1

Metylacja

Metylacja

DNA oraz ekspansja

DNA oraz ekspansja

tr

tr

ó

ó

jnukleotydowa

jnukleotydowa

dr hab. Ewa Balcerczak

dr hab. Ewa Balcerczak

W biochemii

W biochemii metylacja

odnosi si

odnosi si

ę

ę

do zamiany

do zamiany

atomu wodoru na grup

atomu wodoru na grup

ę

ę

metylow

metylow

ą

ą

.

.

Metylacja

Metylacja

DNA jest typem modyfikacji DNA,

DNA jest typem modyfikacji DNA,

kt

kt

ó

ó

ra mo

ra mo

ż

ż

e zosta

e zosta

ć

ć

odziedziczona i p

odziedziczona i p

ó

ó

ź

ź

niej

niej

usuni

usuni

ę

ę

ta bez zmiany oryginalnej sekwencji DNA.

ta bez zmiany oryginalnej sekwencji DNA.

Zosta

Zosta

ł

ł

o udowodnione,

o udowodnione,

ż

ż

e

e

metylacja

metylacja

DNA

DNA

wyst

wyst

ę

ę

puje w wielu istotnych biologicznych

puje w wielu istotnych biologicznych

procesach, takich jak regulacja

procesach, takich jak regulacja

imprintingu

imprintingu

rodzicielskiego,

rodzicielskiego,

unieczynnienie

unieczynnienie

chromosomu X

chromosomu X

czy rozw

czy rozw

ó

ó

j nowotwor

j nowotwor

ó

ó

w.

w.





Metylacja

Metylacja

jest

jest

poreplikacyjn

poreplikacyjn

ą

ą

enzymatyczn

enzymatyczn

ą

ą

modyfikacj

modyfikacj

ą

ą

DNA.

DNA.





Proces ten nale

Proces ten nale

ż

ż

y do zmian epigenetycznych,

y do zmian epigenetycznych,

kt

kt

ó

ó

re w odr

re w odr

ó

ó

ż

ż

nieniu od genetycznych nie

nieniu od genetycznych nie

zale

zale

żą

żą

od sekwencji DNA i polegaj

od sekwencji DNA i polegaj

ą

ą

na zmianie

na zmianie

funkcji lub ekspresji genu.

funkcji lub ekspresji genu.





S

S

ą

ą

to zmiany odwracalne. Opr

to zmiany odwracalne. Opr

ó

ó

cz

cz

metylacji

metylacji

do

do

tych zmian nale

tych zmian nale

ż

ż

y zmiana struktury

y zmiana struktury

chromatyny spowodowana modyfikacj

chromatyny spowodowana modyfikacj

ą

ą

bia

bia

ł

ł

ek

ek

histonowych

histonowych

.

.





Metylacja

Metylacja

to proces kowalencyjnego przy

to proces kowalencyjnego przy

łą

łą

czania grup

czania grup

metylowych do zasad azotowych nukleotyd

metylowych do zasad azotowych nukleotyd

ó

ó

w.

w.





W procesie tym uczestnicz

W procesie tym uczestnicz

ą

ą

enzymy przenosz

enzymy przenosz

ą

ą

ce

ce

grupy metylowe (

grupy metylowe (

metylotransferazy

metylotransferazy

).

).





Najcz

Najcz

ęś

ęś

ciej produktami

ciej produktami

metylacji

metylacji

s

s

ą

ą

:

:

C5

C5

-

-

metylocytozyna

metylocytozyna

(m5C), N6

(m5C), N6

-

-

metyloadenina

metyloadenina

(m6A) i

(m6A) i

N4

N4

-

-

metylocytozyna

metylocytozyna

(m4C)

(m4C)

m4C wyst

m4C wyst

ę

ę

puje w obr

puje w obr

ę

ę

bie

bie

Procaryota

Procaryota

,

,

m5C u

m5C u

Procaryota

Procaryota

i

i

Eucaryota

Eucaryota

,

,

m6A u

m6A u

Procaryota

Procaryota

i zasadniczo u ni

i zasadniczo u ni

ż

ż

szych

szych

Eucaroyt

Eucaroyt

ó

ó

w

w

(bezkr

(bezkr

ę

ę

gowc

gowc

ó

ó

w)

w)

ROLA

ROLA

DNA

DNA

-

-

METYLOTRANSFERAZ

METYLOTRANSFERAZ

(DNMT) W PROCESIE METYLACJI

(DNMT) W PROCESIE METYLACJI





Enzymy te katalizuj

Enzymy te katalizuj

ą

ą

przy

przy

łą

łą

czenie si

czenie si

ę

ę

grup metylowych pochodz

grup metylowych pochodz

ą

ą

cych od donora

cych od donora

S

S

-

-

adenozylo

adenozylo

-

-

L

L

-

-

metioniny

metioniny

(

(

AdoMet

AdoMet

) do w

) do w

ę

ę

gla C5 w obr

gla C5 w obr

ę

ę

bie pier

bie pier

ś

ś

cienia

cienia

pirymidynowego cytozyny lub do grupy aminowej adeniny (N6) l ub c

pirymidynowego cytozyny lub do grupy aminowej adeniny (N6) l ub c

ytozyny (N4).

ytozyny (N4).





Produktami tych reakcji s

Produktami tych reakcji s

ą

ą

:

:

zmetylowany

zmetylowany

DNA i

DNA i

S

S

-

-

adenozylo

adenozylo

-

-

L

L

-

-

homocysteina

homocysteina

(

(

AdoHcy

AdoHcy

) .

) .





DNA

DNA

-

-

metylotransferazy

metylotransferazy

to rodzina enzym

to rodzina enzym

ó

ó

w, do kt

w, do kt

ó

ó

rych zalicza si

rych zalicza si

ę

ę

DNMT1,

DNMT1,

DNMT2, DNMT3A i DNMT3B oraz DN MT3L .

DNMT2, DNMT3A i DNMT3B oraz DN MT3L .





DNMT1 katalizuje 97

DNMT1 katalizuje 97

-

-

99,9% procesu

99,9% procesu

metylacji

metylacji

zachodz

zachodz

ą

ą

cego podczas mitozy.

cego podczas mitozy.

Enzym ten jest odpowiedzialny za przekazanie sta

Enzym ten jest odpowiedzialny za przekazanie sta

ł

ł

ego profilu

ego profilu

metylacji

metylacji

.

.

Rozpoznaje

Rozpoznaje

hemimetylowane

hemimetylowane

dinukleotydy

dinukleotydy

CpG

CpG

na matczynej i potomnej nici DNA

na matczynej i potomnej nici DNA

i przenosi grupy metylowe z

i przenosi grupy metylowe z

AdoMet

AdoMet

do

do

cytydyny

cytydyny

zlokalizowanej na

zlokalizowanej na

niezmetylowanej

niezmetylowanej

nici potomnej.

nici potomnej.





DNMT3A i 3B s

DNMT3A i 3B s

ą

ą

odpowiedzialne za

odpowiedzialne za

metylacj

metylacj

ę

ę

de

de

novo

novo

. Enzymy te s

. Enzymy te s

ą

ą

szczeg

szczeg

ó

ó

lnie

lnie

wa

wa

ż

ż

ne w rozwoju embrionalnym, kie dy to ustala si

ne w rozwoju embrionalnym, kie dy to ustala si

ę

ę

wz

wz

ó

ó

r

r

metylacji

metylacji

. Ich rola w

. Ich rola w

dojrza

dojrza

ł

ł

ych kom

ych kom

ó

ó

rkach jest nie do ko

rkach jest nie do ko

ń

ń

ca wyja

ca wyja

ś

ś

niona. Podejrzewa si

niona. Podejrzewa si

ę

ę

,

,

ż

ż

e DMNT3B

e DMNT3B

podtrzymuje

podtrzymuje

metylacj

metylacj

ę

ę

pericentrycznej

pericentrycznej

heterochromatyny. DNMT3L po

heterochromatyny. DNMT3L po

ś

ś

rednio

rednio

uczestniczy w procesie

uczestniczy w procesie

metylacji

metylacji

DNA. Nie ma w

DNA. Nie ma w

ł

ł

a

a

ś

ś

ciwo

ciwo

ś

ś

ci katalitycznych, ale

ci katalitycznych, ale

stymuluje aktywno

stymuluje aktywno

ść

ść

metylotransferaz

metylotransferaz

de

de

novo

novo

i zwi

i zwi

ę

ę

ksza ich powinowactwo do

ksza ich powinowactwo do

DNA.

