Slajd 1
Przez lata naukowcy interesowali się wyłącznie genami, ponieważ to geny kodują sekwencję aminokwasową białek ( strukturę 1- rzędową). Z czasem okazało się, że pewne białka mogą odgrywać istotną rolę w modyfikowaniu ekspresji genów na poziomie dostępności DNA dla maszynerii transkrypcyjnej. Stwierdzenie, że ekspresja genów nie jest determinowana wyłącznie przez sam kod genetyczny zapisany w DNA, zapoczątkowało rozwój nowego kierunku w biologii molekularnej- epigenatyki.
Epigenatyka zajmuje się badaniem zmian w ekspresji genów, które wynikają nie ze zmian w nukleotydowej sekwencji DNA (mutacji), ale są efektem przebudowy struktury DNA na danym obszarze, i co za tym idzie, zmian w dostępności poszczególnych genów dla procesu transkrypcji. Te zmiany struktury DNA są wynikiem poreplikacyjnej modyfikacji DNA i potranslacyjnej modyfikacji białek związanych z DNA. Ponieważ, w przeciwieństwie do mutacji, oba typy modyfikacji są odwracalne, mogą być potencjalnym celem działania różnych leków przywracających prawidłową ekspresję genów istotnych dla właściwego funkcjonowania komórek. Zmiany we wzorze epigenotypu, wynikające, np. z metyzacji DNA, czy modyfikacji histonów, podobnie jak zmiany w nukleotydowej sekwencji DNA, mogą prowadzić do wyciszenia genów zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego, apoptozę, czy naprawę DNA.
Do zjawisk epigenetycznych zaliczamy :
Metylację DNA
Kowalencyjne modyfikacje histonów
Przebudowę chromatyny
Slajd 2
Rola zjawisk epigenetycznych:
W stanie normy mechanizmy te są wykorzystywane w komórce do wyciszania licznych sekwencji powtórzonych (m.in. w centromerach i telomerach).
Wyciszanie genów znajdujących się na nieaktywnym chromosomie X (tzw. Ciałko Barra- jeden z pary chromosomów X w komórkach samic ssaków).
Piętnowanie rodzicielskie. (polega na różnym stopniu metylacji genów w komórkach jajowych i komórkach plemnikowych. Gen jest metylowany na allelu pochodzącym od jednego z rodziców. Nakładanie imprintingu zachodzi w czasie gametogenezy. Wtedy jest znoszony wzór metylacji odziedziczony po rodzicach i nakładany nowy, zależny od płci. Do zmetylowanego nukleotydu nie mogą się przyczepić czynniki transkrypcyjne, co powoduje wyciszenie genu.)
Rozróżnienie nici DNA podczas naprawy błędnie sparowanych zasad.
Obrona przed ekspresją obcego DNA, co może być też jedną z przeszkód skutecznej terapii genowej.
W genach niezbędnych do utrzymania podstawowego metabolizmu komórkowego, których ekspresja nie podlega regulacji, metyzacja nie zachodzi. Natomiast, w przypadku genów, których ekspresja jest tkankowo specyficzna , metyzacja zachodzi, z wyjątkiem komórek tej tkanki, dla której produkt danego genu jest charakterystyczny.
Slajd 3
Białka zaangażowane w procesy epigenetyczne:
Wprowadzające modyfikacje- metylotransferazy DNA- DNMT, acetylotransferazy histonów-HAT, HMT ( metylotransferazy histonów)
U kręgowców zidentyfikowano do tej pory 5 aktywnych enzymów DNMT- DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L- charakteryzują się obecnością regionów odpowiedzialnych za transfer grupy CH3- z S- adenozyno metioniny na cytozynę di nukleotydu CpG oraz występowanie domeny TRD, umożliwiającej rozpoznawanie specyficznych sekwencji DNA.
