Genetyka drobnoustrojów

System R/M (restrykcji/modyfikacji)

Ochrona bakterii, zapobiega włączeniu obcego DNA do genomu

• Restrykcja (endonukleazy)

• Modyfikacja (metylazy)

Endonukleaza – hydrolizuje wiązania fosfodiestrowe w obrębie specyficznej sekwencji niemetylowanego DNA lub w ich sąsiedztwie (kontynuują egzonukleazy)

Metylotransferaza – modyfikuje je przez przyłączenie do reszty adeniny lub cytozyny grupy metylowej, chroniąc w ten sposób DNA gospodarza przed restrykcją (źródło reszty aminowej – SAM)

DNA gospodarza zostaje zmetylowane, chronione przed restrykcją w przeciwieństwie do DNA, które wnika do komórki na drodze:

• Koniugacji

• Transformacji

• Transdukcji

Obce DNA > replikacja > rekombinacja > restrykcja (degradacja)

System R/M jest specyficzny gatunkowo lub subgatunkowo.

System restrykcji:

• rozpoznaje specyficzną sekwencję DNA, ale przecina w odl. 1000-5000pz od niej (Mg, SAM, ATP)

• rozpoznaje sekwencję i tnie wewnątrz niej lub w pobliżu (Mg)

• rozpoznaje sekwencję i tnie w pobliżu (Mg, ATP)

Restrykcja + modyfikacja:

• dwufunkcyjny kompleks składający się z podjednostek R, M, S (rywalizacja między R i M)

• oddzielne enzymy ( R i M niezależne od siebie enzymy)

• dwufunkcyjny kompleks składający się z podjednostek (R i M działają jednocześnie lub rywalizują)

PLAZMIDY

Geny podstawowe – replikacja

Geny dodatkowe:

• oporność na antybiotyki

• geny wirulencji

• produkcji toksyn

• oporności na metale ciężkie

• metabolizmu węglowodanów

Plazmidy koniugacyjne – duże, mają zdolność przenoszenia się miedzy bakteriami. Mała liczba kopii

Plazmidy niekoniugacyjne – małe, nie przenoszą się samodzielnie, duża liczba kopii

ColE1 (~30kopii):

• oriV – origin replikacji

• oriT – origin dla transferu koniugacyjnego

• mob – mobilizacja (nukleaza)

• rom – kontrola liczby kopii - stabilizuje kompleks RNA-RNA

• colE1 – colicin E1

• imm – oporność na kolicynę

R100 (1-2kopie)

• cat – chloramfenikol

• str – streptomycyna

• sul – sulfonamid

• mer – jony rtęci

• tet – tetracyklina

• repa/oriV – replikacja

• IS1, IS10

• Tn10

ITERONS (kontrola replikacji)

Krótkie (17-22bp) powtarzające się sekwencje

RepA wiąże się do iterons.

Utrzymanie plazmidu w komórkach:

• Aktywna segregacja do komórek potomnych

• Przypadkowa segregacja do komórek

• Podział dimerów i multimetrów

• Śmiertelność post – segregacyjna

Klasyfikacja plazmidów:

• Grupy niezgodności – inne mechanizmy kontroli replikacji, nie mogą współistnieć w tej samej komórce

• Zasięg gospodarza – ColE1 występuje w ograniczonej grupie bakterii, RP4 w gram+ i gram-

• Charakterystyka molekularna

Replikacja DNA

Helikazy – rozwijają nici DNA

Topoizomerazy – stabilizują odcinki jednoniciowe

prymaza – synteza starterów

ligaza – łączy nowo syntetyzowane odcinki

białka wiążące – zapobiegają ponownemu spleceniu się nici DNA

Polimerazy DNA:

• I – synteza nici opóźnionej

• II – sprawdzanie i naprawa

• III – synteza nici wiodącej

BAKTERIE MAJĄ JEDNO MIEJSCE ORI

PRYMOSOM:

• Kompleks białkowy rozpoczynający, kontynuujący replikację DNA przez rozwijanie widełek replik.