DNA.

2

DINUKLEOTYDY I WYSPY CPG

DINUKLEOTYDY I WYSPY CPG





W genomie wyst

W genomie wyst

ę

ę

puj

puj

ą

ą

kr

kr

ó

ó

tkie (1000

tkie (1000

-

-

1500

1500

pz

pz

) odcinki DNA

) odcinki DNA

niezwykle bogate w

niezwykle bogate w

dinukleotydy

dinukleotydy

CpG

CpG

zwane wyspami

zwane wyspami

CpG

CpG





W genomie oko

W genomie oko

ł

ł

o 70

o 70

-

-

80%

80%

dinukleotyd

dinukleotyd

ó

ó

w

w

CpG

CpG

ma grup

ma grup

ę

ę

metylow

metylow

ą

ą

przy

przy

łą

łą

czon

czon

ą

ą

do cytozyny co sprawia, ze kodowane przez te

do cytozyny co sprawia, ze kodowane przez te

sekwencje geny

sekwencje geny

s

s

ą

ą

niedost

niedost

ę

ę

pne dla kom

pne dla kom

ó

ó

rkowych uk

rkowych uk

ł

ł

ad

ad

ó

ó

w

w

transkrypcyjnych

transkrypcyjnych

.

.





Chromatyna zawieraj

Chromatyna zawieraj

ą

ą

ca wyspy

ca wyspy

CpG

CpG

jest silnie

jest silnie

zacetylowana

zacetylowana

.

.

Tak

Tak

ą

ą

struktur

struktur

ę

ę

chromatyny nazywa si

chromatyny nazywa si

ę

ę

otwart

otwart

ą

ą

i mo

i mo

ż

ż

e by

e by

ć

ć

ona

ona

konsekwencj

konsekwencj

ą

ą

interakcji czynnik

interakcji czynnik

ó

ó

w

w

transkrypcyjnych

transkrypcyjnych

z genami

z genami

promotorowymi

promotorowymi

.

.





Oko

Oko

ł

ł

o po

o po

ł

ł

owa wszystkich ludzkich gen

owa wszystkich ludzkich gen

ó

ó

w zawiera

w zawiera

wyspy

wyspy

CpG

CpG

: s

: s

ą

ą

to tzw.

to tzw.

housekeeping

housekeeping

genes

genes

(niezb

(niezb

ę

ę

dne

dne

do funkcjonowania kom

do funkcjonowania kom

ó

ó

rki) i specyficzne tkankowe

rki) i specyficzne tkankowe

geny (ok. 40% wszystkich tkankowych gen

geny (ok. 40% wszystkich tkankowych gen

ó

ó

w)

w)





Wyspy

Wyspy

CpG

CpG

znajduj

znajduj

ą

ą

si

si

ę

ę

na ko

na ko

ń

ń

cu 5

cu 5

’

’

w regionach

w regionach

promotorowych

promotorowych

gen

gen

ó

ó

w maj

w maj

ą

ą

cych zasadnicze znaczenie

cych zasadnicze znaczenie

dla czynno

dla czynno

ś

ś

ci kom

ci kom

ó

ó

rki. Z regu

rki. Z regu

ł

ł

y s

y s

ą

ą

to geny

to geny

regulatorowe i nie ulegaj

regulatorowe i nie ulegaj

ą

ą

metylacji

metylacji

.

.





Brak

Brak

metylacji

metylacji

w regionach

w regionach

promotorowych

promotorowych

bywa

bywa

warunkiem wst

warunkiem wst

ę

ę

pnym dla kontrolowanej, aktywnej

pnym dla kontrolowanej, aktywnej

transkrypcji gen

transkrypcji gen

ó

ó

w.

w.





Metylacja

Metylacja

wysp

wysp

CpG

CpG

mo

mo

ż

ż

e skutkowa

e skutkowa

ć

ć

brakiem lub

brakiem lub

zaburzon

zaburzon

ą

ą

syntez

syntez

ą

ą

produkt

produkt

ó

ó

w tych gen

w tych gen

ó

ó

w.

w.

DINUKLEOTYDY I WYSPY C

DINUKLEOTYDY I WYSPY C

p

p

G

G

METYLACJA W TRAKCIE ROZWOJU

METYLACJA W TRAKCIE ROZWOJU

ORGANIZMU

ORGANIZMU





Najwi

Najwi

ę

ę

ksza cz

ksza cz

ęść

ęść

metylacji

metylacji

DNA zachodzi w

DNA zachodzi w

fazie S cyklu kom

fazie S cyklu kom

ó

ó

rkowego.

rkowego.





Wz

Wz

ó

ó

r

r

metylacji

metylacji

DNA jest charakterystyczny

DNA jest charakterystyczny

dla typu kom

dla typu kom

ó

ó

rki i podlega silnym zmianom

rki i podlega silnym zmianom

podczas rozwoju embrionalnego.

podczas rozwoju embrionalnego.





Metylacja

Metylacja

odgrywa znacz

odgrywa znacz

ą

ą

c

c

ą

ą

rol

rol

ę

ę

w regulacji

w regulacji

ekspresji gen

ekspresji gen

ó

ó

w podczas embriogenezy u

w podczas embriogenezy u

ssak

ssak

ó

ó

w i dalej podczas r

w i dalej podczas r

ó

ó

ż

ż

nicowania kom

nicowania kom

ó

ó

rek

rek

(myszy pozbawione genu

(myszy pozbawione genu

DNA

DNA

-

-

metylotransferazy

metylotransferazy

umieraj

umieraj

ą

ą

w ci

w ci

ą

ą

gu o

gu o

ś

ś

miu dni

miu dni

od zap

od zap

ł

ł

odnienia)

odnienia)





Metylacja

Metylacja

jest procesem dynamicznym: w zygocie niezw

jest procesem dynamicznym: w zygocie niezw

ł

ł

ocznie

ocznie

po zap

po zap

ł

ł

odnieniu nast

odnieniu nast

ę

ę

puj

puj

ą

ą

silne zmiany obejmuj

silne zmiany obejmuj

ą

ą

ce

ce

acetylacj

acetylacj

ę

ę

histon

histon

ó

ó

w i

w i

demetylacj

demetylacj

ę

ę

DNA. W stadium wczesnego

DNA. W stadium wczesnego

embrionu

embrionu

nast

nast

ę

ę

puje dramatyczna redukcja poziomu

puje dramatyczna redukcja poziomu

metylacji

metylacji

(tzw.

(tzw.

globalna

globalna

demetylacja

demetylacja

). Po implantacji nast

). Po implantacji nast

ę

ę

puje fala

puje fala

metylacji

metylacji

de

de

novo

novo

wi

wi

ę

ę

kszo

kszo

ś

ś

ci

ci

CpG

CpG





Tak dzieje si

Tak dzieje si

ę

ę

w przypadku genomu m

w przypadku genomu m

ę

ę

skiego, w genomie

skiego, w genomie

ż

ż

e

e

ń

ń

skim w tym czasie zachodzi pasywna

skim w tym czasie zachodzi pasywna

demetylacja

demetylacja

.

.





Podczas gastrulacji geny specyficzne tkankowo s

Podczas gastrulacji geny specyficzne tkankowo s

ą

ą

w

w

odpowiednich tkankach

odpowiednich tkankach

demetylowane

demetylowane

i ulegaj

i ulegaj

ą

ą

ekspresji, ale

ekspresji, ale

nale

nale

ż

ż

y podkre

y podkre

ś

ś

li

li

ć

ć

, ze wi

, ze wi

ę

ę

kszo

kszo

ść

ść

genomu pozostaje nadal

genomu pozostaje nadal

zmetylowana

zmetylowana

.

.





