża buławinką,

coraz większego znaczenia zaczynają nabierać hodowle innych

szczepów, m.in. C. paspali.

Wiele grzybów, łącznie z niektórymi podstawczakami oraz mniej

znanymi przedstawicielami Myxomycetes, wytwarza bardzo silne toksyny

oraz inne związki organiczne o często nieznanym składzie chemicznym,

które mogą mieć inne interesujące właściwości. Do toksyn należą m.in.

amanitatoksyna wytwarzana przez trujący grzyb Amanita phalloides oraz

mikotropina i muskaryna (A. patherina, A. muscaria i Inocyte patouillardi).

Badania nad wtórnymi metabolitami grzybów rozpoczęto dopiero niedawno.

Ostatnio miksotoksyny stały się przedmiotem ogólnego zainteresowania,

gdy na skutek zatrucia aflatoksyną wyginęły tysiące indyków.

Aflatoksyny są pochodnymi kumaryny wytwarzanymi przez szczepy

Aspergillus flavus, A. parasiticus i A. oryzae, jak również przez inne

grzyby. Mogą się znajdować w różnych zapleśniałych produktach spożyw-

czych, jak orzeszki ziemne, zboże, nasiona roślin oleistych i karma

zwierzęca. Związki te mają również charakter rakotwórczy.