16.04
WODA
Bakterie z grupy coli
Bakterie z grupy coli to przede wszystkim szczepy Escherichia coli oraz drobnoustroje z rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella. Wykrywane są one na podłozach z laktozą po inkubacji w temperaturze 37oC.
Bakterie z grupy coli typu kałowego (termotolerancyjne) to głównie szczepy E.coli i tylko nieliczne szczepy z rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają zdolność fermentacji laktozy w temperaturze 44oC.
Obecność w badanej próbce wody bakterii z gr coli ( zanieczyszczenie wody ściekami, glebą , gnijącym materiałem roślinnym lub kałem)
bakterii grupy coli typu kałowego świadczy o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu wody kałem.
Dla większości rodzajów wód zalecane jest oznaczanie liczby bakterii obu grup coli.
Woda-Liczba pałeczek gr coli metodą filtrów membranowych
Przefiltrować 2 porcje po 100cm3 przez filtry celulozowe o średnicy porów 0,45μm
filtry umieścić w płytkach na powierzchni podłoża wybiórczego- agar z tergitolem
inkubacja E.coli- w temp. 44 oC/24h
pałeczki gr coli - w temp 37o C/24h
policzyć charakterystyczne żółte kolonie pałeczek gr coli.
Na agarze laktozowym z solą tetrazolową TTC z tergitolem:
o prodkcji kwasu z laktozy świadczy zmiana zabarwienia wskaźnika zmian pH- błękitu bromotymolowego z zielonego na żółty.
Tergitol hamuje wzrost bakterii Gram- dodatnich
Bakterie z gr coli rosną w postaci żółto- pomarańczowych kolonii z wyraźnym zażółceniem pożywki pod powierzchnią filtra.
Inne bakterie G- np. Proteus sp. czy Pseudomonas sp. rosną na tym podłożu w postaci kolonii o barwie czerwonej.
Obecność bakterii gr coli(przede wszystkim E.coli) jest dowodem skażenia wody zanieczyszczeniami fekalnymi, często wskazuje na problemy z jej uzdatnianiem.
Jakość wody- Metoda filtracji membranowej
E.coli i bakterie grupy coli
Przygotowanie próbki
Posiew na podłoże selektywne- Agar TTc
Test potwierdzenia
- test na oksydazę
- test na wytwarzanie indolu
Wskaźniki bakteriologiczne jakości wody do picia
Wymagania mikrobiologiczne
Wymagania podstawowe:
E coli 0 w 100cm3
Enterococcus sp 0 w 100cm3
Wymagania dodatkowe
bakterie gr coli 0 w 100cm3
liczba bakterii tlenowych rosnących w 36 oC po 48 do 50jtk w 1 cm3
l. bakterii tlenowych rosnących w 22oC po 72h do 100 jtk w 1cm3
Clostridium perfringens 0w 100cm3
Woda- Oznaczanie miana drobnoustrojów
Miano jest to najmniejsza objętość badanego produktu, w którym znajduje się przynajmniej jedna żywa komórka badanej bakterii.
Oznaczenie miana służy do określenia stopnia zanieczyszczenia badanego produktu.
Określenie miana coli świadczy o zanieczyszczeniu fekalnym.
Oznaczanie NPL i miana bakterii z gr coli metodą fermentacyjno- probówkową
Najbardziej prawdopodobna liczba bakterii z gr coli (NPL)- liczba bakterii z gr coli w 100cm3 badanej próbki wody lub ścieków określona (z tablic) na podstawie rachunku prawdopodobieństwa.
Miano coli- najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków wyrażona w cm3, w której stwierdza się jeszcze obecność bakterii grupy coli.
Wskaźniki bakteriologiczne jakości wody do picia
Miano coli jest wartością niemianowaną
Jeśli miano coli wynosi 10 tzn., ze w 10ml znajduje się co najmniej 1 komórka bakterii z gr coli.
Wartość miana coli jest odwrotnie proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia wody.
Oznaczanie bakterii z gr coli metodą fermentacyjno- probówkową.
Bakterie z gr coli można wykryć metodą fermentacyjno- probówkowa, a wynik podać jako miano coli.
Wykrywanie tych bakterii oparte jest na zdolności do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłozu kwasu oraz gazu.
W przypadku, kiedy dopuszczalne miano coli wynosi:
100 (np.woda pitna)- wysiewa się = 50ml i 5 x 10ml
50- wylewa się= 5x 10ml i 1 ml oraz 0,1ml
10- wysiewa się= 2x 10ml i 1ml oraz 0,1ml
Wykrywanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjni- probówkową( FP)
Etap I -Badanie wstępne
Polega ono na posiewie na podłoże płynne z laktozą i purpurą bromokrezolową ( podłoże LPB, Eijkamana)
posiane próbki inkubowane są w temp. 37OC przez 24-48h
za wynik dodatni uznaje się obecność gazu w rurkach Durhama lub występowanie pęcherzyków gazu w podłożu i zmianę barwy z fioletowej na żółtą.
Zmian te wskazują na wzrost bakterii i fermentację laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu.
Etap II - Badanie potwierdzające
Badanie to wykonuje się w celu potwierdzenia obecności bakterii z gr coli.
Badanie potwierdzające wykonuje się na pożywce Endo- zawiera fuksynę zasadową oraz siarczan sodowy, hamujące wzrost G+
Posiać metodą powierzchniową za pomocą ezy niewielką ilość hodowli bakterii z podłoża (LPB) na podłoże Endo
Inkubować hodowlę w temp. 37OC w ciągu 24h
(w przypadku E.coli zawiesinę bakterii z hodowli na podłożu LPB przenieść ezą na podłoże laktozowe z zielenią brylantową i inkubować w temp. 44OC w ciągu 18-24h);
Za wynik dodatni przyjmuje się wzrost kolonii ciemnoczerwonych z charakterystycznym metalicznym połyskiem.
