Sprawozdanie

Molekularna organizacja komórki

III rok Biotechnologii

Cel: Izolacja lizosomów z wątroby kurczaka.

Kierownik ćwiczeń:
dr Agnieszka Biernatowska

Sprawozdanie wykonane przez:

Jakub Szymczyk

Kamil Senderowski

Natalia Domagała

Natalia Matczyńska

Weronika Gajdzik

Joanna Ligas

Joanna Lis

Agnieszka Kordylewska

Tomasz Kościelecki

1. Wstęp teoretyczny

Lizosomy to niewielkie organella występujące w komórkach eukariotycznych. Są to pęcherzyki o średnicy ok. 0,5 – 1μm, otoczone pojedynczą błoną lipidowo – białkową. Zawierają kwaśne hydrolazy rozkładające białka, kwasy nukleinowe, węglowodany i tłuszcze. pH wewnątrz lizosomu ma wartość optymalną dla występujących w nim enzymów, wahającą się w granicach 4,5 – 5,5. Ze względu na aktywność enzymów tylko w takim pH ich przypadkowe wydostanie się do cytoplazmy (pH≈7,2) nie stanowi większego zagrożenia dla komórki. Niskie pH zapewnia wbudowana w błonę lizosomu H⁺-ATPaza, pompująca protony. Główną funkcją tych pęcherzyków jest rozkład pochłoniętych na drodze endocytozy substancji i usuwanie obumarłych części cytoplazmy (trawienie wewnątrzkomórkowe).

Jedną z najważniejszych funkcji wątroby jest detoksykacja organizmu. Niezbędne w tym procesie są enzymy zawarte w lizosomach. Z tego też powodu do preparacji użyliśmy wątroby, ponieważ jej komórki zawierają znacznie większą liczbę lizosomów w porównaniu do innych tkanek.

1. Postępowanie:

Lizosomy izolowaliśmy metodą frakcjonowania – czyli wirowaniem w wzrastającej sile odśrodkowej. Postępowanie zgodnie z instrukcją do ćwiczeń.

1. Izolacja lizosomów:

1. Z całości otrzymanej od prowadzącego wątroby (22,61g) odważono 4,14g do dalszych etapów preparacji.

2. Do homogenizacji użyto 37,2ml buforu homogenizacyjnego, który uprzednio rozcieńczono 5-krotnie.

3. Po każdym etapie frakcjonowania pobierano próbki osadu i supernatantu do dalszych analiz. Osad zawieszano w 0,5ml buforu do zawieszania.

4. Po trzecim wirowaniu do zebranego supernatantu dodano 2,72ml roztworu chlorku wapnia, który zmniejszając aktywność proteaz i powodując wbudowywanie dodatnio naładowanych jonów wapnia w błonę i oddziałując z ujemnie naładowaną fosfatydyloseryną wywołuje zlepianie lizosomów umożliwiając ich oddzielenie od lżejszych elementów znajdujących się w supernatancie.

1. Funkcje składników buforów:

Bufor homogenizacyjny:

1. Tris/HCl – umożliwia utrzymanie stałego pH;

2. EDTA – związek chelatujący jony metali dwuwartościowych (mogą stanowić kofaktory dla enzymów proteolitycznych);

3. Sacharoza – zapewnia odpowiednie ciśnienie osmotyczne ułatwiające pękanie komórek podczas homogenizacji.

Bufor do zawieszania:

1. KCl – Zapewnia odpowiednią siłę jonową;

2. Tris/HCl – j.w.

1. Oznaczanie stopnia oczyszczania lizosomów

Przed każdym oznaczaniem ilości białka i kwaśnej fosfatazy dodano do próbek 55,5μl tritonu X-100, do końcowego stężenia 0,1%. Detergent ten powoduje solubilizacje błon komórkowych. Rozpad błon lizosomów umożliwiał uwolnienie enzymów hydrolitycznych, co było niezbędne do oznaczenia ich aktywności.

1. Oznaczanie stopnia aktywności kwaśnej fosfatazy

Fosfataza kwaśna jest enzymem hydrolitycznym o aktywności fosfatazy, której główna rola polega na katalizowaniu defosforylacji różnych estrów fosforanowych. Optymalne pH do działania fosfatazy mieści się w zakresie od 3,4 do 6,2. Enzym ten jest „enzymem znacznikowym” lizosomów, głównego miejsca trawienia wewnątrzkomórkowego.