Kolejny etap intensywnej

Kolejny etap intensywnej

metylacji

metylacji

de

de

novo

novo

zale

zale

ż

ż

y od p

y od p

ł

ł

ci i

ci i

zachodzi podczas

zachodzi podczas

gametogenezy

gametogenezy

. Niewielki spadek

. Niewielki spadek

metylacji

metylacji

zaobserwowano w stadium

zaobserwowano w stadium

postembrionalnym

postembrionalnym

podobnie jak

podobnie jak

in

in

vitro

vitro

w starzej

w starzej

ą

ą

cych si

cych si

ę

ę

kom

kom

ó

ó

rkach

rkach

METYLACJA W TRAKCIE ROZWOJU

METYLACJA W TRAKCIE ROZWOJU

ORGANIZMU

ORGANIZMU

WP

WP

Ł

Ł

YW WIEKU NA POZIOM

YW WIEKU NA POZIOM

METYLACJI

METYLACJI





metylacja

metylacja

jest gatunkowo

jest gatunkowo

-

-

, tkankowo

, tkankowo

-

-

,

,

organellospecyficzna

organellospecyficzna

, lecz obserwuje si

, lecz obserwuje si

ę

ę

tak

tak

ż

ż

e zale

e zale

ż

ż

no

no

ść

ść

metylacji

metylacji

od wieku

od wieku





niekt

niekt

ó

ó

rzy naukowcy traktuj

rzy naukowcy traktuj

ą

ą

poziom

poziom

metylacji

metylacji

jako wska

jako wska

ź

ź

nik wieku lub narz

nik wieku lub narz

ę

ę

dzie do

dzie do

przewidywania d

przewidywania d

ł

ł

ugo

ugo

ś

ś

ci

ci

ż

ż

ycia. Nieprawid

ycia. Nieprawid

ł

ł

owa

owa

metylacja

metylacja

mo

mo

ż

ż

e prowadzi

e prowadzi

ć

ć

do przedwczesnego

do przedwczesnego

starzenia

starzenia

ZNACZENIE METYLACJI

ZNACZENIE METYLACJI

Metylacja

Metylacja

jest zwi

jest zwi

ą

ą

zana z nast

zana z nast

ę

ę

puj

puj

ą

ą

cymi

cymi

procesami:

procesami:





Imprinting

Imprinting

rodzicielski

rodzicielski





Inaktywacja chromosomu X w kom

Inaktywacja chromosomu X w kom

ó

ó

rkach

rkach

samic ssak

samic ssak

ó

ó

w

w

ł

ł

o

o

ż

ż

yskowych

yskowych





Regulacja ekspresji genu

Regulacja ekspresji genu





Modulacja struktury chromatyny

Modulacja struktury chromatyny

Zaburzenia metylacji są przyczyną chorób dziedzicznych, np.
zespołów Angelmana,Pradera- Williego, Beckwitha-Wiedemana,
a także transformacji nowotworowych ,
ICF (facial anomalies syndrome - zespół niedoboru odporności,
niestabilności centrometrów i anomalii twarzy),
syndromu Retta i zespołu łamliwego chromosomu X

3

Imprinting

Imprinting

rodzicielski

rodzicielski





Imprinting

Imprinting

rodzicielski, inaczej pi

rodzicielski, inaczej pi

ę

ę

tno

tno

genomowe

genomowe

lub pi

lub pi

ę

ę

tno

tno

rodzicielskie prowadzi do r

rodzicielskie prowadzi do r

ó

ó

ż

ż

nicowej ekspresji alleli niekt

nicowej ekspresji alleli niekt

ó

ó

rych

rych

gen

gen

ó

ó

w pochodz

w pochodz

ą

ą

cych od matki i od ojca.

cych od matki i od ojca.





Istnieje wiele gen

Istnieje wiele gen

ó

ó

w, kt

w, kt

ó

ó

rych ekspresja zale

rych ekspresja zale

ż

ż

y od tego, na

y od tego, na

kt

kt

ó

ó

rym

rym

allelu

allelu

–

–

pochodz

pochodz

ą

ą

cym od matki czy od ojca

cym od matki czy od ojca

-

-

si

si

ę

ę

znajduj

znajduj

ą

ą

.

.

Dwa allele

Dwa allele

imprintingowanych

imprintingowanych

gen

gen

ó

ó

w r

w r

ó

ó

ż

ż

ni

ni

ą

ą

si

si

ę

ę

stopniem

stopniem

metylacji

metylacji

DNA, struktur

DNA, struktur

ą

ą

chromatyny (modyfikacja histon

chromatyny (modyfikacja histon

ó

ó

w,

w,

nadwra

nadwra

ż

ż

liwo

liwo

ść

ść

na

na

nukleaz

nukleaz

ę

ę

) i czasem replikacji.

) i czasem replikacji.





Cech

Cech

ą

ą

imprintingu

imprintingu

jest dziedziczno

jest dziedziczno

ść

ść

podczas podzia

podczas podzia

ł

ł

ó

ó

w

w

kom

kom

ó

ó

rkowych i odwracalno

rkowych i odwracalno

ść

ść

podczas

podczas

gametogenezy

gametogenezy

.

.





Obecnie znanych jest ok. 30 ge n

Obecnie znanych jest ok. 30 ge n

ó

ó

w wyst

w wyst

ę

ę

puj

puj

ą

ą

cych u ludzi i u

cych u ludzi i u

myszy podlegaj

myszy podlegaj

ą

ą

cych

cych

imprintingowi

imprintingowi





Jednym z najlepszych modeli u

Jednym z najlepszych modeli u

ż

ż

ywanych do badania

ywanych do badania

procesu

procesu

imprintingu

imprintingu

jest system gen

jest system gen

ó

ó

w H19/IGF2.

w H19/IGF2.





H19 i IGF2 to 2 geny zlokalizowane w odleg

H19 i IGF2 to 2 geny zlokalizowane w odleg

ł

ł

o

o

ś

ś

ci oko

ci oko

ł

ł

o

o

90 par zasad. Gen H19 ulega transkrypcji tylko gdy

90 par zasad. Gen H19 ulega transkrypcji tylko gdy

jest zlokalizowany na chromosomie matczynym, za to

jest zlokalizowany na chromosomie matczynym, za to

IGF2 odwrotnie, tylko gdy znajduje si

IGF2 odwrotnie, tylko gdy znajduje si

ę

ę

na

na

chromosomie ojcowskim.

chromosomie ojcowskim.





Kluczow

Kluczow

ą

ą

rol

rol

ę

ę

w regulacji tych gen

w regulacji tych gen

ó

ó

w odgrywa odcinek

w odgrywa odcinek

z

z

ł

ł

o

o

ż

ż

ony z 2 tysi

ony z 2 tysi

ę

ę

cy par zasad DNA zlokalizowany tu

cy par zasad DNA zlokalizowany tu

ż

ż

przed regionem

przed regionem

promotorowym

promotorowym

genu H19.

genu H19.





Ten fragment nazywany jest

Ten fragment nazywany jest

DMR (

DMR (

Differentially

Differentially

Methylated

Methylated

Region),

Region),

poniewa

poniewa

ż

ż

jest silnie

jest silnie

zmetylowany

zmetylowany

na ojcowskim chromosomie, a

na ojcowskim chromosomie, a

niezmetylowany

niezmetylowany

na matczynym.

na matczynym.

Imprinting

Imprinting

rodzicielski

rodzicielski





Zgodnie z zasad

Zgodnie z zasad

ą

ą

dziedziczenia geny podlegaj

dziedziczenia geny podlegaj

ą

ą

ce

ce

ekspresji z ojcowskiego

ekspresji z ojcowskiego

allelu

allelu

stymuluj

stymuluj

ą

ą

wzrost i

wzrost i

r

r

ó

ó

ż

ż

nicowanie kom

nicowanie kom

ó

ó

rek, a geny z matczynego

rek, a geny z matczynego

allelu

allelu

maj

maj

ą

ą

dzia

dzia

ł

ł

anie przeciwne. Na przyk

anie przeciwne. Na przyk

ł

ł

ad: usuni

ad: usuni

ę

ę

cie

cie

gen

gen

ó

ó

w PEG1/MEST lub PEG3 z ojcowskiego

w PEG1/MEST lub PEG3 z ojcowskiego

chromosomu prowadzi do zaburzenia wzrostu.

chromosomu prowadzi do zaburzenia wzrostu.

Usuni

Usuni

ę

ę

cie genu H19 powoduje nadmierny rozrost

cie genu H19 powoduje nadmierny rozrost

p

p

ł

ł

odu.

odu.