W wyniku wzrostu bakterii wykorzystujących laktozę następuje uwalnianie fuksyny do podłoża, która barwi charakterystycznie bakterie występujące w kolonii.
Etap III- Badanie uzupełniające
Jest to dalszy etap badania potwierdzającego i stosuje się je w przypadku, gdy na pożywce Endo wyrosnę nietypowe kolonie podejrzane o przynależność do gr coli.
Badania obejmują:
określenie zdolności wyizolowanego szczepu do fermentacji laktozy z wytworzenie kwasu i gazu (tzw. wtórna fermentacja laktozy)
Wykonanie barwienia Grama i obserwacje mikroskopowe
Wykonanie testu na obecność oksydazy cytochromowej
wytwarzanie indolu z tryptofanu na podłożu z wodą peptonową i tryptofanem ( w przypadku E.coli)
rozkład glukozy do kwasu ( reakcja z czerwienią metylową)
wytwarzanie acetoiny z glukozy (reakcja Voges- Proskauera-VP)
wykorzystanie cytrynianu jako jedynego źródła węgla na podłożu Simmonsa
Paciorkowce kałowe
Paciorkowce kałowe to grupa bakterii kulistych lub owalnych , G+, występujących w postaci komórek pojedynczych, dwoinek lub krótkich łańcuszków.
Obejmuje ona drobnoustroje z rodzajów Enterococcus i Streptococcus m.in. E. Faecalis, E.faecium, S equinus i S. bovis
Występują one powszechnie w kale ludzi i zwierząt.
Stwierdzenie obecności paciorkowców kałowych w badanej próbie świadczy o kontakcie z zanieczyszczeniami typu kałowego, podobnie jak obecność bakterii z gr coli.
Występowanie enterokoków w liczbie znacznie przewyższającej liczbę bakterii z gr coli, sugerować może zanieczyszczenie wody kałem zwierzęcym lub ściekami pochodzącymi z ferm hodowlanych.
Liczba paciorkowców kałowych z rodzaju Enterococcus:
przefiltrować 100cm3 przez filtr celulozowy o średnicy porów 0,45μm
filtr umieścić na płytce, na powierzchni podłoża Slanetz'a i Bartley'a.
Inkubacja w temp. 37OC/ 48h
policzyć charakterystyczne kolonie
Enterococcus sp. rosną w postaci różowych lub bordowych drobnych kolonii na podłożu Slanetz'a i Bartley'a.
Obecnośc paciorkowców kałowych w badanej wodzie świadczy o świeżym zanieczyszczeniu wody.
Podłoże Slanetz iBartley
Służy do określania liczby enterokoków metodą filtrów membranowych, jak również przydatne w metodzie płytkowej.
Jest podłozem wybiórczym w stosunku bakterii G- , dzięki 0,04% stężenia azydku sodu, natomiast obecność chlorku 2,3,3-trifenylotetrazoliowego (TTC) powoduje zahamowanie wzrostu większości bakterii G+
Enterokoki rosną w obecności TTC, mają zdolność redukcji TTC do czerwonego formazanu, dzięki czemu wyrosłe kolonie enterokoków przybierają charakterystyczne zabarwienie
Enterokoki są bardziej odporne na różne metody uzdatniania i dezynfekcji niż bakterie gr coli
Najważniejsze cechy charakterystyczne z tej gr bakterii to:
zdolnośc wzrostu w temp 45oC
zdolność wzrostu w obecności 40% żółci
zdolność wzrostu w temperaturze 10oC przy pH 9,6
zdolność wzrostu w obecności 6,5% chlorku sodowego
ujemny test na katalazę
barwienie dodatnie metodą Grama
zdolność hydrolizy eskuliny do glukozy i eskuletyny. W obecności jonów Fe 3+ powstająca eskuletyna tworzy kompleks o barwie od oliwkowo-zielonej do czarnej.
Testy potwierdzające:
Agar z żółcią, zielenią i azydkiem używany do wybiórczej izolacji i różnicowania enterokoków z materiałów zawierających bogatą florę mikrobiologiczną
charakterystyczne kolonie enterokoków są bezbarwne lub szare i otoczone czarną obwódką ( hydroliza eskuliny)
Wybiórczość w stos do bakterii G- uzyskano dzięki zawartości azydku sodu
Żółć hamuje wzrost niektórych bakterii G+ innych niż enterokoki
Laseczki z rodzaju Clostridium
Clostridia redukujące siarczyny są bardzo dobrym wskaźnikiem prawidłowości prowadzonych procesów uzdatniania wody
Przetrwalniki tych bakterii, a wraz z nimi również cysty pasożytniczych pierwotniaków (Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia) powinny być wyeliminowane właśnie w tych etapach uzdatniania wody, gdyż są one bardzo odporne na działanie środków dezynfekcyjnych.
Wykrycie bakterii z rodzaju Clostridium jest technicznie znacznie bardziej proste od poszukiwania pierwotniaków pasożytniczych i daje duzą pewność, że woda uzdatniona jest wolna od pierwotniaków i jej robaków chorobotwórczych (helmintów)
Liczba Clostridium perfringens
przefiltrować 100cm3 przez filtr celulozowy o średnicy porów 0,22μm
filtr umieścić w płytce na powierzchni podłoża agar siarczynowo-żelazawy
inkubować w temp. 37OC/ 48h
policzyć charakterystyczne czarne kolonie
Beztlenowe laseczki Clostridium perfringens ze względu na zdolność do tworzenia przetrwalników wykazują żywotność podczas długotrwałego przebywania w niekorzystnych warunkach
Ich obecność w badanej wodzie może świadczyć o odległym w czasie zanieczyszczeniu
Przetrwalniki Clostridium perfringens bardzo oporne na działanie środków dezynfekcyjnych są doskonałym wskaźnikiem procesów uzdatniania i dezynfekcji wody.
