wykłady, Mikrobiologia ogólna


Spis treści


Mikrobiologia ogólna


1



1. Wstęp do mikrobiologii

2

2. Systematyka i taksonomia 2

1) G(-) Mikroaerofilowe pałeczki nieprzetrwalnikujące 2

2) G(-) tlenowe pałeczki nieprzetrwalnikujące 3

3) G(-) względnie beztlenowe pałeczki nieprzetrwalnikujące 3

3) G(+) tlenowe lub względnie beztlenowe ziarniaki nieprzetrwalnikujące 5

4) G(+) tlenowe lub beztlenowe pałeczki przetrwalnikujące 6

3. Charakterystyka bakterii
7

Źródła zmienności genetycznej

7

Budowa ściany komórkowej


7

Otoczki i śluzy
8

Ruch bakterii
9

Substancje zapasowe
9

Przetrwalniki
10

Czynniki środowiska, a drobnoustroje 10

4. GRZYBY

11

Drożdże 11

PLEŚNIE 12





5. WZROST DROBNOUSTROJÓW

12

Czas generacji i liczba podziałów 12

Krzywa wzrostu










13

6) Komórka

14

7) Podział drobnoustrojów ze względu na optimum wzrostu

16

8) Inaktywacja drobnoustrojów 18

9) Drobnoustroje, a ekologia

19

10) WIRUSY

21

1. WSTĘP

21

2. BUDOWA
21

3. TAKSONOMIA
21

4. PODZIAŁ ZE WZGLĘDU NA GOSPODARZA
22



5. CYKLE ROZWOJOWE
22

6) WIROIDY
23

7) PRIONY

23



23




a) Wstęp do mikrobiologii
b) Systematyka i taksonomia → Podział sztuczny bakterii
c) Budowa i podstawowe procesy u bakterii (ściana, otoczka, narządy ruchu, substancje zapasowe, przetrwalnikowanie, wpływ czynników środowiskowych.
d) Fazy wzrostu kolonii
e) Budowa komórki eukariotycznej i prokariotycznej
f) Plazmidy (prezentacja)
g) Metody barwienia
h) Podział ze względu na warunki wzrostu
i) Sterylizacja, różne sposoby zabijania drobnoustrojów i witaminy
j) Interakcje z innymi organizmami, środowiskiem
k) Patogeny, antybiotyki (powtórka z weta)
l) Wirusy: Taksonomia...

Drobnoustroje poza ogromnym znaczeniem dla środowiska jako grupa stanowiąca większość reducentów, ma także ogromne znaczenie dla człowieka. Wykorzystuje się je prawie w każdej dziedzinie życia, a w szczególności w przemyśle spożywczym oraz farmaceutycznym. Mogą służyć do uzyskiwania potrzebnych organicznych związków, do metabolizmu już istniejących, a także do oczyszczania środowiska (np. dzięki właściwościom gnilnym) oraz do np. absorbowania trucizn ze środowiska.

Istnieją różne metody klasyfikacji drobnoustrojów. Obecnie najpowszechniej używana ze względu na jej znaczenie praktyczne jest klasyfikacja sztuczna, grupująca organizmy ze względu na podobieństwo. Istnieje jeszcze taksonomia numeryczna grupująca ze względu na ilość podobieństw wśród cech biochemicznych oraz fizjologicznych, a także obecnie najprężniej rozwijająca się taksonomia filogenetyczna oparta na badaniu pokrewieństwa.

KLASYFIKACJA SZTUCZNA


Helicobacter pylori odpowiedzialny jest z kolei za wrzody żołądka → wytwarza NH4+ zobojętniając HCl.

Grupa coli:

Bakterie z grupy coli są wskaźnikiem bezpieczeństwa środowiska. Fermentują laktozę.
O157H7 → typ serologiczny E.coli powodujący b. silne zatrucia.