Prawid

Prawid

ł

ł

owa ekspresja gen

owa ekspresja gen

ó

ó

w podlegaj

w podlegaj

ą

ą

cych

cych

imprintingowi

imprintingowi

jest bardzo wa

jest bardzo wa

ż

ż

na w ontogenezie. Ka

na w ontogenezie. Ka

ż

ż

da

da

nieprawid

nieprawid

ł

ł

owo

owo

ść

ść

mo

mo

ż

ż

e powodowa

e powodowa

ć

ć

nowotwory lub takie

nowotwory lub takie

genetyczne zaburzenia, jak zespo

genetyczne zaburzenia, jak zespo

ł

ł

y

y

Prader

Prader

-

-

Willy

Willy

’

’

ego

ego

,

,

Angelmana

Angelmana

i

i

Bechwith

Bechwith

-

-

Wiedemann

Wiedemann

’

’

a

a

Imprinting

Imprinting

rodzicielski

rodzicielski

Inaktywacja chromosomu X w

Inaktywacja chromosomu X w

kom

kom

ó

ó

rkach samic ssak

rkach samic ssak

ó

ó

w

w

ł

ł

o

o

ż

ż

yskowych

yskowych





Samice ssak

Samice ssak

ó

ó

w

w

ł

ł

o

o

ż

ż

yskowych posiadaj

yskowych posiadaj

ą

ą

dwie kopie

dwie kopie

chromosomu X.

chromosomu X.





Inaktywacja chromosomu X jest mechanizmem

Inaktywacja chromosomu X jest mechanizmem

kompensacyjnym, wyr

kompensacyjnym, wyr

ó

ó

wnuj

wnuj

ą

ą

cym poziom ekspresji

cym poziom ekspresji

gen

gen

ó

ó

w zlokalizowanych na chromosomach p

w zlokalizowanych na chromosomach p

ł

ł

ciowych.

ciowych.





Oba chromosomy s

Oba chromosomy s

ą

ą

aktywne w stadium wczesnego

aktywne w stadium wczesnego

zarodka. P

zarodka. P

ó

ó

ź

ź

niej w kom

niej w kom

ó

ó

rkach p

rkach p

ł

ł

odu dochodzi do

odu dochodzi do

losowej inaktywacji jednego chromosomu X.

losowej inaktywacji jednego chromosomu X.





Zmiany te s

Zmiany te s

ą

ą

przekazywane podczas podzia

przekazywane podczas podzia

ł

ł

ó

ó

w

w

mitotycznych

mitotycznych





W odr

W odr

ó

ó

ż

ż

nieniu od

nieniu od

imprintingu

imprintingu

inaktywacja chromosomu X obejm uje ca

inaktywacja chromosomu X obejm uje ca

ł

ł

y

y

chromosom.

chromosom.





Proces ten jest kierowany przez

Proces ten jest kierowany przez

Xic

Xic

(

(

X

X

-

-

inactivation

inactivation

center).

center).

Xic

Xic

zawiera 2 wa

zawiera 2 wa

ż

ż

ne

ne

geny: XIST i TSIX koduj

geny: XIST i TSIX koduj

ą

ą

ce

ce

nieulegaj

nieulegaj

ą

ą

ce

ce

translacji

translacji

mRNA

mRNA

. TSIX jest

. TSIX jest

zlokalizowany w regionie 3

zlokalizowany w regionie 3

’

’

XIST i jego

XIST i jego

mRNA

mRNA

jest

jest

antysensowym

antysensowym

transkryptem

transkryptem

dla XIST

dla XIST

mRNA

mRNA

.

.





Pocz

Pocz

ą

ą

tkowo XIST i TSIX ulegaj

tkowo XIST i TSIX ulegaj

ą

ą

ekspresji r

ekspresji r

ó

ó

wnolegle z obu chromosom

wnolegle z obu chromosom

ó

ó

w X, ale

w X, ale

represja transkrypcji TSIX na jednym z chromosom

represja transkrypcji TSIX na jednym z chromosom

ó

ó

w X prowadzi do

w X prowadzi do

zwi

zwi

ę

ę

kszenia poziomu ekspresji XIST i dalej do tworzenia si

kszenia poziomu ekspresji XIST i dalej do tworzenia si

ę

ę

XIST

XIST

mRNA

mRNA

w

w

chromosomie X, substytucji histonu H2A poprzez macro

chromosomie X, substytucji histonu H2A poprzez macro

-

-

H2A i

H2A i

metylacji

metylacji

lizyny w

lizyny w

pozycji 9. i 27. histonu H3.

pozycji 9. i 27. histonu H3.





Inaktywacja gen

Inaktywacja gen

ó

ó

w zlokalizowanych na chromosom ie X nast

w zlokalizowanych na chromosom ie X nast

ę

ę

puje podczas

puje podczas

rozprzestrzeniania si

rozprzestrzeniania si

ę

ę

nieaktywnej struktury chromaty ny wzd

nieaktywnej struktury chromaty ny wzd

ł

ł

u

u

ż

ż

chromosomu.

chromosomu.

Jest to proces, kt

Jest to proces, kt

ó

ó

ry obejmuje dzia

ry obejmuje dzia

ł

ł

anie r

anie r

ó

ó

ż

ż

nych czynnik

nych czynnik

ó

ó

w, w tym modyfikacj

w, w tym modyfikacj

ę

ę

histon

histon

ó

ó

w i cz

w i cz

ęś

ęś

ciow

ciow

ą

ą

metylacj

metylacj

ę

ę

wysp

wysp

CpG

CpG

powi

powi

ą

ą

zanych z promotorami tych gen

zanych z promotorami tych gen

ó

ó

w

w

.

.





Nieaktywny chromosom ulega akt ywacji w profazie I podzia

Nieaktywny chromosom ulega akt ywacji w profazie I podzia

ł

ł

u

u

mejotycznego

mejotycznego

w

w

kom

kom

ó

ó

rkach linii p

rkach linii p

ł

ł

ciowej

ciowej

Inaktywacja chromosomu X w

Inaktywacja chromosomu X w

kom

kom

ó

ó

rkach samic ssak

rkach samic ssak

ó

ó

w

w

ł

ł

o

o

ż

ż

yskowych

yskowych

Regulacja ekspresji gen

Regulacja ekspresji gen

ó

ó

w i

w i

modulacja struktury chromatyny

modulacja struktury chromatyny





Metylacja

Metylacja

DNA powoduje na og

DNA powoduje na og

ó

ó

ł

ł

wyciszenie ekspresji

wyciszenie ekspresji

gen

gen

ó

ó

w.

w.





Wi

Wi

ąż

ąż

e si

e si

ę

ę

to ze zmian

to ze zmian

ą

ą

struktury chromatyny na

struktury chromatyny na

nieaktywn

nieaktywn

ą

ą

, skondensowan

, skondensowan

ą

ą

(heterochromatyna).

(heterochromatyna).





Bia

Bia

ł

ł

ka

ka

MeCPs

MeCPs

(

(

Methyl

Methyl

-

-

CpG

CpG

-

-

Binding

Binding

Proteins

Proteins

) wi

) wi

ążą

ążą

si

si

ę

ę

ze

ze

zmetylowanym

zmetylowanym

DNA poprzez domeny wi

DNA poprzez domeny wi

ążą

ążą

ce

ce

fragment

fragment

zmetylowany

zmetylowany

(

(

MBD

MBD

-

-

Methyl

Methyl

Binding

Binding

Domain

Domain

).

).





MeCPs

MeCPs

oddzia

oddzia

ł

ł

uj

uj

ą

ą

z

z

deacetylaz

deacetylaz

ą

ą

histon

histon

ó

ó

w oraz

w oraz

kompleksami

kompleksami

remodeluj

remodeluj

ą

ą

cymi

cymi

chromatyn

chromatyn

ę

ę

. Dok

. Dok

ł

ł

adny

adny

mechanizm tego procesu nie jest poznany.

mechanizm tego procesu nie jest poznany.





Skutkiem powy

Skutkiem powy

ż

ż

szych zmian jest

szych zmian jest

deacetylacja

deacetylacja

histon

histon

ó

ó

w i

w i

metylacja

metylacja

lizyny 9. histonu H3.

lizyny 9. histonu H3.

4

Wp

Wp

ł

ł

yw

yw

metylacji

metylacji

na rozw

na rozw

ó

ó

j

j

nowotworu

nowotworu

podczas powstawania nowotworu

podczas powstawania nowotworu

epigenotyp

epigenotyp

kom

kom

ó

ó

rki znacz

rki znacz

ą

ą

co si

co si

ę

ę

zmienia.

zmienia.