Metoda oznaczania w podłożu płynnym
Pobieranie próbek
Rozcieńczanie próbek
Hodowla
Badania potwierdzające
Wykrywanie redukcji azotanów i ruchliwości bakterii
Bakterie z rodzaju Legionella
Mogą powodować nietypowe zapalenie płuc u ludzi (chorobę legionistów) i gorączkę Pontiac.
Sczególnie niebezpieczne dla człowieka są bakterie należące do gatunku Legionella pneumophila
Dostają się one do płuc w mikroaerozolach o srednicy 2,0-5,0 μm powstających np. w kabinach prysznicowych
Postaci płucnej legionellozy towarzyszy suchy kaszel, zaburzenia w oddychaniu, temperatura powyżej 40 oC, Zaburzenia świadomości. Śmiertelność wynosi 10-20% zachorowań.
Rezerwuarem tych bakterii są systemy ciepłej wody i urządzenia wentylacyjne. Bakterie te mogą kolonizować wewnętrzne części rur z ciepłą wodą, zbiorniki na ciepłą wodę, węże chłodnicze, głowice natryskowe pryszniców.
Bakterie z rodzaju Legionella są to G- pałeczki posiadające polarnie umieszczone wici w liczbie od 1 do 3
do wzrostu potrzebują żelaza i cysteiny
ich naturalnych rezerwuarem są wody śródlądowe i morskie
licznie występują również w glebie i gorących źródłach wody
wyizolowano do tej pory 46 gatunków z rodzaju Legionella, wśród których zidentyfikowano 70 grup serologicznych
są wewnątrzkomórkowymi pasożytami pierwotniaków
Agar Legionella GVPC - wybiórcza izolacja Legionella
agar Legionella GVPC został opracowany specjalnie dla izolacji z dróg oddechowych większości gatunków Legionella, szczególnie tych odpowiedzialnych za infekcje, Legionella pneumophila, która występuje najczęściej( gorączka Pontiac)
to wybiórcze podłoże umożliwia również ocenę ilościową Legionella w wodzie zgodnie ze standardami
Aktywny węgiel drzewny absorbuje substancje toksyczne z wyciągu drożdżowego i w ten sposób stymuluje wzrost Legionella
charakterystyczne kolonie są szaro-niebieskie, ale wraz z wiekiem mogą stawać się białe. Mają one regularne różowawe krawędzie
Podłoże GVPC hamuje wzrost bakterii G+, niektórych bakterii G-, drożdżaków i pleśni, dzięki obecności antybiotyków
Podłoże BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract) Agar
Zbuforowany agar z wyciągiem z drożdży, z węglem drzewnym- BCYE- jest stosowane do izolacji i hodowli gatunków bakterii z rodzaju Legionella pneumophila i innych baktrii z rodzaju Legionella z próbek pochodzenia środowiskowego i klinicznego
wyciąg z drożdży dostarcza białka
L-cysteina (niezbędny aminokwas) oraz pirofosforan żelaza (dodatek uzupełniający żelazo) zostały włączone w skład podłoża w celu spełnienia specyficznych wymagań odżywczych z bakterii z rodzaju Legionellla
aktywny węgiel drzewny rozkłada nadtlenek wodoru, produkt metabolizmu toksyczny dla gatunków z rodzaju Legionella, może też absorbować dwutlenek węgla i modyfikować napięcie powierzchniowe.
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa wykrywany jest w wodzie do picia i na potrzeby gospodarcze
Przedstawicieli tego gatunku wyizolowano z kału ludzkiego oraz w przypadkach zakażeń organizmu- z dróg moczowych, ucha środkowego, ropiejących ran itp.
stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi i zwierząt
występują powszechnie w wodach powierzchniowych i glebie
mogą bytować w chlorowanej wodzie, gdyż odznaczają się znaczną odpornością na środki dezynfekcyjne
Dlaczego kontrolujemy jakość sanitarną wody?
Możliwość zakażenia ludzi przez wodę zmusza do stałej kontroli higieniczno-sanitarnej, zarówno wody przeznaczonej do picia, jak i też wody w basenach kąpielowych a nawet w zbiornikach wód powierzchniowych
Przyczyną zakażeń są mikroorganizmy chorobotwórcze wydalane przez ludzi chorych i nosicieli
bakterie chorobotwórcze występują w ściekach i w wodach powierzchniowych w znacznie mniejszych ilościach niż występujące masowo w wodzie bakterie saprofityczne
Drobnoustroje chorobotwórcze przenoszone drogą wodną
Bakterie
Bezwzględnie chorobotwórcze:
G(- ) pałeczki z rodzaju Salmonella np. pałeczka duru brzusznego Salmonella typhi, duru rzekomego Salmonella paratyphi
G(-) pałeczki z rodzaju Shigella wywołujące czerwonkę bakteryjną
Przecinkowiec cholery Vibrio cholerae (Vibrio comma)
Prątki gruźlicy Mycobacterium tuberculosis
Krętki z rodzaju Leptospira wywołujące żółtaczkę bakteryjną
Oportunistyczne (wzlgędnie chorobotwórcze):
Z rodzaju Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, Flavobacterium, Enterobacter, Proteus
2. Wirusy
Np. wirus polio wywołujący porażenie dziecięce, enterowirusy wywołujące schorzenia jelit
3. Pierwotniaki
Np. Giardia lamblia wywołuje gardiozę. Entamoeba histolytica wywołuje amebozę itd.
