Sprawozdanie
Temat: Aktywność enzymatyczna.
Zadanie 1
Materiały:
Wyciąg z ziemniaków
0,1 M bufor fosforanowy (pH=7,4)
0.3% r-r pirokatechiny
Wykonanie:
Do 4 ponumerowanych probówek dodać po 3 ml wyciągu z ziemniaka.
Próbkę nr 3 wstawić na 5 min. do wrzącej łaźni wodnej, a następnie oziębić.
Do wszystkich probówek odmierzyć podane w tabeli ilości buforu fosforanowego i roztworu pirokatechiny lub wody.
Zawartość wszystkich probówek zmieszać i pozostawić na 30 minut.
Co kilka minut probówki nr 1-3 mocno wstrząsnąć, próbę nr 4 pozostawić bez wstrząsania.
Wyniki:
Probówka 1 kolor: jasno brązowy
Probówka 2 kolor: mętny
Probówka 3 kolor: mętny
Probówka 4 kolor: jasno brązowy
Wnioski:
Substratem tej reakcji jest pirokatechina, która jest trawiona przez enzymy pochodzące z wyciągu z ziemniaka. Świadczy o tym wykonana próba nr 1 i uzyskane jej brązowe zabarwienie w całym roztworze. W probówce 2 znajdowała się próba kontrolna (bez pirokatechiny, czyli substratu), ponieważ zamiast pirokatechiny dodaliśmy tu wodę. Wykonana próba miała na celu pokazać, która substancja jest substratem. W tej próbie nie został rozłożony substrat a roztwór się odbarwił. Odbarwienie roztworu obserwujemy także w próbie nr 3, ponieważ wyciąg z ziemniaka został uprzednio zagotowany i substrat nie mógł zostać strawiony. Natomiast próba nr 4 pokazuje wpływ dostępu tlenu na wydajność reakcji. Niestety nie udało się nam otrzymać pożądanego wyniku, mogło to być spowodowane ruchem stojaka na probówki(probówka nie powinna być poruszana). Prawidłowo wykonana próba powinna przyjąć zabarwienie roztworu brązowe, ale ciemniejsze u góry(ciemnobrązowa obwódka), gdzie bez wstrząsania (ograniczenie dostępu tlenu) mógł dojść tlen. Czyli reakcja z tlenem jest wydajniejsza.
Zadanie 2. Próba benzydynowa
Materiały:
Wyciąg z ziemniaków
Odczynnik benzydynowy
Próba benzydynowa – próba służąca do wykrywania enzymu peroksydazy, która jest katalizatorem utleniania nadtlenkiem wodoru różnych substratów (tu odczynnika benzydynowego, który pod działaniem utleniaczy daje błękitny wielocząsteczkowy produkt o złożonej budowie). W obecności peroksydaz utlenianie przebiega bardzo szybko.
Wykonanie:
Do dwóch ponumerowanych probówek wlać po 1 ml wyciągu z ziemniaka.
Jedną probówkę włożyć do łaźni wodnej i zagotować wyciąg z ziemniaka, później go schłodzić.
Do wyciągu z ziemniaka w każdej probówce dodać kilka kropel świeżo przygotowanego odczynnika benzydynowego.
Wyniki:
Wyciąg z ziemniaka, który nie był uprzednio zagotowany, po dodaniu odczynnika benzydynowego zmienia barwę na granatowo – niebieską. Wyciąg z ziemniaka, który był wcześniej zagotowany i następnie schłodzony nie zmienia barwy po dodaniu odczynnika benzydynowego.
Wnioski:
W wywarze ziemniaka, który nie był wcześniej zagotowany są enzymy peroksydazy. Po dodaniu do wywaru odczynnika benzydynowego w wyniku działania peroksydaz powstaje granatowo – niebieski produkt. W probówce z wywarem, który był wcześniej zagotowany w wyniku działania wysokiej temperatury enzymy zostały zniszczone i po dodaniu odczynnika benzydynowego roztwór nie zmienia barwy.
Zadanie 3. β-amylaza z nasion zbożowych
Materiały:
Wyciąg z nasion
płyn Lugola
0,5% r-r skrobi
odczynnik Benedicta
Metody wykorzystane w doświadczeniu:
Próba Benedicta - reakcja chemiczna, która służy do wykrywania cukrów redukujących. Odczynnik Benedicta dodaje się do roztworu i doprowadza do wrzenia. Duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu tlenku miedzi (I), mniejsze żółtego osadu. Odczynnik Benedicta to mieszanina siarczanu (VI) miedzi (II) i przesączonej mieszaniny uwodnionego cytrynianu sodu z uwodnionym węglanem sodu.
Próba Lugola - płyn Lugola to wodny roztwór jodu z jodkiem potasu, który służy do wykrywania skrobi. Dodany do płynów zawierających skrobię zmienia ich barwę na fioletowoczarną, przy niewielkich stężeniach na niebieskofioletową.
Wykonanie:
Do 6 ponumerowanych probówek wlać po 0,7 ml wody i 1 ml r-ru skrobi.
Do probówki nr 1 dodać 0,3 ml zagotowanego i oziębionego wyciągu z nasion.