Ze względu na sposób metyzacji DNA enzymy DNMT można podzielić na dwie grupy. Do pierwszej należy DNMT 1 odpowiedzialny za metyzację zachowawczą, polegającą na przyłączeniu grupy CH3- do nowo zsyntezowanej nici DNA w miejscu komplementarnym do miejsc metylowanych na nici matczynej. Druga grupa to enzymy DNMT 3a i 3b odgrywające kluczową rolę w metyzacji de novo, czyli przyłączeniu grup metylowych do di nukleotydów CpG w zupełnie nowych miejscach. Ten typ metyzacji powoduje zatem zmianę wzoru metyzacji konkretnych fragmentów genomu i występuje przed wszystkim we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego. DNMT 3L „działa” również de novo z tym, że jest odpowiedzialny za występowanie matczynego piętnowania genowego. Funkcja DNMT2 nie jest do końca wyjaśniona. Prawdopodobnie jest odpowiedzialny za etylowanie tRNA, a nie DNA. Metylotransferazy DNA są więc zaangażowane w proces piętnowania genomowego oraz w regulację transkrypcji genów. Tym samym wywierają istotny wpływ na procesy embriogenezy oraz różnicowanie się komórek.
Rozpoznające modyfikacje MBP HP1
Usuwające modyfikacje- HDAC deacetylaza histonów
Slajd 4
Metylacja cytozyny polega na kowalencyjnym wiązaniu grupy metylowej do węgla w pozycji 5 pierścienia pirymidynowego i jest katalizowana przez enzym z grupy DNMT. Miejsce metylacji nie jest przypadkowe , dotyczy tylko cytozyny wchodzącej w skład sekwencji 5’-CG-3’ (rzadziej 5’-CA-3’ lub 5’-CT-3’)., czyli dinukleotydów CpG pojedynczo rozrzuconych po całym genomie. W obrębie tzw. Wysp CpG, czyli dłuższych obszarów DNA (minimum 500 kpz) o zwiększonej w porównaniu z całym genomem procentowej zawartości CpG (powyżej 55 %), które występują w obrębie sekwencji promotorowej około 60 % genów ulegających stałej ekspresji, reszty cytozyny pozostają niezmetylowane, niezależnie od stanu ekspresji. W komórkach rakowych hypermatylacja reszt CpG, prowadzi do zakłócenia czynności wielu genów.
Slajd 5
DNMT 1 odpowiedzialny za metyzację zachowawczą, polegającą na przyłączeniu grupy CH3- do nowo zsyntezowanej nici DNA w miejscu komplementarnym do miejsc metylowanych na nici matczynej.
„Metylazy utrzymujące”
Slajd 6
Metylacja DNA wpływa na interakcję białko- DNA, prowadząc do zmiany w strukturze chromatyny oraz dostępności DNA dla czynników i maszynerii transkrypcyjnej. Tym samym przyczynia się do spadku lub wzrostu tempa transkrypcji w zależności od tego jakie, pozytywne czy negatywne, elementy regulatorowe genów są w ten proces zaangażowane. Metylacja wysp CpG w promotorach genów jest rozpoznawana przez białka MBP (MBD1,2,3, MECP2 oraz Kaiso). Białka te zawierają na N- końcu domenę MBD, a w części środkowej domenę TRD. Po rozpoznaniu zmetylowanego DNA białka MBP mogą aktywować enzym deacetylazę histonów HDAC i/lub kompresory transkrypcji, co prowadzi do silnej kondensacji chromatyny i blokowania sekwencji promotora danego genu, uniemożliwiając dostęp czynnikom transkrypcyjnym. Odkrycie białek wiążących się do metylowanych sekwencji CpG i mobilizujących w tych regionach deacetylazy histonów miało wielkie znaczenie poznaniu roli metyzacji Dna. Co więcej okazało się, że procesy metylacji DNA i deacetylacji histonów są prawdopodobnie silnie powiązane w generowaniu struktury nieaktywnej transkrypcyjnie chromatyny.