Większość pierwotniaków produkuje cysty, które nie są w stanie przetrwać poza organizmem gospodarza w niekorzystnych warunkach środowiskowych. Gdy warunki te ulegają poprawie z cyst rozwijają się tzw. trofozoity, postacie wegetatywne występujące u człowieka.
4. Robaki pasożytnicze
Np. glista ludzka, tasiemce, przywry. Pasożyty ludzkie w zasadzie nie wchodzą w zakres badań mikrobiologicznych, jednakże z innymi patogenami stanowią poważne zagrożenie zdrowia człowieka. Infekcyjną postacią robaków pasożytniczych są jaja. Są one bardzo odporne na działanie czynników zewnętrznych oraz trudno je wyeliminować ze ścieków przez chlorowanie.
Bakterie chorobotwórcze występujące w wodzie
woda jest jedynie przenośnikiem bakterii i to tylko w okresie, w jakim organizmy te mogą w wodzie utrzymywać się przy życiu
w Europie najczęściej występującym czynnikiem etiologicznym zakażeń drogą wodną są pałeczki duru brzusznego Salmonella typhi oraz pałeczki wywołujące czerwonkę Shigella
Doniesienia ostatnich lat sugerują, że coraz częstszą przyczyną tzn. epidemii wodnych w Europie Zachodniej i Skandynawii są bakterie z rodzaju Yersinia i Campylobacter
Zachorowania mogą być przenoszone drogą oralną, przez picie nieuzdatnionej wody, ale również wody, ale również na skutek kąpieli w wodzie zanieczyszczonej odchodami
Testy do szybkiego wykrywania bakterii z grupy coli i Escherichia coli w wodzie- Readycoult Coliform
Do oznaczania pałeczek z gr coli i E.coli stosowane jest podłoże z substratem chromogennym X-Gal oraz fluorogennym MUG i tryptofanem
pałeczki z gr coli mają zdolność do rozkładu substratu X-Gal przez enzym galaktozydazę- po inkubacji zmiana barwy badanej próbki wody na niebieskozieloną
E.coli dzięki glukuronidazie rozkłada substrat MUG, czego efektem jest fluorescencja w świetle UV
Ponadto rozkłada tryptofan z wydzieleniem indolu, który po dodaniu czynnika Kovaćsa wykrywany jest w postaci czerwonej obrączki na powierzchni
Testy do szybkiego wykrywania bakterii grupy coli i E.coli oraz enterokoków w wodzie- Readycoult Coliform i Readycoult Enterococci
metoda jest bardzo prosta
pożywka w postaci granulatu zapakowana jest w gotowych do użycia kapsułkach
oznaczenie polega na dodaniu zawartości kapsułki do kolbki z badaną wodą o określonej objętości (100cm3) i wstawieniu do inkubacji w temp. 35-37oC/18-24h
Testy do szybkiego wykrywania enterokoków w wodzie - Readycoult Enterococci
do oznaczania obecności paciorkowców kałowych z rodzaju Enterococcus stosowane jest podłoże z azydkiem sodu i substratem chromogennym X-GLU
o obecności paciorkowców w badanej wodzie świadczy zmiana zabarwienia próbki na niebieskozieloną na skutek rozkładu X-GLU przez enzym glikozydazę
Alternatywne metody wykrywania wskaźników bezpieczeństwa żywności
W ostatnich latach dokonano znacznego postępu w zakresie metod wykrywania Listeria monocytogenes, Salmonella sp. i enerotoksyn gronkowcowych w żywności
obecnie oprócz tradycyjnych metod hodowlanych występują szybkie metody alternatywne pozwalające wyraźnie skrócić czas analizy:
Tecra Unique Salmonella, Tecra Unique Listeria, Tecra Unique Staphylococcal Enterotoxin-testy służą do szybkiego wykrywania patogenów in vitro.
Test zawiera zestawy probówek z odczynnikami, które są gotowe do użycia
Zasada testu opiera się na reakcji immunoenzymatycznej
jednoznaczny pozytywny lub negatywny wynik uzyskuje się po 22 godzinach
API Listeria, API 20E (do wykrywania pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, m.in. Salmonellasp.)
API- biochemiczny szereg identyfikacyjny, na który składają się mikroprobówki zawierające odwodnione substraty
do każdej mikroprobówki wprowadza się zawiesinę bakteryjną, która rozpuszcza substrat
reakcje biochemiczne zachodzące w czasie inkubacji powodują zamiany zabarwienia, powstałe samoistnie lub po dodaniu odczynnika wskaźnikowego
odczytu wyników dokonuje się w oparciu o program komputerowy Api Web Plus
Vidas- testy Vidas służą do wykrywania antygenów na zasadzie immunoenzymatycznej z ostatecznnym odczytem fluorescencyjnym, przeprowadzonym przy użyciu immunoanalizatora VIDAS
wszystkie etapy reakcji przebiegają automatycznie w immunoanalizatorze Vidas
po zakończeniu analizy wyniki podlegają automatycznej analizie przez komputer. Wyliczana jest wartość testu i drukowany jest wynik dla każdej próbki
test pozwala na wykrywanie w żywności Listeria monocytogenes(LMO), Salmonella sp (SLM), enterotoksyn gronkowcowych (SET)
PCR-technika PCR polega na selektywnym powielaniu (amplifikaji) fragmentów DNA w warunkach in vitro.