Mo

Mo

ż

ż

liwe s

liwe s

ą

ą

nast

nast

ę

ę

puj

puj

ą

ą

ce zmiany w

ce zmiany w

metylacji

metylacji

DNA:

DNA:





Hipermetylacja

Hipermetylacja

wysp

wysp

CpG

CpG





Hipometylacja

Hipometylacja

gen

gen

ó

ó

w normalnie

w normalnie

zmetylowanych

zmetylowanych

(globalna

(globalna

demetylacja

demetylacja

gen

gen

ó

ó

w i lokalna w genach

w i lokalna w genach

promotorowych

promotorowych

)

)





Tranzycja

Tranzycja

: 5

: 5

-

-

metylocytozyna do tyminy i

metylocytozyna do tyminy i

metylacja

metylacja

„

„

non

non

-

-

CpG

CpG

”

”

w

w

kom

kom

ó

ó

rkach nowotworowych

rkach nowotworowych





Indukcja niestabilno

Indukcja niestabilno

ś

ś

ci chromosom

ci chromosom

ó

ó

w

w

-

-

poprzez nieprawid

poprzez nieprawid

ł

ł

owy poziom

owy poziom

metylacji

metylacji

dochodzi do zmiennego poziomu ekspresji gen

dochodzi do zmiennego poziomu ekspresji gen

ó

ó

w, co objawia

w, co objawia

si

si

ę

ę

niestabilno

niestabilno

ś

ś

ci

ci

ą

ą

chromosom

chromosom

ó

ó

w i stymuluje tym samym rozw

w i stymuluje tym samym rozw

ó

ó

j

j

nowotworu .

nowotworu .

Hipometylacja

Hipometylacja





Wp

Wp

ł

ł

yw

yw

hipometylacji

hipometylacji

na

na

onkogenez

onkogenez

ę

ę

wyra

wyra

ż

ż

a si

a si

ę

ę

nadekspresj

nadekspresj

ą

ą

onkogen

onkogen

ó

ó

w spowodowan

w spowodowan

ą

ą

demetylacj

demetylacj

ą

ą

region

region

ó

ó

w

w

promotorowych

promotorowych

tych onkogen

tych onkogen

ó

ó

w. W ten spos

w. W ten spos

ó

ó

b dochodzi do nadmiernej

b dochodzi do nadmiernej

stymulacji proliferacji kom

stymulacji proliferacji kom

ó

ó

rkowej.

rkowej.





W raku jelita grubego stwierdzono redukcj

W raku jelita grubego stwierdzono redukcj

ę

ę

og

og

ó

ó

lnej

lnej

metylacji

metylacji

o

o

10

10

-

-

30%, a w

30%, a w

przednowotworowych

przednowotworowych

stadiach gruczolaka

stadiach gruczolaka

zaobserwowano znacz

zaobserwowano znacz

ą

ą

ce zmniejszenie ilo

ce zmniejszenie ilo

ś

ś

ci 5

ci 5

-

-

metylocytozyny.

metylocytozyny.





Hipometylacja

Hipometylacja

powy

powy

ż

ż

ej 50% wyst

ej 50% wyst

ę

ę

puje w nowotworach klatki

puje w nowotworach klatki

piersiowej. Przy nowotworach krwi

piersiowej. Przy nowotworach krwi

hipometylacja

hipometylacja

wyst

wyst

ę

ę

puje w

puje w

przewlek

przewlek

ł

ł

ej bia

ej bia

ł

ł

aczce limfatycznej (CLL), podczas gdy w

aczce limfatycznej (CLL), podczas gdy w

przewlek

przewlek

ł

ł

ej (CML) i ostrej bia

ej (CML) i ostrej bia

ł

ł

aczce szpikowej (AML) oraz w

aczce szpikowej (AML) oraz w

szpiczaku mnogim wyst

szpiczaku mnogim wyst

ę

ę

puje tylko niewielka zmiana w schemacie

puje tylko niewielka zmiana w schemacie

metylacji

metylacji

DNA.

DNA.





Globalna

Globalna

demetylacja

demetylacja

wyst

wyst

ę

ę

puje we wczesnych stadiach

puje we wczesnych stadiach

nowotwor

nowotwor

ó

ó

w klatki piersiowej, jelita grubego i CLL.

w klatki piersiowej, jelita grubego i CLL.





W raku jelita grubego ponadto

W raku jelita grubego ponadto

hipometylacja

hipometylacja

wyst

wyst

ę

ę

puje w

puje w

zdrowych tkankach przylegaj

zdrowych tkankach przylegaj

ą

ą

cych do guza. W innych

cych do guza. W innych

nowotworach

nowotworach

np

np

. raku

. raku

w

w

ą

ą

trobowokom

trobowokom

ó

ó

rkowym

rkowym

hipometylacja

hipometylacja

wzrasta wraz z zaawansowaniem i stadium histologicznym guza.

wzrasta wraz z zaawansowaniem i stadium histologicznym guza.





Hipometylacja

Hipometylacja

specyficznych gen

specyficznych gen

ó

ó

w wyst

w wyst

ę

ę

puje w nowotworach

puje w nowotworach

jelita okr

jelita okr

ęż

ęż

nicy, trzustki, klatki piersiowej,

nicy, trzustki, klatki piersiowej,

ż

ż

o

o

łą

łą

dka, prostaty i w

dka, prostaty i w

bia

bia

ł

ł

aczce. Z regu

aczce. Z regu

ł

ł

y s

y s

ą

ą

to geny reguluj

to geny reguluj

ą

ą

ce wzrost, koduj

ce wzrost, koduj

ą

ą

ce

ce

enzymy, wa

enzymy, wa

ż

ż

ne dla rozwoju organizmu, geny

ne dla rozwoju organizmu, geny

tkankowospecyficzne

tkankowospecyficzne

i onkogeny .

i onkogeny .

Hipometylacja

Hipometylacja

Hipermetylacja

Hipermetylacja





Najcz

Najcz

ę

ę

stszymi miejscami podlegaj

stszymi miejscami podlegaj

ą

ą

cymi

cymi

hipermetylacji

hipermetylacji

w

w

r

r

ó

ó

ż

ż

nych rodzajach nowotwor

nych rodzajach nowotwor

ó

ó

w s

w s

ą

ą

chromosomy 3p, 11p i 17p .

chromosomy 3p, 11p i 17p .





Zjawisko to zachodzi w obr

Zjawisko to zachodzi w obr

ę

ę

bie wysp

bie wysp

CpG

CpG

, kt

, kt

ó

ó

re normalnie w

re normalnie w

genomie pozostaj

genomie pozostaj

ą

ą

niezmetylowane

niezmetylowane

. Najwa

. Najwa

ż

ż

niejsz

niejsz

ą

ą

tego

tego

konsekwencj

konsekwencj

ą

ą

jest wyciszenie funkcji gen

jest wyciszenie funkcji gen

ó

ó

w

w

supresorowych

supresorowych

.

.





Przyk

Przyk

ł

ł

adem mo

adem mo

ż

ż

e by

e by

ć

ć

hipermetylacja

hipermetylacja

promotora genu p16

promotora genu p16

(INK4A), kt

(INK4A), kt

ó

ó

ra wyst

ra wyst

ę

ę

puje w wielu nowotworach. p16 jest

puje w wielu nowotworach. p16 jest

inhibitorem kinazy

inhibitorem kinazy

cyklinozale

cyklinozale

ż

ż

nej

nej

, kt

, kt

ó

ó

ry negatywnie reguluje

ry negatywnie reguluje

przej

przej

ś

ś

cie kom

cie kom

ó

ó

rki z fazy G1 do S.

rki z fazy G1 do S.





Zatem nieprawid

Zatem nieprawid

ł

ł

owa ekspresja prowadzi do zaburze

owa ekspresja prowadzi do zaburze

ń

ń

cyklu

cyklu

kom

kom

ó

ó

rkowego i utrat

rkowego i utrat

ą

ą

kontroli nad nim, co stymuluje proliferacj

kontroli nad nim, co stymuluje proliferacj

ę

ę

i wp

i wp

ł

ł

ywa na rozw

ywa na rozw

ó

ó

j nowotworu . Zjawisko to zachodzi w

j nowotworu . Zjawisko to zachodzi w

nowotworach: p

nowotworach: p

ę

ę

cherza moczowego, nosa i gard

cherza moczowego, nosa i gard

ł

ł

a, trzustki, jelita

a, trzustki, jelita

grubego, p

grubego, p

ł

ł

uc, czerniaku, glejaku i bia

uc, czerniaku, glejaku i bia

ł

ł

aczce. W kancerogenezie

aczce. W kancerogenezie

raka gruczo

raka gruczo

ł

ł

owego prze

owego prze

ł

ł

yku

yku

metylacja

metylacja

promotora genu p16 mo

promotora genu p16 mo

ż

ż

e

e

pojawia

pojawia

ć

ć

si

si

ę

ę

ju

ju

ż

ż

w stadium metaplazji .

w stadium metaplazji .