Bakterie mlekowe mają zdolność do produkcji kwasu mlekowego (heterofermentacja- synteza kwasu mlekowego oraz etanolu, kwasu octowego itp.; homofermentacja - synteza tylko kwasu mlekowego; bakterie pseudomlekowe- wytwarzają kwas mlekowy, ale tylko z metabolitów pośrednich).

a) Bacillus → tlenowe

B. subtilis
B. anthracis
B. megaterium
B. cereus
B. thuringiensis
B. licheniformis

Saprofity lub patogeny. Wiele z nich wystepuje popularnie w glebie, posiadają zdolność do denitryfikacji. Katalazododatnie

b) Clostridium → beztlenowe

C. botulinum → żyją w war. beztlenowych w pH powyżej 4,5
C. perfringens
C. sporogenes
C. tetani → teżec; wytwarza silną neurotoksynę powodującą gromadzenie się acetylocholiny

Katalazoujemne, mają tylko ok. 30% GC mimo termostabilności

Klostridia masłowe:
C. butyricum
C. butylicum
C. saccharoacetobutyricum
C. saccharoacetobutylicum
C. pectinovorum
C. thermoaceticum → wytwarza w war. beztl. kwas octowy bezpośrednio z glukozy

Ich rozwojowi zapobiega się obniżając pH poniżej 4,2 (tzw. minimum cukrowe). Klostridia należące do tzw. klostridiów sacharolitycznej syntetyzują kwas masłowy.






Zmienność genetyczna u bakterii jest wynikiem poziomego transferu genów, jedynym wyjątkiem jest nierównomierne przekazywanie wielokopijnych plazmidów.

1) Transdukcja: przeniesienie fragmentu DNA z jednej bakterii do drugiej poprzez wirusa.
2) Transformacja: proces aktywnego pobierania przez drobnoustroje DNA ze środowiska, zazwyczaj w postaci plazmidów. Drobnoustroje zdolne do transformacji określa się jako kompetentne. Kompetencja jest uwarunkowana genetycznie, można ją zwiększać sztucznie poprzez stosowanie roztworów soli.
3) Koniugacja: przekazanie DNA w postaci plazmidu z komórki F+ do F- lub plazmidu z fragmentami chromosomu bakteryjnego z Hfr do F-

Bezpośrednio przy błonie cytoplazmatycznej znajduje sie przestrzeń peryplazmatyczna o konsystencji żelu.
Szkielet ściany komórkowej składa się z mureiny (peptydoglikan). Jest to heteropolimer zbudowany z naprzemiennych cząstek N- acetyloglukozoaminy oraz kwasu
N-acetylomuraminowego. Mery te mają za pomocą reszty mleczanowej przyczepione krótkie peptydy odgrywające ważną rolę w sieciowaniu mureiny. Charakterystyczną cechą ścian komórkowych bakterii jest obecność D-aminokwasów (m.in. D-alanina).

  1. GRAM-DODATNIE - Firmicutes

    Ich ściany komórkowe posiadają dużo mureiny (30 do 70%) ułożonej w około 40 warstw. Aminokwasy tworzące mostki są cechą gatunkową. Niewielka zawartość białek.
    Charakterystyczna cechą bakterii G(+) są kwasy tejchojowe zbudowane z 8-50 cząsteczek glicerolu lub rybitolu połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi. Kwasy te mogą się łączyć z mureiną poprzez reszty fosforanowe.
    Bakterie należące do tej grupy wytwarzają wiele enzymów na zewnątrz komórki. Są mniej odporne od G- na czynniki środowiskowe, sole kwasów żółciowych (czynnik selekcyjny) oraz antybiotyki.
    Są również nieodporne na lizozym (enzym bez grupy prostetycznej odkryty przez Fleminga), który niszczy ich ścianę i zostawia sam protoplast, który jest z kolei nieodporny na roztwory hipotoniczne, więc łatwo ulegają plazmolizie. Proptoplasty należy przechowywać w roztworze izotonicznym.
    Do tej grupy zaliczają się również bakterie pozbawione ściany komórkowej takie jak Mycoplazma, barwiące się gramem.

  2. GRAM-UJEMNE - Gracilicutes

    Mają ścianę zbudowaną z pojedynczej warstwy mureiny stanowiącej poniżej 10% suchej masy (dla E.coli). Mureina nie zawiera lizyny i nie jest usieciowana mostkami peptydowymi. Na zewnątrz od ściany znajduje się błona zewnętrzna zbudowana z lipidów
    (-sacharydy, -proteiny) przyłączonych do zewnętrznej warstwy mureiny. Stanowią do 80% masy.
    Lipopolisacharydy (LPS) stabilizowane są jonami wapnia. Całość zabezpiecza bakterie G(-) przed działeniem lizozymu. Po chelatacji Ca2+ np. EDTA możliwa jest degradacja ściany przy pomocy lizozymu (rozszczepia wiązania w szkielecie mureiny).