Testy PCR są bardzo czułe i pozwalają na wykrywanie nawet śladowych ilości DNA
wysoka czułość, szybkość oraz możliwość zastosowania reakcji PCR do wykrywania i identyfikacji patogenów bez wcześniejszej ich izolacji z badanego materiału
POWIETRZE
Drobnoustroje występujące w powietrzu
Gleba i woda- podstawowe naturalne środowiska bytowania drobnoustrojów
Powietrze- środowisko wtórne, drobnoustroje nie namnażają się w nim, przebywają przejściowo
Mikroflora powietrza
Drobnoustroje w powietrzu rzadko występują w postaci wolnej, zwykle jako bioaerozole
Bioaerozol to układ dwu- lub trójfazowy, składający się z fazy rozpraszającej (powietrza) i rozproszonej (drobne cząsteczki płynu lub substancji stałych zawierające pyłki roślin, zarodniki grzybów, komórki bakterii, drożdży i wirusy)
drobnoustroje przyczepione do cząstek kurzu i pyłu lub mikrokropelek płynów, mogą przebywać w powietrzu bardzo długo.
Liczba zarodników pleśni i komórek bakterii w powietrzu atmosferycznym zależy od sezonu, warunków pogodowych, wysokości nad poziomem morza.
Oznaczanie stopnia skażenia powietrza
Analiza powietrza prowadzona jest w oparciu o obecność tzw. wskaźników bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza.
Są to gatunki lub rodzaje wytypowane jako przedstawiciele mikroflory pochodzącej z określonych zanieczyszczeń- gleby, wód powierzchniowych, od ludzi i zwierząt.
Wskaźniki bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza:
z układu oddechowego człowieka- gronkowce i paciorkowce hemolizujące Staphylococcus sp., Streptococcus salivarius, Streptococcus viridans
cząstkami gleby- promieniowce
cząstkami wód powierzchniowych - Pseudomonas fluorescens
Poznanie mikroflory powietrza umożliwia:
określenie warunków higienicznych panujących w zakładach przemysłu spożywczego
określenie mechanizmów zanieczyszczenia i psucia się produktów spożywczych
powietrze może stać się źródłem zanieczyszczenia produktu a także stanowi przenośnik mikroorganizmów
powietrze nie jest środowiskiem odpowiednim dla życia drobnoustrojów
w odróżnieniu od gleby i wody, powiettrze jest ośrodkiem okresowego przebywania mikroorganizmów w którym nie mogą się one namnażać, lecz zachowują swój potencjał infekcyjny
Najczęściej spotykana mikroflora powietrza to ziarniaki:
Micrococcus sp.
Sarcina sp.
Staphylococcus sp
oraz
przetrwalniki bakterii(Bacillus)
zarodniki grzybów strzępkowych z rodzajów Alternaria, Penicillum, Cladosporium, Aspergillus, Mucor
promieniowce
drożdże z rodzajów Rhodotorula, Candida
bakterie chorobotwórcze rozprzestrzeniające się drogą kropelkową
Bakterie chorobotwórcze tj. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, a także paciorkowce z rodzaju Enterococcus i Streptococcus przedostają soę do powietrza z jamy nosowo- gardłowej, zakażonych ran czy bielizny szpitalnej
Ilość mikroflory powietrza jest zmienny i zależy od wielu czynników
W zakładach przemysłowych stopień zanieczyszczenia powietrza zależy od:
stanu sanitarnego pomieszczeń produkcyjnych, sprzętów,
higieny osobistej personelu
rodzaaju i stanu mikrobiologicznego surowców, półproduktów i produktów
umaszynowienia
rodzaju technologii
Zasadniczo wyróżnia się dwie grupy metod pobierania prób oparte na
osiadaniu zawiesin drobnoustrojów
filtracji powietrza przez filtry
Metoda sedymentacyjna Kocha
Najczęściej stosowana metoda badawcza badania stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza
Oparta jest na swobodnym osiadaniu pod wpływem grawitacji pyłków i kropelek niosących mikroorganizmy
pobranie próby polega na otwarciu przez ściśle określony czas płytki Petriego z pożywką
wynik ostateczny tj ilość drobnoutrojów w 1m3 powietrza oblicza się ze wzoru Omeliańskiego
L=Ax100x100/Pxk
Gdzie
L- ilość drobnoustrojów (jtk/m3)
A- średnia ilość kolonii na płytkach Petriego
P- powierzchnia płytki(cm2)
k- współczynnik zależny od czasu ekspozycji k=1 dla 5 minut, k=2 dla 10 min
k=3 dla 15 min
Metody zderzeniowe
Wyróżniamy w nich 2 sposoby przepuszczania powietrza tzn wirowanie powietrza wciąganego przez przyrząd ( mikroorganizmy osadzają się na cylindrze) lub zderzanie strumienia zasysanego powietrza z pożywką
W metodzie zderzeniowej stosuje się wymuszone osiadanie drobnoustrojów na powierzchni podłoża hodowlanego za pomocą aparatu, który zasysa określoną objętość powietrza .
Pozwala to na dokładne przeliczenie drobnoustrojów przypadających na określoną objętość powietrza
Polegają na przepuszecniu określonej objętości powietrza przez odpowiedni jałowy filtr. Po przefiltrowaniu powietrza wypłukuje się zatrzymane drobnoustroje ze stałego materiału filtracyjnego znaną objętością cieczy, która następnie posiewa się na pożywki stałe.