Przeprowadzono badanie profilu

Przeprowadzono badanie profilu

hipermetylacji

hipermetylacji

15 nowotwor

15 nowotwor

ó

ó

w: okr

w: okr

ęż

ęż

nicy,

nicy,

ż

ż

o

o

łą

łą

dka,

dka,

trzustki, w

trzustki, w

ą

ą

troby, nerki, p

troby, nerki, p

ł

ł

uca, g

uca, g

ł

ł

owy, szyi, piersi, jajnik

owy, szyi, piersi, jajnik

ó

ó

w, p

w, p

ę

ę

cherza moczowego,

cherza moczowego,

endometrium

endometrium

, m

, m

ó

ó

zgu,

zgu,

ch

ch

ł

ł

oniaka

oniaka

i bia

i bia

ł

ł

aczki. Analiza obejmowa

aczki. Analiza obejmowa

ł

ł

a 3 grupy gen

a 3 grupy gen

ó

ó

w:

w:





·

·

Geny supresorowe: p16, p15, p14, p73, APC (gen polipowato

Geny supresorowe: p16, p15, p14, p73, APC (gen polipowato

ś

ś

ci jelita grubego) i

ci jelita grubego) i

BRCA1

BRCA1





Geny odpowiedzialne za napraw

Geny odpowiedzialne za napraw

ę

ę

DNA lub metabolizm

DNA lub metabolizm

ksenobiotyk

ksenobiotyk

ó

ó

w

w

: hMLH1,

: hMLH1,

GSTP1 (gen

GSTP1 (gen

transferazy

transferazy

S

S

-

-

glutationu

glutationu

klasy p), MGMT

klasy p), MGMT





Geny odpowiedzialne za inwazyjno

Geny odpowiedzialne za inwazyjno

ść

ść

i przerzuty: CDH1, TIMP3, DAPK

i przerzuty: CDH1, TIMP3, DAPK

Metylacja

Metylacja

w przynajmniej jednym genie by

w przynajmniej jednym genie by

ł

ł

a obecna w ka

a obecna w ka

ż

ż

dym typie nowotworu.

dym typie nowotworu.

Profile

Profile

metylacji

metylacji

by

by

ł

ł

y zale

y zale

ż

ż

ne zar

ne zar

ó

ó

wno od genu jak i od nowotworu . Niekt

wno od genu jak i od nowotworu . Niekt

ó

ó

re

re

geny,

geny,

np

np

. p16, MGMT, DAPK by

. p16, MGMT, DAPK by

ł

ł

y

y

zmetylowane

zmetylowane

w r

w r

ó

ó

ż

ż

nych typach nowotwor

nych typach nowotwor

ó

ó

w

w

(okr

(okr

ęż

ęż

nicy, p

nicy, p

ł

ł

uca, g

uca, g

ł

ł

owy, szyi, jajnik

owy, szyi, jajnik

ó

ó

w, p

w, p

ę

ę

cherza moczowego,

cherza moczowego,

ch

ch

ł

ł

oniaka

oniaka

i

i

bia

bia

ł

ł

aczki).

aczki).

Hipermetylacja

Hipermetylacja

p14, APC, p16, MGMT, hMLH1 wy st

p14, APC, p16, MGMT, hMLH1 wy st

ę

ę

powa

powa

ł

ł

a w

a w

nowotworach przewodu pokarmowego (okr

nowotworach przewodu pokarmowego (okr

ęż

ęż

nica,

nica,

ż

ż

o

o

łą

łą

dek), a GSTP1 w

dek), a GSTP1 w

steroidozale

steroidozale

ż

ż

nych

nych

nowotworach (piersi, w

nowotworach (piersi, w

ą

ą

troby, prostaty).

troby, prostaty).

Hipermetylacja

Hipermetylacja

Metylacja

Metylacja

„

„

non

non

-

-

CpG

CpG

”

”

w kom

w kom

ó

ó

rkach

rkach

nowotworowych

nowotworowych





Sugeruje si

Sugeruje si

ę

ę

,

,

ż

ż

e

e

metylacja

metylacja

„

„

non

non

-

-

CpG

CpG

”

”

katalizowana przez DNMT3 mo

katalizowana przez DNMT3 mo

ż

ż

e wyst

e wyst

ę

ę

powa

powa

ć

ć

w ludzkim genie p53.

w ludzkim genie p53.





To

zjawisko

wyst

To

zjawisko

wyst

ę

ę

puje

w

tkankach

puje

w

tkankach

przylegaj

przylegaj

ą

ą

cych do nowotworu p

cych do nowotworu p

ł

ł

uca, co

uca, co

wskazuje,

wskazuje,

ż

ż

e

e

metylacja

metylacja

„

„

non

non

-

-

CpG

CpG

”

”

mo

mo

ż

ż

e

e

wyst

wyst

ę

ę

powa

powa

ć

ć

we

wczesnym

stadium

we

wczesnym

stadium

kancerogenezy i s

kancerogenezy i s

ł

ł

u

u

ż

ż

y

y

ć

ć

jako wska

jako wska

ź

ź

nik dla

nik dla

wczesnego

rozpoznania

procesu

wczesnego

rozpoznania

procesu

nowotworowego

nowotworowego

5

Zesp

Zesp

ó

ó

ł

ł

Wernera

Wernera

(WS)

(WS)





Jest to

Jest to

autosomalna

autosomalna

recesywna choroba dziedziczna

recesywna choroba dziedziczna

charakteryzuj

charakteryzuj

ą

ą

ca si

ca si

ę

ę

przedwczesnym starzeniem i cz

przedwczesnym starzeniem i cz

ę

ę

stym

stym

wyst

wyst

ę

ę

powaniem nowotwor

powaniem nowotwor

ó

ó

w. Choroba jest spowodowana

w. Choroba jest spowodowana

mutacjami genu WRN, nale

mutacjami genu WRN, nale

żą

żą

cego do rodziny

cego do rodziny

RecQ

RecQ

i

i

posiadaj

posiadaj

ą

ą

cego aktywno

cego aktywno

ść

ść

enzymatyczn

enzymatyczn

ą

ą

helikazy

helikazy

i

i

egzonukleazy

egzonukleazy

.

.





Helikaza

Helikaza

WRN odgrywa znacz

WRN odgrywa znacz

ą

ą

c

c

ą

ą

rol

rol

ę

ę

w stabilizacji funkcji

w stabilizacji funkcji

telomeru . W kom

telomeru . W kom

ó

ó

rkach nowotworowych funkcja genu WRN jest

rkach nowotworowych funkcja genu WRN jest

zniesiona poprzez wyciszenie na drodze

zniesiona poprzez wyciszenie na drodze

hipermetylacji

hipermetylacji

wysp

wysp

CpG

CpG

w obr

w obr

ę

ę

bie promotora.

bie promotora.





Epigenetyczna inaktywacja WRN na poziomie biochemicznym i

Epigenetyczna inaktywacja WRN na poziomie biochemicznym i

kom

kom

ó

ó

rkowym prowadzi do straty

rkowym prowadzi do straty

egzonukleazowej

egzonukleazowej

aktywno

aktywno

ś

ś

ci

ci

WRN, zwi

WRN, zwi

ę

ę

kszonej niestabilno

kszonej niestabilno

ś

ś

ci chromosom

ci chromosom

ó

ó

w i

w i

apoptozy

apoptozy

indukowanej przez inhibitory

indukowanej przez inhibitory

topoizomerazy

topoizomerazy

.

.





Za rozw

Za rozw

ó

ó

j zespo

j zespo

ł

ł

u

u

Retta

Retta

odpowiadaj

odpowiadaj

ą

ą

powtarzaj

powtarzaj

ą

ą

ce si

ce si

ę

ę

nonsensowne mutacje w regionie MBD (

nonsensowne mutacje w regionie MBD (

Methyl

Methyl

binding

binding

domain

domain

)

)

MeCP2, proteinie wi

MeCP2, proteinie wi

ążą

ążą

cej

cej

zmetylowany

zmetylowany

DNA .

