Znaczenie białka
-źródło aminokwasów dla organizmów ludzi i zwierząt
-wyznacznik wartości odżywczej

Oznaczanie białek na podstawie zawartości azotu

- możliwe ilościowe oznaczenie białek na podstawie zawartości azotu (przeciętnie mają go 16%) jeśli produkty nie zawierają innych związków azotowych lub zawierają ich niewiele
-określoną ilość azotu należy pomnożyć przez odpowiedni współczynnik aby uzyskać zawartość białka w próbie
dla białek o 16% zawartości azotu współczynnik wynosi 6,25

Metoda Kjeldahla
-najczęściej stosowana metoda oznaczania azotu ogólnego
-pośrednia do oznaczania Białką
-metoda odwoławcza
-tą metodą może być oznaczany azot pochodzący z jonów amonowych oraz związków (…)

-przebiega w 3 etapach:

1. mineralizacja próbki
   -polega na mineralizacji badanej substancji we wrzącym kwasie siarkowym w wyniku czego białka ulegają utlenieniu do C02 i H20
   >rozkład kwasu siarkowego z uwolnieniem tlenu
   >utlenienie substancji organicznych z uwolnieniem dwutlenku węgla wody i amoniaku
   >przechodzenie amoniaku w siarczan amonowy

2. destylacja amoniaku z parą wodną
   -azot grup aminowych białek uwalnia się w postaci amoniaku i wiąże z kwasem siarkowym
   -po zalkalizowaniu próbki amoniak oddestylowuje się do kwasu borowego
   >odbywa się w warunkach podwyższonej temperatury i nadmiaru zasady
   >wydzielony amoniak jest wiązany w nadmiarze kwasu borowego

3. miareczkowanie
   -odmiareczkowuje mianowanym roztworem kwasu solnego lub siarkowego
   > 1mol HCl=1 mol N=14g N
   >1cm3 HCl (o stężeniu 0,1mol *dm-3)= 0,0014g N

Metoda Sorensa (miareczkowania for molowego)
-oparta na zablokowaniu grup aminowych aminokwasów aldehydem mrówkowym
-w wyniku czego aminokwasy tracą swoje właściwości
-grupa karboksylowa zostaje odblokowana i może być miareczkowana mianowanym roztworem wodorotlenku sodu
-liczba uwolnionych grup karboksylowych jest równoważna liczbie związanych z formaldehydem grup aminowych

Metody kolorymetryczne

1. Oparte na wbudowywaniu barwników
   -polega na ilościowym wbudowaniu do białek barwników organicznych dodanych w nadmiarze
   -powstałe nierozpuszczalne kompleksy mogą być odwirowane lub oddzielone przez sączenie od reszty roztworu
   -mierzy się natężenie barwy pozostałego roztworu ,zależne od ilości barwnika niezwiązanego z białkiem, które jest odwrotnie proporcjonalne do ilości białka w badanej próbce

2. Biuretowa
   -polega na oznaczeniu białek i peptydów zawierających co najmniej dwa wiązania peptydowe, które tworzą w środowisku alkalicznym barwne kompleksy z jonami miedzi
   -stężenie białka jest proporcjonalne do natężenia fiołkowego zabarwienia roztworu, którego absorpcję mierzy się przy długości fali 540nm

3. Lowrego
   -w pierwszej fazie polega na wywołaniu reakcji biuretowej
   -po czym redukcji kwasów fosforowolframowego i fosforomolibdenowego (odczynnika Folina-Cicalteu0 do odpowiednich tlenków przez miedź związaną z białkiem oraz tyrozynę i tryptofan
   -zawarte w białku absorbancję powstałego niebieskiego roztworu mierzy się przy 750nm

4. Metoda immunoenzymatyczna (ELISA)
   -polega na tworzeniu połączeń specyficznych przeciwciał z oznaczanym białkiem oraz odpowiednim enzymem, który reagując z bezbarwnym substratem, przeprowadza go w barwny związek
   -natężenie barwy oznacza się spektrofotometrycznie przez porównanie z roztworem wzorcowym
   -metoda ta pozwala na oznaczenie zawartości białek i stopnia ich denaturacji

Mineralizacja na mokro
- do naczynia należy pobrać próbkę o zawartości 0,02 g azotu, czyli naważkę rzędu 0,5-1,5g
-próbkę produktu odważyć na papierek bezazotowy z dokładnością do 0,001g
-wprowadzić naważkę do kolby Kjeldahla, dodając katalizator 5cm3 30-procentowego roztworu perhydrolu i 15cm3 stężonego kwasu siarkowego
> perhydrol: czynnik utleniający, przyspiesza proces spalania, zapobiega stratom azotu
>katalizator (sole miedzi, selenu): przenoszą tlen z kwasu siarkowego na substancję organiczną
> substancje podwyższające temperaturę wrzenia: skracają czas mineralizacji
>kwas siarkowy: główny czynnik utleniający, warunkuje odpowiednią temperaturę spalania

-niezbędne przygotowanie próbki ślepej dla zestawu odczynników
-kolbę Kjeldahla wraz z zawartością umieścić nad płomieniem palnika, łagodnie ogrzewać do momentu przestania pienienia się próbki
-wylot kolby zamknąć szklaną chłodniczką napełnioną wodą (zapobiega parowaniu kwasu)
-zwiększyć ogrzewanie i prowadzić mineralizacje do mementu gdy zawartość kolby będzie klarowna
-spalanie prowadzić pod wyciągiem
-po mineralizacji ostudzić próbkę
-próbkę rozcieńczyć 5cm3 wody destylowanej i przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 100cm3
-kolbę Kjeldahla popłukać 3-4 krotnie małymi porcjami wody destylowanej
-przenosić roztwór do kolby miarowej
-kolbę uzupełnić do 100cm3 wodą destylowaną (roztwór podstawowy)

destylacja amoniaku
-prowadzi się w aparacie Parnas-Wagnera
>wskaźnik Tashiro: podczas oddestylowania amoniaku zmienia barwę z fiołkowej na zieloną wynik powstania soli słabego kwasu i silniejszej zasady tworzy z kwasem borowym układ buforowym, co powoduje gwałtowny wzrost pH roztworu z 5,0 do ponad 6,0

miareczkowanie
-miareczkowanie destylatu z roztworem HCl wobec wskaźnika Tashiro
-zmiana zabarwienia z zielonej na fiołkową wskazuje koniec miareczkowania