Powietrze- wymagania mikrobiologiczne
|
Pomieszczenia produkcyjne przemysłu spożywczego |
Sale wykładowe i sale ćwiczeń |
Liczba bakterii tlenowych |
500-600 jtk/m3 |
Nie więcej niż 2000 jtk/m3 |
Liczba grzybów |
0-50 jtk/m3 |
Nie więcej niż 2000 jtk/m3 |
Dezynfekcja i wyjaławianie powietrza może być prowadzona następującymi metodami
mechaniczne- filtrowanie przez filtry włókniste bawełniane, z włókien szklanych lub przez roztwory kwasów i ługów
fizyczne- ogrzrwanie powietrza poprzez sprężanie go do wysokich ciśnień, odpylanie elektrostatyczne oraz z zastosowaniem promieniowania UV, promieniowania jonizującego lub ultradźwięków
chemiczne- stosowanie substancji bakteriobójczych, w tym preparatów na bazie kwasu nadoctowego, nadtlenku wodoru, podchlorynu sodu, kwasu mlekowego, glikolu propylenowego i jego pochodnych
CZYSTOŚĆ POWIERZCHNI
Powierzchnie produkcyjne, tj powierzchnie taśm produkcyjnych, urządzeń, drobny sprzęt, będąc w bezpośrednim kontakcie z surowcem czy produktem mogą być źródlem ich zanieczyszczen, a w konsekwencji powodować wady żywności.
Nawet dobrze umyte i właściwie zdezynfekowane powierzchnie nie są jałowe- pozostają na nich głównie nieliczne przetrwalniki oraz bakterie psychrotrofowe
mikrobiologiczne badanie czystości linii produkcyjnych i powierzchni zawsze należy poprzedzić wizualną kontrolą.
Nie przeprowadza się badań mikrobiologicznych w przypadku wyraźnie brudnych powierzchni
Próbki należy pobierać za pomocą jałowych wymazówek, tamponów z gazy lub też przy użyciu płytek odciskowych
Analizę mikrobiologiczną należy przeprowadzić nie później niż po 24h od momentu pobrania próbki do badań
Badanie czystości powierzchni metodą szablonową
Metoda stosowana do określenia czystości takich powierzchni jak stoły, urządzenia o dużej powierzchni, tanki, deski do krojenia itd.
do wykonania oznaczenia potrzebne są jałowe tampony, szablon o powierzchni 20cm2, kolbka z 20cm3 jałowego płynu płuczącego,
szablon wyjaławia się w alkoholu i przykłada do badanej powierzchni
tampon moczy się w płynie i wyciera powierzchnię ograniczoną szablonem
tampon wrzuca się z powrotem do kolbki z płynem i wytrząsa
Jeżeli powierzchnia była wcześniej dezynfekowana, do płynu płuczącego należy dodać roztwór neutralizatora
Liczba bakterii tlenowych
posiew wgłębny po 1cm3 popłuczyn do sterylnej płytki Petriego
zalać upłynnionym agarem odżywczym
inkubacja w temp. 30oC/ 72h
po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie i przeliczyć na 1 cm3 badanej powierzchni
N3=NxFxD/ A
gdzie
N- liczba jtk w 1cm3 rozcieńczalnika (płynu płuczącego)
F- ilość rozcieńczalnika w cm 3
A- badana powierzchnia w cm2
D- odwrotność stosowanego w posiewach rozcieńczenia
Badanie czystości powierzchni metodą wymazów z powierzchni nie ograniczonej szablonem
Metodę stosuję się dla powierzchni trudno dostępnych, wilgotnych, zakrzywionych, małych (<5,5cm)
wymazy z powierzchni nie określają liczby bakterii na 1 cm2, lecz na całej badanej powierzchni
w tej metodzie szczególnie ważne jest właściwe obranie próby celem zapewnienia powtarzalności wyników( zaleca się by wymazy pobierane były z określonych miejsc)
Wykonanie
próbę pobiera się wymazówką zamoczoną wcześniej w jałowym roztworze soli fizjologicznej, dotykając powierzchnię badaną z każdej strony
wymazówkę wkłada się do żelu transportowego, a następnie przeprowadza się analizę ( po uzyskaniu popłuczyn)
Liczba bakterii tlenowych
posiew wgłębny po 1cm3 popłuczyn do sterylnej płytki Petriego
zalać upłynnionym agarem odżywczym
inkubacja w temp. 30oC/ 72h
po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie i podać liczbę jednostek tworzących kolonie w przeliczeniu na całą badaną powierzchnię (Nrw), korzystając ze wzoru
Nrw = NxFxD, gdzie
N- liczba kolonii z posiewu 1cm3 płynu płuczącego
F-objętość płynu płuczącego
D- odwrotność stosowanego w posiewach rozcieńczenia
Badanie czystości powierzchni z zastosowaniem płytek kontaktowych (Count-Tact)
Metodę stosuje się do powierzchni płaskich i suchych >5,5cm2, tj jak powierzchnie ścian, podłóg, sprzętu lub ubrań
oznaczenie wykonuje się specjalnymi płytkami kontaktowymi z podłożem agarowym o wypukłym menisku, który pozwala na pobranie materiału
Wykonanie
zdjąć pokrywkę płytki, przyłożyć podłoże bezpośrednio do badanej powierzchni
na płytkę nałożyć przykrywkę
inkubować, po inkubacji zliczyć wyrosłe na powierzchni podłoza kolonie (przeliczając na 1 cm2)
Badanie czystości powierzchni z zastosowaniem barwnych pasków testowych HY-RISE
Test pozwala ocenić zanieczyszczenie powierzchni materiałem organicznym, np. resztkami produktów pozostałych po myciu
Metoda opiera się na oznaczaniu dinukleotydu nikotynoadeninowego ( NAD, NADH) lub fosforanu dinukleotydu nikotynoadeninowego( NAPD, NADPH) jako wskaźników obecności resztek poprodukcyjnych.