    Lipoproteina Browna- utrzymuje mureinę w odpowiedniej odległości od ściany zewnętrznej.
    LPS stanowią ważny antygen.
    W przestrzeni peryplazmatycznej znajdują się m. in. enzymy zdolne do rozkładu antybiotyków (np. beta- laktamazy rozkładaja antybiotyki beta-laktamowe do których należą między innymi penicylina oraz cefalosporyny). Są nieco mniej wrażliwe od G(+) na złe warunki.
    Komórki G(-) z częsiowo zniszczoną ścianą komórkową zwane są sferoplastami.

  3. Tenericutes - brak ściany komórkowej, np. Archebaktrie lub Mycoplasma

  4. Dodatkowe informacje

    Błona zewnętrzna oprócz czysto mechanicznej funkcji spełnia także niemniej ważne funkcje fizjologiczne, np. lipopolisacharydy (LPS) znajdujące się na zewnątrz pełnią funkcje "komunikacyjne" oraz będące endotoksynami nadającymi komórce silny ładunek ujemny. Wywołują one odpowiedź odpowiedź immunologiczną (stanowią antygen O), co ma znaczenie zarówno jako czynnik patogenności jak i czynnik stymulacyjny przy symbiozie z roślinami (antygen O pobudza rośliny do tworzenia brodawki; wydzielania tlenku azotu itp.) LPS są zbudowane z lipidu A, wielocukru rdzeniowego oraz pozostałych jednostek cukrowych stanowiących antygen O. Wpływają m.in. na poziom patogenności (E.coli - H7O157).

Otoczka śluzowa - śluzy
Warstwa S- białka, występuje u niektórych G(+) np. Lactobacillus i u wszystkich G(-) poza Enterobacteriaceae

Śluzy różnią się od otoczek tym, że można je oddzielić od hodowli w wyniku wytrząsania. Otoczki zmniejszają wydzielanie wody, dlatego wystepują głównie u G(-) bardziej podatnych na wysychanie. Są zapisane na plazmidach.
Śluzy zbudowane są z dekstranów, wystepuja np. u Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mitis, mutans (zieleniejące) oraz u bakterii octowych (Acetobacter aceti) odpowiedzialnych za syntezę celulozy bakteryjnej.

Substancje śluzowe pozwalają na:
- Tworzenie struktur przestrzennych (diplo, strepto...)
- Tworznie zooglei - zlepieńce w kefirze, grzybek japoński (bakterie octowe + drożdże) co ma działanie synergistyczne (wspólnie drobnoustroje działają sprawniej niż osobno) oraz chroni przed fagocytozą.



Bakterie poruszają się głównie dzięki rzęskom. Rzęski mają długość do 20 mikrometrów długości, poruszają się ruchem obrotowym, zbudowane z białka flageliny. U G(+) jedna para pierścieni je mocuje, u G(-) dwie. Rzęski obracają się z prędkoscią 3000obr/min w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Jeżeli poruszają się zgodnie to bakteria koziołkuje.
Prędkość bakterii wynosi 20-60 mikro m/s
Istnieja różne rodzaje urzęsienia:
- peritrichalne (do okoła): Enterobacteriaceae, przetrwalnikujące, Acetobacter
- lofotrichalne (pęczek biegunowy): Pseudomonas i Gluconobacter
- Lateralne (na biegunie): Selenomonas

Ruch związany z taksją:
- w kierunku składników odżywczych
- w kierunku atraktanta
- wertikalnie (dzięki obecności wakuoli gazowej "zapisanej" na plazmidzie)
- chemotaksja ujemna- ucieczka od bakteriocyn, antybiotyków...

Bakterie mogą się także porozumiewać, zarówno w sprawach spożywczych jak i np. o zagrożeniach dzięki EDF (extracellular death factor) wywołującym śmierć samobójczą komórki (czy to nie zabezpiecza reszty kolonii?).

a) skrobia
b) Glikogen: głównie u eukariota (drożdże), czasem u Enterobacteriaceae oraz Micrococcaceae
c) Lipidy: triacyloglicerole, kwas poli-beta- hydroksymasłowy

Lipidy są syntetyzowane głównie przez drożdże z rodzajów:
- Candida - C. utilis
- Rhodotorula - R. glutinis, R. gracilis, R. rubra, R. mucilaginosa

Drożdże mają możliwość syntezy np. tłuszczu kakaowego z biodiesla lub ptł. posmażalniczych.
d) Barwniki : tianocyjanina u sinic

Wśród bakterii przetrwalniki wytwarzają bakterie z rodzajów Clostridium oraz Bacillus. W endosporach znajduje się kwas dipilikonowy (ok.15%) nadający odporność na wyższe temperatury.