• dnaA – białko inicjatorowe

• dnaB – helikaza

• dnaC – inhibitor helikazy

• dnaG – prymaza DNA

1. Przyłączenie białek inicjatorowych do ORIGIN

2. Przyłączenie helikazy do białek inicjatorowych

3. Odłączenie inhibitorów helikazy

4. Helikaza rozplata nić i przyłącza prymazę tworząc starter

5. Primer RNA umożliwia polimerazie DNA rozpoczęcie syntezy łańcucha DNA

Kontrola inicjacji replikacji:

• Miejsca inicjacji replikacji zawierają DNA bogate w pary A=T

• Kontrola inicjacji replikacji poprzez metylację DNA

• W komórkach E. Coli metylowana jest sekwencja GATC

• W miejscu inicjacji replikacji GATC występuje 11x

• Pełna metylacja następuje po 10min od inicjacji

• Metylację katalizuje metylaza

• Metylacja jest drogowskazem naprawy post replikacyjnej.

Reguły Chargaffa:

• A=T

• G≡C

• A+C = G + T

• Ilości A, G, T, C są różne u różnych gatunków

HGT – horyzontalny transfer genów – stabilne przeniesienie informacji genetycznej z jednego organizmu do drugiego, gdzie przekazane geny ulegają utrwaleniu w genomie (koniugacja, transformacja, transdukcja)

Chromosom bakteryjny: (1000x dłuższy od komórki, nukleoid, superhelisa)

• Koliste – większość bakterii

• Liniowe – streptomyces, borrelia (cz. Centralna silnie konserwowana, cz. Brzegowe zróżnicowane, końce TIR

• Koliste i liniowe – agrobacterium

Chromosom bakteryjny:

• ma formę domen (pętle o negatywnym skręci DNA)

• struktura ta jest dynamiczna

• białka histonopodobne:

- HU

- H-NS

- IHF

- Fis

- StpA

- Dps

Z-DNA – lewoskrętna

Enzymy negatywnej superhelisy:

• DNA gyraza – wprowadza skręt negatywny

• Topoizomeraza I – usuwa skręt negatywny

• Topoizomeraza IV – relaksuje DNA

IS – Insertion Sequence Elements:

• Kodują geny wymagane do transpozycji – transpozazy

• Short inverted repeats - IR

• Włączone w miechanizmy zmienności genetycznej – duplikacje inwersje, mobilizacje genów, mutacje

IS 911:

• OrfA – wiąże IR elements – inhibicja transpozycji

• OrfB – aktywacja transpozycji

• orfAB – transpozaza

Fotoreaktywacja – light repair

Mechanizm naprawy DNA działający w świetle o dł. 300-500nm wykorzystujący enzym FOTOLIAZĘ, która przez te fale jest aktywowana. Fotoliaza oddziałuje na dimery pirymidynowe ( głównie tyminy) 240-260nm powstałe pod wpływem światła UV, rozszczepiając je. W obecności światła mechanizm ten działa ciągle, gdy tylko powstają mutacje w DNA. Występuje u E. Coli.

Wycinanie nukleotydów (dark repair) :

• UvrA; ATP – wiążą się w miejscu uszkodzenia

• UvrB – wiąże kompleks UvrA-DNA

• UvrC – nacina DNA 8 nukleotydów powyżej i 4-5 poniżej uszkodzenia

• UvrD (helikaza) – rozdziela nici i uwalnia fragment 12pz

• Polimeraza DNA I – wypełnia przerwę w kierunku 5’ > 3’

• Ligaza – łączy nici

BER – usuwanie zasad – AP repair:

1. Mutacja powodująca deaminację cytozyny > uracyl

2. Rozpoznanie uracylu przez N – glikozylazę > hydroliza wiązania N-glikozydowego pomiędzy uszkodzoną zasadą a deoksyrybozą (miejsce apurynowe AP)

3. Endonukleaza rozpoznaje miejsce AP, nacina DNA, usuwa fosforan deoksyrybozy

4. Luka w DNA jest uzupełniana przez polimerazę I DNA

5. Łączenie nici za pomocą ligazy

MMR – naprawa błędnie syntetyzowanych zasad (dot. Błędów replikacji)

U bakterii nić matrycowa jest metylowana

• Mut H – rozpoznaje w metylacji, tnie nić sparowaną

• Mut S – wykrywa brak komplementarności

• Mut L – nie określono funkcji

• Mut U – helikaza II

• Polimeraza III

• Ligaza

System SOS – naprawa z błędami

System jest odpowiedzią na liczne uszkodzenia zagrażające jej życiu.

Włączany jako ostatni system naprawy

Regulon SOS:

• LexA – autoregulacja, represor 18 genów, odpowiada za represję genów naprawionych. W stanie nieindukowanym LexA przyłącza się do regionów operatorowych genów naprawy (w tym do własnego genu LexA) hamując ich transkrypcję. W tym stanie dzięki represji własnego genu LexA jest w komórce w niskich stężeniu i nie wystarcza go do całkowitego wstrzymania transkrypcji genów odpowiadających za enzymy naprawcze.