Do pozostałych dodać po 0,3 ml niezagotowanego wyciągu z nasion i wymieszać.
Probówki nr 2 nie inkubować od razu wstawić( do wrzącej łaźni wodnej na ok 5 minut)
Pozostałe probówki wstawić do łaźni o temp. 37ºC na czas podany w tabelce.
Następnie wszystkie probówki zagotować we wrzącej łaźni wodnej (ok 5 minut).
Oziębić, zawartość każdej z probówek i podzielić na 2 równe części.
W jednej przeprowadzić próbę Benedicta, a w drugiej próbę Lugola.
Wyniki:
| Numer próby | Czas inkubacji (min) | Próba Benedicta | Próba Lugola |
|---|---|---|---|
| 1 | 30 | Lazurowy roztwór | granatowe zabarwienie |
| 2 | 0 | Niebieskie zabarwienie | jasnoniebieskie zabarwienie |
| 3 | 5 | Zielono-niebieskie zabarwienie | jasnoniebieskie zabarwienie |
| 4 | 10 | Zielono-niebieskie zabarwienie | grantowe zabarwienie |
| 5 | 20 | Zielono-niebieskie zabarwienie | granatowe zabarwienie |
| 6 | 30 | Zielono-niebieskie zabarwienie | granatowe zabarwienie |
Wnioski:
Substratem tej reakcji jest enzym β-amylaza pochodząca z nasion zbożowych. Próbę Lugola wykonujemy w tym doświadczeniu, aby zbadać zawartość skrobi, natomiast próbę Benedicta, aby sprawdzić obecność cukrów redukujących w roztworze, pochodzących z rozkładu skrobi. Te probówki, które miały najdłuższy czas inkubowania powinny dać ujemną próbę Lugola, a te co najkrócej – dodatnią. Wynika z tego ,iż w probówkach najdłużej inkubowanych nie jest wykrywana już skrobia, bądź są to jej śladowe ilości. Jest to poprawne stwierdzenie, gdyż wtedy enzymy pochodzące z wyciągu z nasion miały więcej czasu na działanie i rozłożenie skrobi przed ich denaturacją po zagotowaniu. W wykonanym doświadczeniu założenia dotyczące próby Benedicta potwierdziły się. Jednak podczas wykonywania próby Lugola tylko w probówce nr 2 i 3 powstał jasny roztwór, a w pozostałych widoczne było granatowe zabarwienie, taka rozbieżność może wynikać z powodu dodania za dużej ilości płynu Lugola do badanego roztworu. Wykonane reakcje i otrzymane wyniki porównujemy z próbą kontrolną, którą w tym przypadku jest probówka nr 1. Roztwór był zagotowany bez wcześniejszej inkubacji, enzymy nie miały czasu zadziałać przed denaturacją i skrobia nie została rozłożona.
Zadanie 4
Inwertaza z drożdży.
Wstęp:
Inwertaza jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy.
Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo
przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza, podobnie
jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito
cienkie. Inwertaza występuje też w ślinie pszczół i bierze udział w przetwarzaniu cukru z
nektaru kwiatowego do cukrów prostych. Inwertaza działa optymalnie przy pH około 4,7 (aktywna jest w szerokim kwasowym zakresie pH od 4 do 6; przy pH 2 i 9 enzym jest praktycznie nieaktywny).
Materiały:
R-r inwertazy
Bufor octanowy (pH=4,4)
R-r skrobi
R-r sacharozy
Odczynnik Benedicta
Wykonanie:
Do 4 ponumerowanych probówek odmierzyć podane w tabeli ilości enzymu, wody, buforu octanowego, r-ru skrobi, r-ru sacharozy.
Probówkę nr 4 z roztworem enzymu zagotować przed dodaniem pozostałych składników.
Probówki z próbami inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
Po tym czasie zawartość probówek zobojętnić roztworem węglanu sodu (sprawdzając odczyn papierkiem lakmusowym).
Na zobojętnionych próbach wykonać próbę Benedicta.
Wyniki:
W probówce 3 wynik pozytywny, kolor brunatnozielony, powstał czerwony osad.
W probówkach 1,2 i 4 wynik negatywny próby Benedicta.
Wnioski:
Do każdej probówki dodaliśmy enzym z drożdży oraz bufor octowy o pH 4,4 ponieważ nasz enzym działa w środowisku kwasowym o pH ok 4,7. Probówka 1 jest naszą próbą kontrolną, do której dodaliśmy tylko wodę. I tu jak można się było spodziewać żadna zmiana nie zaszła.
Do probówki 2 oprócz enzymu i buforu dodaliśmy skrobię jednak i tu wynik próby Benedicta wyszedł negatywny ponieważ skrobia jest polisacharydem, na który inwertaza nie działa.
W probówce 3 wynik był pozytywny, ponieważ inwertaza rozłożyła sacharozę na glukozę i fruktozę, czyli cukry redukujące, które wykrywa próba Benedicta.
W probówce 4 enzym został zagotowany, co spowodowało jego denaturację, dlatego pomimo dodania sacharozy próba Benedicta nie powiodła się. Nieaktywny enzym nie mógł rozłożyć sacharozy do cukrów redukujących.