W celu oznaczenia stopnia oczyszczenia frakcji lizosomalnej sporządzono krzywą standardową:

1. Oznaczanie białka w preparatach metodą mikrobiuretową.

W celu oznaczenia ilości białka w preparatach sporządzono krzywą standardową według instrukcji do ćwiczeń.

Próba	A330
Homogenat	0,159
Osad 1	0,665
Supernatant 1	0,213
Osad 2	0,533
Supernatant 2	0,153
Osad 3	0,353
Supernatant 3	0,067
Supernatant 4	0,044
Osad 5	0,118
Supernatant 5	0,019

Tabela 1 – Pomiary absorpcji preparatów kolejnych etapów frakcjonowania.

1. Wstęp teoretyczny

Na podstawie równania krzywej standardowej obliczono całkowitą ilość białka w poszczególnych preparatach:

y = 0, 0392x − 0, 034

Przykładowo dla pierwszej próby:

A₃₃₀=0,159, V_p= 10μl , V_c= 33ml

y = 0, 159 = >0, 159 = 0, 0392x − 0, 034 = >x = 4, 923

10μ------------------------ 4,923μg

33 000μl -------------------------– x

x= 16245,9μg= 16,24mg

1. Rezultaty preparacji:

Tabela 2 – Bilans preparacji.

Przykładowe obliczenia dla homogenatu:

$$Stezenie\ bialka = \frac{Calkowita\ ilosc\ bialka}{V_{c}\ proby}$$

16, 24mg ÷ 33ml = 0, 49mg/ml

Aktywnosc calkowita = aktywnosc fosfatazy * V_c proby

11, 2 * 33 = 369, 6J

$$Aktywnosc\ wlasciwa\ \left\lbrack \frac{J}{\text{ml}} \right\rbrack = \frac{Aktywnosc\ calkowita}{V_{c}\ proby}$$

$$\frac{369,6\ J}{33\ ml} = 22,75\ J/ml$$

$$Wydajnosc = \left( \frac{Aktywnosc\ calkowita\ proby}{Aktywnosc\ calkowita\ proby\ 1} \right)*100\%$$

Dla osadu 1:

$$\left( \frac{70}{369,9} \right)*100\% = 18,93\%$$

$$Stopien\ oczyszczenia = \frac{Aktywnosc\ wlasciwa\ proby}{Aktywnosc\ wlasciwa\ homogenatu}$$

Dla osadu 1:

$$\frac{15,96\ J/mg}{22,75\ \ J/mg} = 0,69$$

1. Wnioski:

Analizując bilans preparacji, wyraźnie można dostrzec standardowo spadek wydajności oraz wzrost stopnia oczyszczenia naszego białka. Dalsza analiza ukazała, że homogenat oraz supernatant 1 wykazują podobną wartość aktywności całkowitej. Prawidłowo najwyższą aktywność całkowitą powinien wykazywać homogenat, ponieważ zawiera wszystkie organelle komórkowe (w tym także wszystkie lizosomy), więc prawdopodobnie jest to błąd pipetowania. Porównując kolejne wyniki zauważono, że wyraźnie spada aktywność całkowita w osadzie 2, gdyż przeszła do niego większość dużych organelli m.in. jądra komórkowe, a nieznaczna aktywność może wynikać z osadzania się niewielkiej ilości lizosomów na dnie pod ciężarem tych cięższych organelli (podobnie jak w przypadku osadu 1). Lizosomy natomiast pozostały w supernatancie, którego wartość aktywności całkowitej 480,33 jest wynikiem błędu pipetowania. W osadzie 3 jest nieco wyższa aktywność niż w osadzie 2, gdyż przeszła tam część lizosomów, których większa ilość jest cały czas w supernatancie, co potwierdza aktywność. Na tym etapie pozbyto się mitochondriów, które zostały w osadzie. W osadzie 4 prawidłowo powinny znajdować się lizosomy, gdyż przed wirowaniem dodano CaCl2 co miało spowodować ich zlepienie i oddzielenie od ER, aparatu Golgiego i mikrosomów. Jednak nie pobraliśmy próbki do oznaczeń. W supernatancie 4 widoczny jest spadek aktywności z powodu obecności pękniętych lizosomów. W osadzie 5 niska aktywność wynika prawdopodobnie z utraty lizosomów. Supernatant 5 nie wykazywał żadnej aktywności. Stopień oczyszczenia wydaje się być znikomy. Może to być spowodowane najprawdopodobniej wspomnianym już wcześniej pęknięciu części lizosomów, przez co utracono większą część enzymów, a tym samym spowodowało to duży spadek aktywności właściwej.