Sprawozdanie

Molekularna organizacja komórki

III rok Biotechnologii

Cel: Frakcjonowanie komórek wątroby kury.

Kierownik ćwiczeń:
dr Agnieszka Biernatowska

Sprawozdanie wykonane przez:

Jakub Szymczyk

Kamil Senderowski

Natalia Domagała

Natalia Matczyńska

Weronika Gajdzik

Joanna Ligas

Joanna Lis

Agnieszka Kordylewska

Tomasz Kościelecki

1. Wstęp teoretyczny

Homogenizacja – proces polegający na wytworzeniu jednorodnej mieszaniny ze składników, które w normalnych warunkach nie mieszają się ze sobą. Wyodrębnienie poszczególnych struktur subkomórkowych rozpoczyna się od rozdrobnienia badanego materiału i homogenizacji w odpowiednim środowisku - roztworze homogenizacyjnym. W pozyskiwaniu nieuszkodzonych organelli używa się roztworu izotonicznego tzn. takiego, którego ciśnienie osmotyczne jest równe ciśnieniu osmotycznemu wewnątrz komórki. W roztworach hipotonicznych organelle wchłaniają wodę i pękają, natomiast w roztworach hipertonicznych kurczą się. Natomiast niska temperatura pozwala na fragmentację tkanki zachowując integralność błon, które mogłyby ulec uszkodzeniu z powodu ciepła wytwarzanego na skutek siły tarcia. Podczas ćwiczeń do homogenizacji posłużono się homogenizatorem Pottera.

Mikrosomy - drobne pęcherzyki powstające w wyniku zamykania się fragmentów błon komórki poddanej homogenizacji, są to głównie pęcherzyki powstałe z błon retikulum endoplazmatycznego.

Markery struktur komórkowych - markerem nazywamy taką substancję, najczęściej enzym, który jest charakterystyczny dla danej struktury, czy też funkcji komórkowej. W naszym doświadczeniu, markerem była glukozo-6-fosfataza, będąca enzymem charakterystycznym dla izolowanych mikrosomów.

Glukozo-6-fosfataza - białko błonowe związane z błoną retikulum endoplazmatycznego. Katalizuje reakcję odczepienia cząsteczki fosforanu od glukozo-6-fosforanu w wyniku której powstaje glukoza oraz cząsteczka wody. Jest to reakcja szlaku glukoneogenezy zachodzącej głównie w wątrobie, dlatego też narząd ten wykorzystaliśmy podczas ćwiczeń.

1. Postępowanie:

Całość eksperymentu przeprowadzono zgodnie z instrukcją do ćwiczeń.

1. Preparacja

1. Otrzymaną od prowadzącego wątrobę kurzą zhomogenizowano w zlewce wypełnionej buforem (0.25M sacharoza z EDTA) izotonicznym, który zapewniał utrzymanie pH równemu wnętrzu komórki. Odpowiednia pojemność buforowa zapewniała równowagę kwasowo zasadową, natomiast EDTA, który jest chelatorem jonów dwuwartościowych dezaktywował proteazy.

2. Uzyskany homogenat przesączono przez gazę w celu pozbycia się tkanki łącznej.

3. Preparat zwirowano.

4. 1ml homogenatu zachowano do dalszych oznaczeń (preparat 1), pozostały homogenat zwirowano (10min 800*g)

5. Uzyskany osad zawierający jądra komórkowe zawieszono w buforze (j.w) i zachowano do dalszych oznaczeń (preparat 2). Supernatant ponownie odwirowano (20min 16000*g)

6. Uzyskany osad zawieszono w buforze, a następnie ponownie wirowano (20 min 16000*g) uzyskując osad mitochondriów, który ponownie zawieszono w buforze i zachowano do dalszych analiz (preparat 3). Supernatant (preparat 4) zwirowano (40min 105000*g). Osad zawierający mikrosomy (połączony z tłuszczem) oraz supernatant zawierający cytosol zachowano do dalszych analiz (odp. preparat 5 i 6)

1. Oznaczenie białka metodą mikrobiuretową

Ze względu na problemy wynikające najprawdopodobniej z czystości odczynników zmuszeni byliśmy wykorzystać krzywą standardową uzyskaną podczas eksperymentu przeprowadzonego na poprzednich ćwiczeniach. Została ona wykonana analogicznie do tej, której procedura została przedstawiona w skrypcie do ćwiczeń.

Wykres 1 – Krzywa standardowa dla metody mikrobiuretowej.

Posługując się krzywą standardową, obliczono stężenia białka w kolejnych preparatach. Reakcję mikrobiuretową przeprowadzano w dwóch turach, różniących się objętościami dodawanego preparatu. Do dalszych obliczeń wykorzystano wyniki zaznaczone w tabeli 1 kolorem czerwonym.

Próba	Ilość białka/Objętość
	μg/50μl
1	Homogenat
2	Jądra
3	Mitochondria
4	Supernatant
5	Mikrosomy
6	Cytosol

Tabela 1 – Wyniki próby mikrobiuretowej dla poszczególnych preparatów.