DNA .





W schizofrenii i chorobie dwubiegunowej zidentyfikowano

W schizofrenii i chorobie dwubiegunowej zidentyfikowano

niemal 100 pozycji ze zmienion

niemal 100 pozycji ze zmienion

ą

ą

metylacj

metylacj

ą

ą

, wi

, wi

ę

ę

kszo

kszo

ść

ść

nich by

nich by

ł

ł

a

a

specyficzna dla p

specyficzna dla p

ł

ł

ci .

ci .





Zesp

Zesp

ó

ó

ł

ł

ł

ł

amliwego chromosomu X jest zwi

amliwego chromosomu X jest zwi

ą

ą

zany z wielokrotnymi

zany z wielokrotnymi

powt

powt

ó

ó

rzeniami

rzeniami

trinukleotyd

trinukleotyd

ó

ó

w

w

CGG w obr

CGG w obr

ę

ę

bie genu FMR1, te

bie genu FMR1, te

powt

powt

ó

ó

rzenia id

rzenia id

ą

ą

w parze z anormaln

w parze z anormaln

ą

ą

metylacj

metylacj

ą

ą

tych region

tych region

ó

ó

w i w

w i w

konsekwencji wywo

konsekwencji wywo

ł

ł

uj

uj

ą

ą

wyciszenie genu FMR1 .

wyciszenie genu FMR1 .





Chroniczne nara

Chroniczne nara

ż

ż

enie na nikiel (II), chrom (VI) lub arsen

enie na nikiel (II), chrom (VI) lub arsen

nieorganiczny mo

nieorganiczny mo

ż

ż

e tak

e tak

ż

ż

e wywo

e wywo

ł

ł

ywa

ywa

ć

ć

modyfiakacj

modyfiakacj

ę

ę

bia

bia

ł

ł

ek

ek

histonowych

histonowych

i zmian

i zmian

ę

ę

profilu

profilu

metylacji

metylacji

DNA

DNA

Analiza

Analiza

metylacji

metylacji





MS

MS

-

-

PCR

PCR

Methylation

Methylation

spec

spec

i

i

fic

fic

PCR

PCR





RE

RE

-

-

PCR

PCR

(REP)

(REP)

Restriction enzyme PCR

Restriction enzyme PCR





B SSCP

B SSCP

Bisulfite

Bisulfite

single

single

-

-

strand

strand

conformation polymorphism

conformation polymorphism





BGS

BGS

-

-

bisulfite

bisulfite

genomic

genomic

sequencing

sequencing





MS

MS

nested

nested

PCR

PCR





real

real

-

-

time

time

PCR

PCR

MS

MS

-

-

AP

AP

-

-

PCR

PCR

(

(

Methylation

Methylation

Sensitive

Sensitive

Arbitrarily

Arbitrarily

Primed

Primed

PCR)

PCR)





PCR

PCR





Elektroforeza

Elektroforeza





Po PCR u

Po PCR u

ż

ż

ywa si

ywa si

ę

ę

enzym

enzym

ó

ó

w restrykcyjnych

w restrykcyjnych

HpaII

HpaII

kt

kt

ó

ó

ry rozcina w miejscach

ry rozcina w miejscach

metylacji

metylacji

oraz

oraz

MspI

MspI

kt

kt

ó

ó

ry

rozcina

miejsca

ry

rozcina

miejsca

niemetylowane

niemetylowane

. Dodatkowo stosuje si

. Dodatkowo stosuje si

ę

ę

enzym

enzym

usuwaj

usuwaj

ą

ą

cy artefakty powstaj

cy artefakty powstaj

ą

ą

ce w

ce w

PCR

PCR

-

-

RsaI

RsaI





Je

Je

ż

ż

eli po trawieniu

eli po trawieniu

HpaII

HpaII

i

i

RsaI

RsaI

widoczny

widoczny

jest

jest

produkt ci

produkt ci

ę

ę

cia to

cia to

ś

ś

wiadczy to o

wiadczy to o

metylacji

metylacji





Je

Je

ż

ż

eli po trawieniu

eli po trawieniu

MSpI

MSpI

i

i

RsaI

RsaI

nie

nie

widoczny

widoczny

jest produkt ci

jest produkt ci

ę

ę

cia to r

cia to r

ó

ó

wnie

wnie

ż

ż

ś

ś

wiadczy to o

wiadczy to o

metylacji

metylacji

Nu

Nu

kleotydy

kleotydy

niebieskie

niebieskie

to

to

niemetylowane

niemetylowane

cytozyny

cytozyny

kt

kt

ó

ó

re ulegaj

re ulegaj

ą

ą

przekszta

przekszta

ł

ł

caniu

caniu

w

w

urac

urac

yle

yle

pod wp

pod wp

ł

ł

ywem wodorosiarczynu

ywem wodorosiarczynu

,

,

podczas gdy

podczas gdy

nukleotydy zaznaczone na

nukleotydy zaznaczone na

czerwono

czerwono

s

s

ą

ą

to 5

to 5

’

’

metylocytozyny oporne na

metylocytozyny oporne na

przekszta

przekszta

ł

ł

cenie

cenie

Allel metylowany

Allel niemetylowany

traktowanie
wodorosiarczynem sodu

Methylation

Methylation

-

-

specific PCR

specific PCR

jest czu

jest czu

łą

łą

metod

metod

ą

ą

pozwalaj

pozwalaj

ą

ą

c

c

ą

ą

na

na

namna

namna

ż

ż

anie

anie

i

i

wykrywanie

wykrywanie

obszar

obszar

ó

ó

w

w

metylowanych

metylowanych

przy u

przy u

ż

ż

yciu specyficznych

yciu specyficznych

starter

starter

ó

ó

w.

w.

Startery przy

Startery przy

łą

łą

cz

cz

ą

ą

si

si

ę

ę

tyko

tyko

do sekwencji

do sekwencji

metylowanych

metylowanych

zawieraj

zawieraj

ą

ą

cych

cych

5

5

’

’

metylocytozyn

metylocytozyn

ę

ę

kt

kt

ó

ó

r

r

ą

ą

nie uleg

nie uleg

ł

ł

a przekszta

a przekszta

ł

ł

ceniu w uracyl pod wp

ceniu w uracyl pod wp

ł

ł

ywem

ywem

wodorosiarczynu

wodorosiarczynu

.

.

Eeeeee
Eeeee

6

Analiza

Analiza

metylacji

metylacji

DNA

DNA

oparta na

oparta na

non

non

methylation

methylation

-

-

specific PCR

specific PCR

.

.

Po

Po

traktowaniu wodorosiarczynem

traktowaniu wodorosiarczynem

genomowe

genomowe

DNA

DNA

jest

jest

namna

namna

ż

ż

ane

ane

w reakcji

w reakcji

PCR

PCR

kt

kt

ó

ó

ra nie rozr

ra nie rozr

ó

ó

ż

ż

nia

nia

sekwencji

sekwencji

metylowanych

metylowanych

i

i

niemetylowanych

niemetylowanych

.

.

Po namno

Po namno

ż

ż

eniu

eniu

DNA w reakcji PCR dost

DNA w reakcji PCR dost

ę

ę

pnych jest wiele metod kt

pnych jest wiele metod kt

ó

ó

re pozwalaj

re pozwalaj

ą

ą

na

na

r

r

ó

ó

ż

ż

nicowanie sekwencji

nicowanie sekwencji

metylowanych

metylowanych

na bazie dokonanych

na bazie dokonanych

wczesniej

wczesniej

zmian

zmian

(efekt traktowania

(efekt traktowania

wodorosirczynem

wodorosirczynem

)

)

Methylation-sensitive single-strand conformation analysis (MS-SSCA)
Methylation-sensitive single-nucleotide primer extension (MS-SnuPE)
High resolution melting analysis (HRM)

Ekspansja tr

Ekspansja tr

ó

ó

jnukleotydowa

jnukleotydowa



Genom człowieka w ponad połowie składa się z sekwencji

powtarzających się.



Należą do nich między innymi tandemowe powtórzenia, które

stanowią 10%całkowitej sekwencji DNA. Ta grupa obejmuje

satelity, minisatelity oraz mikrosatelity różniące się wielkością

powtarzającego się motywu sekwencji.

