Secondary structure mapping of the influenza virus type A segment 5 vRNA using SHAPE method

Influenza virus type A subtype H5N1 infections are considered to be one of the major public health issues worldwide. New treatment methods and vaccines as well as virus reproduction mechanisms are currently profoundly investigated. A new trend in these studies includes the examination of secondary structure of the viral RNA and its interaction with the replication cycle proteins. The following article describes the most probable secondary structure of the influenza virus segment 5 genomic RNA (A/Viet_Nam/1203/2004 [H5N1] strain). This segment encodes one of the main structural nucleoproteins responsible for vRNP complex and viral RNA interaction as well as polymerase function regulation.

Many techniques of predicting the secondary structure of RNA have been invented. However, experimental methods supported by phylogenetic and bioinformatics studies yielded the best results. These experimental methods include chemical, enzymatic, and microarray mapping as well as NMR and crystallography. In our studies we employed the SHAPE method (selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension) and RNAstructure 5.0 software in order to investigate the secondary structure of the influenza virus segment 5 vRNA. It required obtaining the examined RNA molecule as well as matching its folding conditions. The next step was to design, synthetize, and purify fluorescently-labeled starters necessary for the segment 5 vRNA nucleotides reactivity analysis. Structure mapping procedures were optimized with NMIA (N-methylisatoic anhydride) and reverse transcription starter extension reaction. The reactivity of particular nucleotides in the examined RNA has been determined using the SHAPE method mapping analysis. Given reactivities have been transformed into so-called pseudo-energies, which were then used in the secondary structure model calculations with the RNAstructure 5.0 software. The generated structure unimpeded energy was the lowest possible and its composition was consistent with the experimental data.

Poniższa praca nosi tytuł „Mapowanie struktury drugorzędowej piątego segmentu vRNA wirusa grypy typu A za pomocą metody SHAPE”.

Infekcje ludzi wirusem grypy typu A podtypu H5N1 rozpatrywane są jako jeden z głównych światowych problemów zdrowia publicznego. Trwają badania naukowe mające na celu dogłębne zbadanie mechanizmów cyklu namnażania się tego wirusa oraz opracowanie nowych leków i szczepionek. Nowy nurt tych badań obejmuje poznawanie struktury drugorzędowej wirusowego RNA i oddziaływań z białkami biorącymi udział w cyklu replikacyjnym. W niżej przedstawionej pracy określono najbardziej prawdopodobną strukturę drugorzędową piątego segmentu genomowego RNA (vRNA) wirusa grypy szczepu A/Viet_Nam/1203/2004(H5N1). Segment ten koduje główne białko strukturalne wirusa - nukleoproteinę, odpowiedzialną za tworzenie kompleksów vRNP z wirusowym RNA i regulację funkcji wirusowej polimerazy.

Istnieje wiele metod określania i przewidywania struktury drugorzędowej RNA. Najlepsze rezultaty dają metody eksperymentalne wsparte badaniami filogenetycznymi i bioinformatycznymi opartymi na właściwościach termodynamicznych RNA. Z metod doświadczalnych stosuje się między innymi mapowanie chemiczne lub za pomocą enzymów, mikromacierzowe oraz NMR i krystalografię. W niniejszej pracy zastosowano metodę SHAPE (selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension) oraz program RNAstructure 5.0 do zaproponowania struktury drugorzędowej piątego segmentu vRNA wirusa grypy. Wymagało to otrzymania badanej cząsteczki RNA i dobrania warunków jej fałdowania. Następnie zaprojektowano, zsyntetyzowano i oczyszczono fluorescencyjnie znakowane startery potrzebne w metodzie SHAPE do analizy reaktywności nukleotydów segmentu piątego vRNA. Zoptymalizowano procedury mapowania struktury za pomocą NMIA (bezwodnik kwasu N-metyloizatoinowego) oraz reakcji wydłużania starterów w odwrotnej transkrypcji stosowane w tej metodzie. Na podstawie analizy mapowania metodą SHAPE określono reaktywność poszczególnych nukleotydów badanego RNA. W następnym etapie reaktywności przeliczono na tzw. pseudoenergie, których użyto w przewidywaniu struktury drugorzędowej za pomocą programu RNAstructure 5.0. Wygenerowana struktura była strukturą o najniższej energii swobodnej, zgodną jednocześnie z danymi ekperymentalnymi.