Próba V	20μl	50μl
1	0,662	0,833
2	0,424	0,818
3	0,156	0,353
4	0,103	0,161
5	0,171	0,298
6	0,139	0,271

Tabela 2 – Wartości absorbancji z próby mikrobiuretowej
dla poszczególnych preparatów.

1. Oznaczenie aktywności glukozo-6-fosfatazy

Do oznaczenia aktywności glukozo-6-fosfatazy otrzymanych preparatów, w pierwszej kolejności sporządzono krzywą standardową na fosfor.

Wykres 2 – Krzywa standardowa na fosfor.

Sporządzono 0,1 mM roztwór KH₂PO₄, będący analogicznym substratem dla oznaczanego enzymu, glukozo-6-fosfatazy. Stechiometria reakcji rozkładu fosforanu na fosfor nieorganiczny wynosi 1:1. Na tej podstawie obliczono objętości dodawanego roztworu fosforanu oraz masę fosforu w kolejnych próbach użytych do sporządzenia krzywej zgodnie z instrukcją do ćwiczeń.

Oznaczono aktywności enzymatyczne przeprowadzając reakcję na oznaczanie fosforu nieorganicznego, analogiczną do sporządzenia krzywej standardowej. Po zmierzeniu absorbancji przy długości fali równej 820 nm, wyniki zebrano w tabelę.

Preparat	A820 nm
Homogenat	0,950
Jądra	0,126
Mitochondria	0,318
Supernatant	0,106
Mikrosomy	1,013
Cytosol	0,403

Preparat	Objętość preparatu [ml]	Aktywność enzymu [J/ml]	Stężenie białka [mg/ml]	Białko całkowite [mg]	Aktywność całkowita [J]	Aktywność właściwa [J/mg]	Wydajność [%]	Stopień oczyszczenia
Homogenat	21	35,25	0,442	9,282	740,25	79,68	100,00	1,00
Jądra	9	9,675	0,435	3,915	87,075	22,26	11,76	0,29
Mitochondria	5,6	15,625	0,199	1,1144	87,5	78,55	11,82	0,99
Supernatant	9	9,05	0,994	8,946	81,45	91,01	11,00	1,14
Mikrosomy	4	37,175	0,169	0,676	148,7	219,32	20,09	2,75
Cytosol	14,2	18,275	0,156	2,2152	259,505	117,96	35,07	1,48

Tabela 3 – Wyniki absorbancji dla oznaczania fosforu organicznego w kolejnych preparatach.

Używając wcześniej sporządzonej krzywej standardowej na fosfor i wyliczonych stężeń białka w preparatach, oznaczono aktywność enzymatyczną preparatów oraz wykonano bilans preparacji.

Tabela 4 – Bilans preparacji.

1. Wnioski:

Analizując bilans preparacji, można zauważyć, że najwyższą aktywność glukozo-6-fosfatazy wykazuje preparat zawierający mikrosomy. Jest to zgodne z naszymi oczekiwaniami. Ogólnie rzecz biorąc, aktywność powinna być tylko zauważalna w homogenacie, ponieważ znajdują się tam wszystkie organelle komórkowe oraz w mikrosomach, ponieważ właśnie w tych maleńkich pęcherzykach występuje interesujący nas enzym. Niewielkie aktywności w preparatach z jądrami komórkowymi, mitochondriami oraz w supernatancie z odwirowywania mitochondrii mogą wynikać z niedokładnych rozdziałów pelletu od supernatantu przy większości wirowań. Mikrosomy były obecne we wszystkich supernatantach, prócz ostatniego, przy największej sile wirowania, dlatego nawet niewielkie ilości zanieczyszczenia osadu supernatantem, mogły wpłynąć na nieprawidłowe wyniki w aktywnościach. Niedokładność rozdziału poszczególnych struktur mogła być spowodowana również tym, że retikulum endoplazmatyczne wykazuje ciągłość błon i wewnętrznych przestrzeni, w wyniku tego znajduje się blisko innych organelli, jądra czy aparatu Golgiego. Z tego powodu podczas wirowań mogło nie dojść do ich całkowitego rozdziału, dlatego tez poszczególne preparaty wykazują aktywność. W przypadku cytosolu, w którym aktywność całkowita jest nawet większa od aktywności preparatu z mikrosomami, może być spowodowana pobraniem części osadu, w którym znajdowały się mikrosomy do supernatantu lub częściową degradacją mikrosomów i uwolnieniem enzymu do cytosolu. Niemniej jednak aktywność właściwa jest największa dla preparatu z mikrosomami, co potwierdza nasze założenia, pomimo nienajlepszej wydajności preparacji i małego stopnia oczyszczenia, że interesujący nas enzym znajduje się w tych właśnie organellach. Usprawnienie preparacji, m.in. dokładniejsze rozdzielanie osadu od supernatantu, mogłoby być kluczowe w polepszeniu wydajności preparacji oraz w zwiększeniu stopnia oczyszczenia w końcowym etapie, czyli preparacie z mikrosomami, w którym powinno znajdować się najwięcej naszego enzymu.