Znacznie mniejszą część genomu, bo tylko 1% zajmują sekwencje

kodujące około 22 tysięcy ludzkich genów i drugie tyle stanowią

ich sekwencje regulatorowe.

Sekwencje powtarzające się występują nie tylko w częściach

międzygenowych lecz także w genach, nawet w ich częściach

kodujących i mogą brać udział w regulacji ich ekspresji.

Genom człowieka

Geny i sekwencje
Pokrewne 25%

Regiony międzygenowe 75%

Regiony
kodujące
i regulatorowe
2%

Introny
promotory
Pseudogeny 23%

Powtarzające się 55%

Unikatowe 20%

Powtórzenia tandemowe 10%

Powtórzenia rozproszone 45%

Satelity

Minisatelity

Mikrosatelity



Mikrosatelity znane również jako krótkie tandemowe

powtórzenia (ang. Short Tandem Repeats (STR) albo

powtórzenia prostych sekwencji (ang. Simple

Sequence Repeats (SSR) składają się z

powtarzających się 1-6 nukleotydowych motywów.



Liczba powtórzeń takich sekwencji zwykle nie

przekracza 10, a jeśli jest wyższa to często taki ciąg

charakteryzuje się polimorfizmem długości w

populacji. W rzadkich przypadkach, najczęściej

patologicznych, liczba powtórzeń może osiągać setki a

nawet tysiące.



Wszystkie sekwencje typu STR obejmują łącznie 3%

ludzkiego genomu. Zarówno zawartość jak i

rozmieszczenie różnych powtórzeń tego typu w

genomie są silnie zróżnicowane.



Większość sekwencji STR występuje znacznie

częściej w regionach niekodujących.



Wyjątkiem są tutaj ciągi powtórzeń trój i

sześcionukleotydowych, które są niemal dwukrotnie

częstsze w eksonach niż w intronach i regionach

międzygenowych.



Ich pozytywna selekcja w eksonach sugeruje, że mogą

one mieć znaczenie funkcjonalne.



Wysoka podatność ciągów prostych powtórzeń

sekwencji na mutacje i wynikający z niej częsty

polimorfizm długości czynią z sekwencji

powtarzających się bogate źródło zmienności

fenotypowej.



Powtórzenia trójnukleotydowe naleza do grupy powtórzen

mikrosatelitarnych, tworzacych proste, tandemowe

powtórzenia złożone z jednego do szesciu nukleotydów.



Charakteryzuja sie one wysokim polimorfizmem i wystepują

równomiernie w genomie co 6–10 kpz.



Sekwencje mikrosatelitarne zlokalizowane sa nie tylko w

intronach i w

sekwencjach flankujacych, ale również w

sekwencjach kodujacych czyli eksonach.

W obrebie sekwencji powtórzen trójnukleotydowych moe dojsć

do zjawiska zwielokrotnienia motywu trójnukleotydowego, czyli

do ekspansji powtórzen.

Mechanizm ekspansji trójnukleotydowych powtórzen zwiazany jest

z błedami w czasie replikacji DNA.

7

Powt

Powt

ó

ó

rzenia w

rzenia w

mRNA

mRNA



Najczęściej występującymi motywami

powtórzonymi są: CAG, CGG, CCG,CUG, AGG

i ACC,

natomiast

ACG,AUC, CUU, AGU, CGU i ACU

należą da najrzadszych w transkryptomie.

Większość ciągów powtórzeń występuje w

ORF (ang. Open Reading Frame) (67%), mniej

w 5’UTR (ang. Untranslated Region) (24%) i

najmniej w 3’UTR (9%).

Powtórzenia bogate w GC przeważają w

5’UTR, a bogate w AU są częstsze w 3’UTR.



Wzrost liczby powtórzeń ponad normę
(określoną dla każdego genu) zwany jest
mutacją dynamiczna.



Mutacje dynamiczne dotyczą najczęsciej

zwielokrotnienia nawet 300-krotnego

trójnukleotydowej sekwencji powtórzonej, co
w efekcie prowadzi do wystąpienia choroby
genetycznej





Pl

Pl

ą

ą

sawica Huntingtona normalna liczba

sawica Huntingtona normalna liczba

powt

powt

ó

ó

rze

rze

ń

ń

6

6

-

-

36;zmutowanan 36

36;zmutowanan 36

-

-

121

121



Rdzeniowy Zanik miesni typu Kennedyego

normalna liczba powt

normalna liczba powt

ó

ó

rze

rze

ń

ń

11

11

-

-

33;zmutowana

33;zmutowana

38

38

-

-

66

66



Zespół łamliwego chromosomu X

normalna

normalna

liczba powt

liczba powt

ó

ó

rze

rze

ń

ń

6

6

-

-

52;zmutowanan >52

52;zmutowanan >52



Ekspansja niestabilnych ciągów
powtórzeń w pojedyńczych genach jest
przyczyną ponad 20 różnych chorób
dziedzicznych znanych pod wspólną
angielską nazwą Triplet Repeat
Expansion Diseases (TREDs).

Należą do nich:
- zespół łamliwego chromosomu X (FXS),
- dystrofia miotoniczna (DM),
- choroba Huntingtona (HD)
- szereg ataksji rdzeniowomóżdżkowych (SCAs).

Ciągi powtórzeń ulegające patogenicznym

ekspansjom występują we wszystkich

regionach funkcjonalnych genów, zarówno w

częściach ulegających translacji, jak i w

regionach niekodujących.

Choroby zwiazane z ekspansja powtórzen

trójnukleotydowych można podzielić ze względu na

miejsce wystepowania powtórzeń:

1. Trójnukleotydowe powtórzenia zlokalizowane w
regionie ulegajacym translacji.

Do tej grupy chorób zalicza sie:



plasawice Huntingtona – HD, ataksje rdzeniowomó



-dkowa typu pierwszego – SCA1, ataksje rdzeniowo-



módkowa typu drugiego – SCA2, ataksje rdzeniowo-



módkowa typu trzeciego – SCA3, ataksje rdzeniowo-



módkowa typu szóstego – SCA6, ataksje



rdzeniowo-módkowa typu siódmego – SCA7, ataksje



rdzeniowo-módkowa typu siedemnastego – SCA17,



zwyrodnienie zebato-czerwienne DRPLA, rdzeniowoopuszkowy



zanik miesni typu Kennedy`ego – SBMA,



dystrofie miesniowa oczno-gardzielowa – OPMD,



achondroplazje rzekoma – COMP.

8

2. Trójnukleotydowe powtórzenia zlokalizowane w
regionie nie ulegajacym translacji oraz w intronie.

Do tej grupy chorób zalicza sie:



zespół łamliwego chromosomu X – FRAXA,
uposledzenie



umysłowe zwiazane z FRAXE, dystrofie miotoniczna



– DM, ataksje rdzeniowo-módkowa typu



ósmego – SCA8, ataksje módkowo-rdzeniowa typu



dwunastego – SCA12, ataksje Friedreicha – FRDA.



Większość genów związanych z TREDs

zawiera powtórzenia CAG w regionie

kodującym i wywołująca chorobę liczba

powtórzeń mieści się najczęściej w zakresie

od około 40 do 100.



Ekspansje powtórzeń w regionach

niekodujących są większe i bardziej zmienne.



Powszechnie uważa się, że powtórzenia

występujące w regionach ulegających

translacji wywołują patogenezę poprzez

zmiany funkcji kodowanego białka



Większość chorób wywoływanych ekspansją
trójnukleotydowych powtórzeń jest warunkowana w

sposób autosomalny dominująy czyli wywołuje je

mutacja w jednym z dwóch wariantów genu.



Produkt zmutowanego genu, transkrypt lub białko,

albo obydwa są toksyczne dla komórki. Zatem

usunięcie zmutowanego transkryptu lub białka powinno

przeciwdziałać chorobie.



Terapia TREDs jest dużym wyzwaniem ze względu na
miejsce gdzie rozwijają się główne objawy choroby

czyli centralny układ nerwowy oraz konieczność

allelospecyficznej eliminacji produktów zmutowanych
genów.

Terapia

Terapia



Celem

allelospecyficznego

wyciszenia

ekspresji genu może być albo sam region

powtórzeń, który

różni

się

długością

i

strukturą

RNA

między

normalnym

a

zmutowanym wariantem mRNA, albo jak się
wydaje bardziej odpowiednie do zastosowania
iRNA

miejsca

występowania

polimorfizmu

pojedynczych nukleotydów SNP.