Sprawozdanie

Czynniki warunkujące aktywność enzymów na przykładzie fosfatazy kwaśnej

1.Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie reakcji, które pokażą jak wpływają czynniki, takie jak: stężenie enzymu, stężenie jonów wodorowych oraz inhibitory, na szybkość reakcji enzymatycznych. Doświadczenia będziemy przeprowadzać na fosfatazie kwaśnej.

2. Wstęp teoretyczny:

Fosfataza kwaśna – „enzym znacznikowy” lizosomów, głównego miejsca trawienia wewnątrzkomórkowego. Fosfatazy to grupa enzymów należących do klasy hydrolaz (klasa 3 – obejmuje enzymy rozszczepiające wiązania z udziałem cząsteczki wody), podklasy enzymów hydrolizujących wiązania estrowe (esterazy).

Enzymy te katalizują odszczepienie reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców,

nukleotydów i wielu innych naturalnych estrów kwasu fosforowego według poniższej reakcji:

R-O-PO₃H¯ + H₂O R-OH + H₂PO₄

¯

Poza naturalnymi substratami, hydrolazy monoestrów fosforanowych rozszczepiają także estry fosforanowe fenoli, np. p-nitrofenylofosforan.

Fosfatazy kwaśne działają z optymalnym pH w zakresie w zakresie 4,5 – 7,0.

Enzymy są grupą związków o szczególnie dużym znaczeniu biologicznym. Pełnią w organizmie funkcje katalityczne i dlatego nazywa się je biokatalizatorami. Są to substancje białkowe wytwarzane przez organizmy żywe, które katalizują, czyli przyśpieszają przebieg wszystkich reakcji w organizmie. Reakcje katalizowane enzymatycznie są zazwyczaj połączone w ciągi tak, że produkt jednej reakcji staje się substratem, czyli materiałem wyjściowym dla reakcji następnej. Te długie szlaki reakcji są ze sobą połączone i dzięki nim komórka może żyć, rosnąć i podlegać reprodukcji. Tak, więc enzymy są niezbędne do życia. Brak jakiegoś z nich w organizmie prowadzi do zakłóceń w jego prawidłowym funkcjonowaniu.

Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych:

1. temperatura - wzrost temperatury powoduje wzrost szybkości reakcji enzymatycznych (reguła van't Hoffa). W temperaturze powyżej 37 - 40⁰C dochodzi do spadku reakcji związanej z denaturacją termiczną białka enzymatycznego. Optimum około 38⁰C jest typowe dla większości enzymów, choć są enzymy działające w temperaturze 70 - 80⁰C są to np. bakterie żyjące w gorących źródłach.

2. pH środowiska - jest różne dla różnych enzymów np. kwaśne dla pepsyny, obojętne dla amylazy ślinowej, zasadowe dla trypsyny. Niewielkie odchylenie od optimum może prowadzić do zmniejszenie szybkości reakcji, a duże odchylenie może prowadzić do denaturacji białka enzymu i utraty aktywności.

3. stężenie substratu - szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężenia substratu, tak, więc stężenie enzymu jest stałe a zmienia się tylko stężenie substratu, pozostałe czynniki są optymalne dla danego enzymu. Szybkość reakcji rośnie wraz ze wzrostem stężenia substratu, osiągając przy pewnym stężeniu substratu maksymalny poziom. Dalszy wzrost stężenia substratu nie może powodować zwiększenia szybkości reakcji, ponieważ wszystkie dostępne centra aktywne enzymu zostały wysycone substratem.

4. inhibitory - na szybkość reakcji enzymatycznej wpływają związki określane, jako inhibitory, które hamują aktywność enzymów. Hamowanie, czyli inaczej inhibicja może być procesem nieodwracalnym lub odwracalnym. Przy hamowaniu nieodwracalnym inhibitor łączy się z enzymem tworząc kompleks enzym - inhibitor, przez co enzym traci swoją aktywność. Hamowanie odwracalne polega na tym, że inhibitor o strukturze przestrzennej zbliżonej do struktury substratu wiąże się w centrum aktywnym enzymu uniemożliwiając wiązanie substratu lub inhibitor wpływa na centrum aktywne w ten sposób, że substrat jest wiązany, ale dalsza reakcja zostaje zahamowana.

3. Ćwiczenie

A. Wpływ stężenia enzymu na szybkość przebiegu reakcji

ilość enzymu w 2 ml roztworu (stężenie)	absorbancja	szybkość v0 [μmol p-NPxmin^-1]
0	0	0
0,25	0,329	0,0789
0,50	0,513	0,1230
0,75	0,718	0,1722
1,00	0,866	0,2077

Obliczenia szybkości reakcji:

1. v₀=0,329/0,002*139*15=0,0789 μmol p-NPxmin^-1

2. v₀=0,513/0,002*139*15=0,1230 μmol p-NPxmin^-1

3. v₀=0,718/0,002*139*15=0,1722 μmol p-NPxmin-¹

4. v₀=0,866/0,002*139*15=0,2077 μmol p-NPxmin^-1

B. Wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznych

pH	Absorbancja	szybkość v0 [μmol p-NPxmin^-1]
4	0,098	0,0235
5,5	0,272	0,0652
6	0,128	0,0307
8	0,055	0,0132

1. v₀=0,098/0,002*139*15=0,0235 μmol p-NPxmin^-1

2. v₀=0,272/0,002*139*15=0,0652 μmol p-NPxmin^-1

3. v₀=0,128/0,002*139*15=0,0307 μmol p-NPxmin^-1

4. v₀=0,055/0,002*139*15=0,0132 μmol p-NPxmin^-1

C. Inhibicja aktywności enzymów

Enzym	Absorbancja	szybkość reakcji
Bez inhibitora	0,107	0,0257
Z inhibitorem	0,086	0,0206

1. v₀=0,107/0,002*139*15=0,0257 μmol p-NPxmin^-1

2. v₀=0,086/0,002*139*15=0,0206 μmol p-NPxmin^-1

0,0257 — 100%

0,0206 — x%

x%= 0,0206*100%/0,0257=80%

4. Wnioski

Wykonane ćwiczenia pozwoliły nam zobaczyć, jaki wpływ mają różne czynniki na reakcje enzymatyczne. Można zauważyć, że wraz ze wzrostem stężenia enzymu wzrastała szybkość reakcji. Ważne jednak jest by w reakcji była stała ilość substratu, z którym reaguje enzym. Jeżeli podczas reakcji zabrakłoby substratu szybkość zamiast rosnąć wraz ze wzrostem enzymu zaczęłaby spadać.

Kolejnym wnioskiem, jaki nasuwa się po wykonaniu ćwiczeń jest to, jak duży wpływ ma prawidłowe pH środowiska roztworu dla reakcji. Jeżeli pH jest zbyt niskie lub zbyt wysokie następuje spadek szybkości reakcji. Może również nastąpić denaturacja białka enzymu.

Bardzo duży wpływ na reakcję enzymatyczną ma obecność inhibitorów. Po wykonaniu dwóch prób okazało się, że w probówce, która zawierała inhibitor reakcja była o 20% wolniejsza niż w probówce bez inhibitora.

Błędy w obliczeniach mogły wynikać z:

1. Mało dokładnego pipetowania,

2. Krótkiego czasu ogrzewania,

3. Zanieczyszczeń, jakie mogły znajdować się w probówkach.