Ćwiczenie 3.

Wrażliwość mikroorganizmów na antybiotyki

Zadanie 1.1. Oznaczanie wrażliwości mikroorganizmów na działanie antybiotyków.

Materiały: hodowla bakteryjna na podłożu płynnym, płytki z podłożem Mueller- Hintona, r-ry antybiotyków, sterylne krążki bibułowe

1. Wykonać posiew dywanowy (1 ml) hodowli na podłożu płynnym, rozcieńczonej do 10 ^-3 na 2 płytki z podłożem Mueller- Hintona, dokładnie rozprowadzić na powierzchni płytek. Nadmiar płynu odpipetować sterylną pipetą.

2. Na tak przygotowanych płytkach umieścić centralnie sterylny krążek bibułowy.

3. Przygotować odpowiednie stężenia 2 antybiotyków: 2; 6; 8; 10 mg/ml

4. Na każdą płytkę, na krążek (!) nanieść 10 μl odpowiedniego stężenia danego r-ru antybiotyku.

5. Płytki inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 dni.

6. Odczytać i zinterpretować wyniki.

Zadanie 1.3. Selekcja mutantów opornych na antybiotyki metodą płytek gradientowych Szybalskiego.

Materiały: bulionowa hodowla badanego szczepu, 2 probówki z rozgrzanym agarem odżywczym- 20ml, roztwór antybiotyku 20 j /ml

1. Ułożyć sterylną szalkę Petriego skośnie na stole (oprzeć na bagietce szklanej), wylać na płytkę agar odżywczy, poczekać aż zastygnie.

2. Do drugiej probówki z agarem dodać 1ml roztworu antybiotyku antybiotyku tak by otrzymać stężenie końcowe 1j / ml agaru.

3. Na tak przygotowaną płytkę wylać agar z antybiotykiem i zaczekać aż zastygnie - zaznaczyć strzałką na denku płytki kierunek wzrostu stężenia antybiotyku - w stronę grubszej warstwy agaru z antybiotykiem. Tak wylany roztwór antybiotyku tworzy gradient od 0.01 jedn. antyb./ml do 0.1 jedn./ml (wg wzoru poniżej)

4. Na podsuszone płytki nanieść kilka ez hodowli płynnej badanych mikroorganizmów - nanosić wzdłuż namalowanej strzałki (w jednym miejscu!) w kierunku wzrastającego stężenia antybiotyku, na zakończenie posiewu linia naniesienia powinna mieć szerokość około 1 cm, zostawić płytkę do inkubacji. Następnie obserwować typy stref wzrostu: czy jest to wzrost w postaci linii ciągłej czy w postaci pojedynczych kolonii, pozwala to określić przybliżone stężenie antybiotyku, na jakie jest wrażliwy dany szczep mikroorganizmów.

Zadanie 1.4. Wzajemne oddziaływanie substancji o charakterze antybiotycznym- zjawisko synergizmu.

Materiały: bulionowe hodowle badanych szczepów, zestalone podłoże Mueller- Hintona, r-ry sulfametoksazolu i trimetoprimu

1. Na płytkę z podłożem Mueller- Hintona nanieść 1 ml badanej hodowli bulionowej, dokładnie rozprowadzić za pomocą głaszczki po całej powierzchni płytki.

2. Nadmiar płynu odpipetować sterylną pipetą. Płytki pozostawić na około 10 min.

3. Przygotować odpowiednie rozcieńczenia badanych substancji: sulfametoksazol- 750, 500 i 100 μg / ml oraz trimetoprim 7.5, 5, 2.5 μg / ml.

4. Na, wcześniej przygotowanych, płytkach umieścić paski bibuły filtracyjnej i nasycić je odpowiednimi stężeniami sulfametoksazolu i trimetoprimu.

5. Płytki inkubować w temperaturze pokojowej.

Sulfametoksazol (μg / ml)

Mikrobiologia przemysłowa

750

500

100

7.5

255

2.5

Trimetoprim (μg / ml)

---