• RecA – właściwości naprawcze i rekombinacyjne. Przy obecności mutagenów zmienia właściwości na proteolityczne degradując cząsteczki LexA i przyczynia się do derepresji genów naprawczych (liczne uszkodzenia DNA)

Z każdej populacji bakterii można wyizolować klony o zwiększonej częstości mutacji. Zwiększona częstość mutacji wiąże się z defektem MMR (mutS i mutL)

Mutatorowa teoria ewolucji dostosowanie – większa częstość mutacji = łatwiejsze dostosowanie do środowiska.

OPERON – grupa sekwencji kodujących białka będących pod kontrolą tego samego promotora transkrypcji.

Wszystkie kodony białek operonu znajdują się na tym samym mRNA

Operon = operator + geny strukturalne

Regulon – jednostka informacji genetycznej – grupa operonów regulowanych przez jedno białko aktywator/represor. Kodowane przez gen regulatorowy

RYBOSOM

Procaryota i mitochondria 50S+30S = 70S

Eucaryota 60S+40S = 80S

mRNA eucaryota – 5’cap 3’polyA koduje jedno białko

BAKTERIOFAGI:

• Pożeracze bakterii

• Wirusy pasożytujące na bakteriach

• Budowa: białka i kwas nukleinowy

• Przyłączają się do specyficznych receptorów i wstrzykują kwas nukleinowy do wnętrza komórki

• Zazwyczaj zabijają zainfekowane bakterie

• Rzadko mogą przenosić bakteryjny DNA

• Wykorzystywane w inżynierii genetycznej

Genom fagów:

• Geny wczesne

- ekspresja natychmiast po wniknięciu do bakterii

- wykorzystany jest aparat ekspresyjny gospodarza

- kodują białka niezbędne do replikacji fagowego genomu

• Geny późne

- kodują specyficzne białka fagowe

1. Jednoniciowy kolisty DNA – M13, oX174

2. Dwuniciowy liniowy DNA – lambda i T4

3. RNA – MS2

OX174:

• Jednoniciowy kolisty DNA

• 11 białek

• 2330 aa

• Wykorzystane trzy ramki odczytu

M13:

• Jednoniciowy kolisty DNA

• Wiriony o strukturze długiej nici

• Infekuje tylko komórki F+

• Uwalnia się z komórki bez lizy

• Białko wirionów polimeryzuje wokół ssDNA w trakcie przechodzenia faga przez błonę komórkową

MS2:

• Specyficzny dla F+

• Jednoniciowy RNA, nić kodująca

• 3 geny

• Białka: coat protein, maturation protein, replicase

T4:

• Dwuniciowy liniowy DNA

• Replikacja liniowego genomu

Ekspresja genów T4:

• Early genes – transkrybowane przez bakteryjną RNApol

• Middle genes – transkrybowane przez bakteryjną RNApol. Brak promotora bakteryjnego, dwa białka fagowe tworzą kompleks z E. Coli RNApol

• Late genes – transkrybowane przez modyfikowaną E. coli RNApol

Lambda:

• Liniowy dwuniciowy DNA

• Genom – końce cos

• Replikacja kolistego genomu

• Często integruje z genomem gospodarza

P1:

• Liniowy dwuniciowy DNA

• Cykl życiowy jak lambda

• Rzadko integruje z genomem gospodarza

Białka kapsydu:

• Pojedyncze białko polimeryzujące wokół kwasu nukleinowego – M13

• Białka tworzące pusty kapsyd – Ms2

• Kapsydy wielobiałkowe – lambda, T4

Naturalna transformacja

Występuje u:

• Streptococcus pneumoniae

• Bacillus subtilis

• Haemophilus influenzae

• Neisseria gonorrhoeae

Gatunkowo specyficzny mechanizm

Kompetencja w późnej fazie log

Wymagana duża gęstość komórek

Mechanizm transformacji

Integracja i replikacja DNA dawcy jest możliwa tylko poprzez rekombinację.

Transformacja plazmidów:

• Kompetencja chemicznie indukowana

• Elektroporacja

Mechanizm koniugacji:

• Budowa pili jest specyficzna dla plazmidu

• Bakterie gram+ nie mają pili