Zasada testu opiera się na reakcji enzymatycznej, której efektem jest powstanie różowo- purpurowego do fioletowego zabarwienia po 4-5 minutach.
Materiał pobiera się w 10 punktach badanej powierzchni lub przez przeciągnięcie paska testowego przez długość ok 30cm
Test bardzo dobrze sprawdza się w ocenie po myciu powierzchni posiadających kontakt z żywnością i rękami np. powierzchnie robocze, noże, deski do krojenia, mikrofalówki
Może być także stosowany do badania czystości rąk pracowników
CZYSTOŚĆ OPAKOWAŃ
Opakowanie poza funkcją reklamową reklamową spełniają przede wszystkim rolę ochronną przed zanieczyszczeniem produktu
Niestety najczęściej opakowania nie są produkowane lub magazynowane w środowisku aseptycznym, a te wielokrotnego zastosowania nie zawsze są pozbawione mikroorganizmów
Stopień skażenia opakowań, szczególnie bezpośrednich ma wpływ na jakość produktów
Skażone opakowania wnoszą do produktu mikroflorę, której część może powodować zepsucia.
W celu usunięcia mikroorganizmów opakowania poddawane są myciu
efekt mycia określa się porównując stopień skażenia opakowania przed myciem(A) ze skażeniem po myciu (B)
Efekt dezynfekcyjny oblicz się ze wzoru
y = 100-B/Ax 100%
Dobrze wykonane mycie usuwa z powierzchni opakowania 99,99% drobnoustrojów
Metoda popłuczyn
Stosuje się ją do określania mikroflory małych opakowań szkalnych lub metalowych, tj. butelki, słoje, puszki itp.
Do naczynia wlewa się płyn Ringera w ilości 1/20 objętości naczynia, a następnie po zamknięciu wytrząsa
Z popłuczyn robi się posiewy (rozcieńczenia)
(naczynia myte do 10-2, a nie myte do 10-4).
Rodzaj użytego do hodowli podłoża zależy od opakowania
do opakowań konserw warzywnych i warzywno- mięsnych używa się agaru odżywczego z glukozą
do opakowań produktów mięsnych i ryb - agar odżywczy
do produktów mleczarskich - agar bulionowy z mlekiem i laktozą
płytki z agarem odżywczym inkubuje się w temp 37oC przez 48h
po inkubacji liczy się kolonie i oblicza stopień skazenia powierzchni, podając liczbę komórek na 1 cm2 powierzchni
W prawidłowo umytych opakowaniach nie powinno być więcej niż 10 komórek na 1 cm2 .
Metoda bezpośrednia (Richtera)
polega na hodowli drobnoustrojów na badanej powierzchni
Metodę tą stosuje się do oznaczania skażenia butelek do mleka
do butelki wlewa się 15 ml podłoża bulionowego z mlekiem i laktozą z dodatkiem 3% agaru
Butelkę obraca się tak aby podłoże rozprowadzić po całej powierzchni wewnętrznej butelki
Inkubację prowadzi się przez 4 dni w temp. 20oC
wynik podaje się w jtk/cm2 powierzchni opakowania
Metoda tamponowa
Stosuje się ja do badania skażeń dużych powierzchni opakowań i przedmiotów, tj. beczki, kadzie fermentacyjne, skrzynki, kontenery, stoły i urządzenia produkcyjne
tampony przygotowuje się z gazy pociętej na kwadraty o boku 5 cm i sterylizuje w suszarce w 160oC
dodatkowo sporządza się metalowy szblon w postaci kwadratu o znanej powierzchni
szablon wyjaławia się w alkoholu, opala w płomieniu i przykłada do badanej powierzchni
tampon zanurza się w płynie Ringera i wyciera dokładnie powierzchnię ograniczoną szablonem
tampon wrzuca się do kolbki z płynem, wytrząsa 2 minuty a z otrzymanej zawiesiny wykonuje się rozcieńczenia i posiewa na płytki
CZYSTOŚĆ MIKROBIOLOGICZNA RĄK PRACOWNIKÓW
Kadra pracownicza mająca kontakt z żywnością zobowiązana jest do przestrzegania zasad czystości i higieny
Tam, gdzie wytwarzana jest żywność istotna część czynności wykonywana jest ręcznie, przez co istnieje duże neibezpieczeństwo zakażenia żywności
Częste mycie i dezynfekcja rąk ma duże znaczenie w zapobieganiu skażeniom żywności
skład ilościowy i jakościowy mikroorganizmów zanieczyszczających ręce pracowników można podzielić na mikroflorę przejściową oraz osobniczą(stałą)
W skład mikroflory przejściowej wchodzą najczęściej pałeczki grupy coli, paciorkowce kałowe i gronkowce koagulazoujemne, które s a usuwane podczas mycia rąk
mikroflora osobnicza ma charakter stały, najczęściej lokalizuje się w zagłebieniach skóry oraz zachyłkach gruczołów łojowych
W skład mikroflory osobniczej - stałej wchodza przede wszystkim gronkowce koagulazododatnie, Corynebacterium oraz beztlenowce- Propionibacterium, w miejscach wilgotnych pałeczki niefermentujące Actinobacter.