Tworzenie się przetrwalników:

1) Replikacja DNA
2) Podział ( w 1/3) z wnikaniem błony cytoplazmatycznej otaczającej tworzącą się komórkę. Owa błona zaczyna syntetyzować mureinę. Tworzy się korteks. Często tworzys się egzosporium z wieloma mostkami -S-S- między siarkowymi aminokwasami.
Sporulacja trwa około 7 godzin, w jej wyniku wzrasta odpornośc na temperaturę. Tworzenie się spor można badać poprzez pomiar stopnia załamania swiatła, który wzrasta.
Sporulacja może być wywołana szokiem termicznym, zmianą środowiska na niekorzystne, brakiem pożywienia, a także przeniesieniem do wody destylowanej.

Dojrzałe przetrwalniki:

Ich metabolizm zmniejsza się do minimum, zwiększa się natomiast ich odporność na temperaturę, różne, związki chemiczne, promieniowanie jonizujące. Odporność na temperaturę związana jest z kwasem dipilikonowym, natomiast na promieniowanie jonizujące z obecnością mostków siarczkowych między aminkwasami. Krótki impuls termiczny indukuje pobiearanie wody, uwalnianie jonów, wapniowych, kwasu dipilikonowego.
Przeżywalność endospor jest bardzo wysoka, można je z łatwością przechowywać liofilizowane.


Czynniki:

- fizyczne - temperatura, cisnienie mechaniczne oraz osmotyczne, promieniowanie, ultradźwięki
- chemiczne - tlen (potencjał oksydoredukcyjny), pH, obecność metabolitów, antybiotyki, antyseptyki...
- biologiczne: wzajemne relacje relacja fagów z bakteriami

Temperatura:
- optimum - w niej wystepuje maksymalny przyrost komórek na jednostkę czsu (najkrótszy czas generacji)
- minimalna - wzrost już nie występuje, drobne jednak żyją
- maksymalna - powyżej niej występuje efekt letalny

Ze względu na temperatury kardynalne:

- psychrofile (kriofile) - optymalna temperatura wzrostu poniżej 20 st.C

- mezofile- optymalna temperatura wzrostu między 20, a 40 stopniami (dokł. 28-37)

- termofile- optimum powyżej 40 st. C

- hipertermofile - powyżej 100 st.C




- ph = 2,2 do 8,5
- Są mezofilami, ale tolerują także wyższe i niższe temperatury (choć mniej od bakterii i pleśni)
- Aeroby (mogą jednakże przeprowadzać fermentację alkoholową lub mlekową w warunkach beztlenowych) - efekt Pasteura (znaczny przyrost biomasy w warunkach tlenowych, beztlenowych nieznaczny).
- heterotrofy wymagające do wzrostu mono, di, czasem trisacharydów
- !Stosunek azotu org. do nieorg. musi wynosić 2:1 (teoria Folkesa)


- Drożdże szlachetne są auksotroficzne: wymagają do wzrostu dodatkowych substancji oprócz podstawowego źródła węgla, gdyż nie są zdolne do syntezy niektórych związków (witamin, aminokwasów). Potrzebują np. biotyny (witamina H) będącej kofaktorem karboksylaz.
- Drożdże dzikie są prototrofami- do wzrostu potrzebne im jest jedynie jedno źródło węgla i związki nieorganiczne.

Produkcja biomasy drożdży:

Wymagane są warunki tlenowe.
- Wg teorii Fincka, z całej puli wykorzystanego węgla, na produkcję biomasy idą 2/3, reszta natomiast na metabolizm.
- Zjawisko Craptree- Przy zbyt dużym stężeniu cukru w stosunku do biomasy, nastepuje fementacja alkoholowa miast wzrostu.

Idealne proporcje dla drożdży : C 50; N 8; P 1,1 (dla wzrostu czy fermentacji????)

Przy zastosowaniach przemysłowych drożdży ważne są szczepy wykazujące określone cechy, np. przy produkcji mocengo wina liczy się odporność na etanol, słodkiego wina- na wysokie stęż. cukru itp.

Produkcja miodu pitnego- drożdże osmofilne, proces sycenia miodem (powolne dodawanie)
Produkcja piwa-
-drożdże dolnej fermentacji - 5 do 15 st.C komórki agragują i opadają w postaci flokuł - używane przy produkcji lagerów, pilznerów, koźlaków (S.carlsbergensis)
-drożdże górnej fermentacji - 15-25 st.C; S.cerevisiae, mniej klarowne piwa - ale, stout, portery.

