Justyna Galińska Gr.1

Data ćwiczeń: 8.01.2015r.

Sprawozdanie

Temat	Przeżyciowe barwienie i obserwacja lizosomów oraz autofagolizosomów w ludzkich fibroblastach przy wykorzystaniu mikroskopii fluorescencyjnej.
Cel ćwiczenia	Obserwacja lizosomów i autofagolizosomów w ludzkich fibroblastach pod wpływem różnych związków chemicznych
Obserwacje	Otrzymaliśmy komórki na płytkach z pożywką. Usunęliśmy pożywkę pipetką a następnie przepłukaliśmy trzy krotnie buforem PBS, aby usunąć resztki pożywki oraz zapobiec wyschnięciu komórek. Użyliśmy w tym celu buforu PBS aby zapewnić komórkom właściwe pH podobne do fizjologicznego. Następnie usunęliśmy resztki buforu i przez okres 5 min barwiliśmy w rozcieńczonym barwniku LysoTracker Green. Po tym czasie usunęliśmy roztwór i ponownie trzykrotnie przepłukaliśmy komórki za pomocą PBS aby usunąć resztki barwnika i uniknąć tym samym jego świecenia podczas obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zawinęliśmy w sreberka aby zapobiec procesowi wyświecania i rozpoczęliśmy etap obserwacji mikroskopowej. Komórki kontrolne - bardzo duża ilość lizosomów, ułożonych w pobliżu jądra. Komórki z DSMO - lizosomy bardzo podobnie pod względem wielkości i ilości do komórek kontrolnych. Komórki z sulforafanem - duże zagęszczenie struktur w rejonach słabo zarysowanego jądra – lizosomy i autofagolizosomy przysłoniły go. Komórki z 10 mikromolową chlorochiną - większe struktury niż w pozostałych próbach. Komórki z 60 mikromolową chlorochiną - jeszcze większy rozmiar lizosomów niż w poprzednich próbach; należało zwiększyć intensywność świecenia z powodu wzrostu zasadowego charakteru. Komórki osoby chorej na mukopolisacharydozę - struktury większe i liczniejsze niż w kontroli, nagromadzone w okolicach jądra.
Wyniki	DSMO nie wpływa na komórki. Sulforafan indukuje autofagię. Chlorochina powoduje delatację lizosomów (rozpulchnianie) i ich kumulację. Wzrost stężenia chlorochiny powoduje wzrost zasadowości. W komórkach chorego na mukopolisacharydozę obserwujemy spichrzanie się lizosomów i autofagolizosomów..
Podsumowanie	Zastosowanie barwników fluorescencyjnych pozwala na obserwację zmian morfologicznych komórki.