Na skórę rąk drobnoustroje dostają się ze środowiska zewnętrznego m.in. z wody, powietrza, ręczników lub urządzeń produkcyjnych
Skład ilościowy i jakościowy mikroorganizmów zanieczyszczających rece zależy głównie od:
rodzaju przetwarzanego surowca
etapy produkcyjnego
czystości powierzchni roboczych
higieny osobistej pracowników
Oznaczenia:
liczba bakterii tlenowych mezofilnych
obecność gronkowców koagulazododatnich
obecność pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae
Wymagania
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych |
Obecność gronkowców koagulazododatnich |
Obecność rodziny Enterobacteriaceae lub pałeczek gr coli |
Stopień czystości rąk |
poniżej 100 |
Nb |
nb |
Ręce czyste |
100-1000 |
nb |
nb |
Ręce dostatecznie czyste |
Powyżej 1000 |
nb |
nb |
Ręce brudne |
GLEBA
To powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej skały, przkształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe
W skład gleby wchodzą stałe cząstki mineralne i organiczne, powietrze i roztwór glebowy oraz bytujące w niej organizmy żywe- edafon
Proporcje poszczególnych składników w glebie utrzymują się mniej więcej na tym samym poziomie właściwym dla danej gleby
Charakterystyka mikroorganizmów glebowych
Wirusy
wirusy prowadzą wyłącznie pasożytniczy tryb życia - reprodukują się w komórkach bakterii, roślin, zwierząt i człowieka
w środowisku glebowym najważniejszą rolę odgrywają wirusy bakteryjne- bakteriofagi
bakteriofagi są jednym z elementów nisz ekologicznych ograniczających nadmierny rozwój bakterii
Rola fagów w środowisku glebowym polega na ich zdolności niszczenia niektórych populacji bakterii
Bakterie
Bakterie stanowią podstawową masę mikroorganizmów glebowych
większość bakteri glebowych odzznacza się właściwością przylagania (adhezji) do powierzchni cząstek mineralnych i koloidów glebowych
Środowiskiem specjalnie sprzyjajaącym rozwojowi bakterii są korzenie roślin i ich inne podziemne części
bakterie glebowe miżna podzielić na 2 grupy: takie, które występują w glebie zawsze, niezaleznie od jej rodzaju i żyzności (autochtoniczne) oraz takie, które rozwijają się w niej masowo po wprowadzeniu do gleby dużej ilości materii organicznej ( zymogeniczne)
Grzyby
są bezwzględnymi chemoorganotrofami
wchodzą w symbiotyczne zalezności z glonami, owadami, które formują grzybnię lub plechę
Do najpospolitszych grzybów glebowych należą rodzaje: Penicillum, Trichoderma, Fusarium, Rhizopus, Mucor
grzyby rozwijają się silnie w glebach kwaśnych i wpływają istotnie na zmiany odczynu gleby
Podział mikroflory glebowej ze względu na pochodzenie
Mikroflora autochtoniczna
Drobnoustroje autochtoniczne czerpią energię z rozkładu materii organicznej powodując jej mineralizację
Przedstawicielami tej grupy grupy są najczęściej tlenowe nieprzetrwalnikujące bakterie z rodzaju Arthrobacter oraz prątki z rodzaju Mycobacterium, promieniowce z rodzaju Streptomyces, Nocardia oraz bakterie śluzowe (Myxobacteriales)
Pospolite są także tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzju Bacillus i beztlenowce z rodzaju Clostridium
Mikroflora zymogeniczna
Drobnoutroje zymogeniczne wprowadzane są do gleb okresowo
pochodzą one z wprowadzanych do gleb ścieków, odpadów komunalnych i przemysłowych oraz z odpadów powstających w hodowli zwierząt
są to organizmy o dużych wymaganiach odżywvzych, których rozwój uzalezniony jest od dopływu świeżej, łatwo przyswajalnej materii organicznej
bakterie zymogeniczne bytujące w glebie to głównie gramujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae oraz z rodzaju Pseudomonas, Flavobacterium
w glebie zanieczyszczonej odchodami czy szczątkami zwierząt i roślin mogą występować drobnoustroje chorobotwórcze (patogenne)
Spośród bakterii szczególnie neibezpieczne dla człowieka są
pałeczki duru brzusznego z rodzaju Salmonella
pałeczki czerwonki- Shigella
beztlenowe laseczki wywołujące tężec- Clostridium tetani
zgorzel gazową- Clostridium perfringens
zatrucia pokarmowe- Clostridium botulinum
tlenowe laseczki wąglika- Bacillus anthracis
prątki- Mycobacterium tuberculosis
Liczba drobnoustrojów występujących w glebie zależy od
położenia terenu
rodzaju zakładów przemysłowych
ilości odpadów
temperatury
charakteru wiatrów
gęstości zaludnienia
rodzaju gleby
nawożenia
szaty roślinnej
pory roku
pory dnia
Ocena jakości gleby za pomocą analizy mikrobiologicznej
Analizę gleby stosuje się do oceny
metod unieszkodliwiania odpadów dostających się do gleby
stanu sanitarnego gleby przy planowaniu i budowie osiedli mieszkaniowych i obiektów przemysłu spożywczego oraz rekreacyjnych
ponadto uzyskane wyniki mogą być przydatne do wyjaśnienia dróg zakażenia i określenia czasu przeżywalności mikroorganizmów chorobotwórczych w glebie
Zakres analizy mikrobiologicznej gleby pod względem sanitarnym powienien obejmować:
Oznaczenie obecności bakterii chorobotwórczych z rodzaju Salmonella
Badania helmintologiczne polegające na określeniu liczby żywych jaj robaków jelitowych
glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides)
glisty psiej(Toxocara sp.)
włosogłówki (Trichuris trichiura)
określeniu stadium ich rozwoju oraz stopnia odporności na różne warunki mikroklimatyczne