Składnikiem ich ściany komórkowej są glukanoproteiny oraz chityna. W przeciwieństwie do drożdży trudno ulega autolizie. Posiadają wyjątkowo bogaty układ enzymatyczny 9hydrolazy). Są bezwzględnymi tlenowcami. Są średnio wrażliwe na podwyższoną temperaturę. Są wyjątkowo odporne na małą aktywność wodną, z czego wynika ich zdolność do wzrostu na suchych podłożach (chleb), wystarcza im jedynie para wodna.
Są wykorzystywane przede wszystkim do produkcji enzymów, antybiotyków, witamin, lipidów.

Szkodliwość pleśni:
- psucie materiału biologicznego pod wpływem hydrolaz
- synteza mitotoksyn (kumulują się w różnych organach, często są kancerogenne). Mitotoksyny są zazwyczaj węglowodorami (hydrofobowymi) co ułatwia im przenikanie przez błony biologiczne. Produkowane są głównie przez rodzaje: Aspergillus, Penicillium, Trichotecium, Fusarium
A. flavus- aflatoksyna

W celu ochrony ziaren przed rozwojem pleśni suszy się je do 13-14% wilgotności, temperatura chłodnicza jedynie zwalnia rozwój pleśni.

Po wyelimowaniu niekorzystnych czynników drobnoustroje dzielą się w postępie geometrycznym wg wzoru: x(n)=x0*2^n
Czas między poszczególnymi podziałami nazywany jest czasem generacji G. Jednym ze sposobów wyznaczania czasu generacji jest pomiar absorbancji wzrastającej kolonii, która jest skorelowana z jej liczebnością.
Dla drożdży liczba podziałów jest ograniczona do około 20 -40 n. Jest to związane z wystepowaniem blizn dla komórkach po podziale.

liczba podziałów: n= (logN-logN0)/log2

Np. Jeżeli w 3h liczebność wzrasta z 10^6 do 10^9 / cm^3 to
n=(log10^9-log10^6)/log2
n=(9-6)/0,3=3/0,3=10
n= 10 podziałów w 3h

Aby obliczyć G należy ułożyć proporcje: 10- 180min
1 - G
-------------
G= 18 min






a) Faza adaptacyjna (lagfaza)- występuje przy przeniesieniu drobnoustrojów do nowego środowiska (np. nowa pożywka). Liczba komórek nie zwiększa się, może czasem maleć; komórki rosną, ekspresja genów zwiększa się wielokrotnie (mRNA 20x).
Lagafazę można wydłużać poprzez obniżenie temperatury.

b) Faza akceleracji (młodości fizjologicznej) - Duże drobnoustroje zaczynają się dzielić, są wtedy najmniej odporne

c) Faza wzrostu logarytmicznego - najkrótszy czas generacji, następuje akumulacja metabolitów, komórki w miarę dzielenia zmniejszają swoje rozmiary co zwiększa ilość substancji pobieranych z otoczenia

d) Faza wzrostu opóźnionego - czas generacji się wydłuża, duże nagromadzenie metabolitów, możliwa autoliza komórek.

e) faza letalna - komórki w wyniku nagromadzenia metabolitów umierają.


Dla hodowli ciągłej:

W celu pominięcia lagfazy można hodowlę przenieść w czasie fazy wzrostu opóźnionego, w wyniku czego od razu przechodzą do fazy wzrostu logarytmicznego.

Biotechnologia:

Drobnoustroje używane do biosyntezy np. antybiotyków należy jak najdłużej utrzymywać w fazie stacjonarnej.

Drobnoustroje używane z kolei do np. produkcji etanolu, bakteriocyn (Lactobacillus), biomasy (np. białka) są najwydajniejsze w fazie wzrostu logarytmicznego.

Drożdże są stosowane jako pasza (białko pochodzenia mikrobiologicznego to SPC), trzeba z nich usuwać kwasy nukleinowe, ponieważ ludzie nie posiadają urikazy.

Diauksja- wzrost wielofazowy (np. 2x lagfaza)

E. coli na pożywce z glukozą i sorbitolem lub laktozą, najpierw opierdala glukozę (lub inny substrat za który odpowiedzialne są enzymy konstytutywne), potem dopiero substrat za którego metabolizm odpowiadają enzymy indukowane (często zapisane na plazmidach).