LABOLATORIUM Z BIOFIZYKI

Ćwiczenie nr: 3 „Uwalnianie z maści i żeli”

1. Cel doświadczenia.

Porównanie uwalniania DCPIP z roztworu wodnego i zżelowanego przez różne membrany.

1. Wstęp teoretyczny.

Zjawisko dyfuzji polega na przemieszczaniu się cząsteczek z obszaru o wyższej ich koncentracji (ilości cząsteczek przypadającej na jednostkę objętości) do obszaru o niższej koncentracji. Proces ten prowadzi do wyrównywania koncentracji (w roztworach - stężeń) cząsteczek. Przyczyną występowania dyfuzji jest chaotyczny, termiczny ruch cząsteczek. Jeśli w danym obszarze znajduje się więcej cząsteczek aniżeli w jego otoczeniu, to przy chaotycznym ruchu większa ich ilość opuszcza ten obszar aniżeli do niego wchodzi.

Wypadkową ilość cząsteczek (n) przechodzących przez jednostkę powierzchni (S) w jednostce czasu (t) nazywamy strumieniem dyfuzyjnym.


J_D = $\frac{n}{S \bullet t}$ [$\frac{\text{mol}}{m^{2} \bullet s}$] [1]

Spektrofotometria - technika spektroskopowa polegająca na ilościowym pomiarze absorpcji, emisji lub odbicia światła.

Absorpcja – proces pochłaniania energii fali przez substancję. Na skutek absorpcji natężenie światła wiązki przechodzącej przez substancję ulega zmniejszeniu, przy czym część tego osłabienia spowodowania jest również rozpraszaniem światła.

Absorbancja jest miarą absorpcji promieniowania.

1. Sprzęt i materiały:

1. Aparatura

• spektrofotometr Spekol 11

• pipety 5ml

• komory teflonowe do uwalniania

• ependorfy 1,5ml

• zlewki 100ml

• falcony

1. Materiały

• roztwór DCPIP (Cm=5mM)

• aristoflex AVC – substancja żelująca

• 2 membrany z regenerowanej celulozy – 0,45 μm pory

• membrana poliwęglanowa – 0,4 μm pory

• H₂0

1. Opis ćwiczenia.

1. Przebieg pomiarów:

• Przygotowaliśmy komory pomiarowe:

1. 0,5 ml roztworu wodnego DCPIP przykryte membraną celulozową

2. 0,5 ml roztworu wodnego DCPIP przykryte membraną poliwęglanową

3. 0,5 ml roztworu zżelowanego DCPIP przykryte membraną celulozową

• Zanurzyliśmy je w 100ml wody (każdą w osobnej zlewce).

• Następnie zaczynając od czasu t=0, co 7 min pipetą pobieraliśmy 1 ml roztworu ze zlewki ,
  a braki uzupełnialiśmy wodą.

• Badaliśmy absorbancję kolejnych próbek w Spekolu 11.

• Wyniki zostały spisane na załączonym protokole.

1. Przygotowanie krzywej kalibracyjnej:

• Obliczyliśmy, ile wynosiłoby maksymalne stężenie DCPIP w zlewkach -tzn. kiedy cały substrat przedostał się przez membranę

• Liczba moli w 0,5 [ml] DCPIP o stężeniu 5 [mM] równa się 2, 5 • 10⁻⁶,
  więc Cm_max $= \frac{2,5 \bullet 10^{- 6}}{0,1} = 0,025\ \left\lbrack \text{mM} \right\rbrack = 25\ \ \ \lbrack\mu M\rbrack$

• Aby uzyskać takie samo stężenie wlaliśmy 0,125 DCPIP do 25 [ml] wody.

• Następnie rozcieńczaliśmy ten roztwór odlewając połowę płynu do zlewki i uzupełniając braki wodą. W ten sposób uzyskaliśmy 5 próbek o różnych (znanych) stężeniach. Następnie badaliśmy ich absorbancję przy użyciu spektrofotometru.

L.p.	Cm [μM]	A
1	2,5	0,068
2	5,0	0,124
3	10,0	0,142
4	20,0	0,308
5	25,0	0,532

Tabela1. Wyniki absorbancji dla kolejnych próbek kalibracji

• Korzystając z metody regresji liniowej obliczyliśmy wzór krzywej kalibracyjnej.

Wykres 1. Przedstawia zależność stężenia (Cm) od absorbancji (A) danych z Tabeli 1.

• Jest ona wyrażona wzorem:

A= (0,019 ± 0,008)·Cm+(0,02 ± 0,01)

1. Opracowanie wyników:

• Korzystając z tej zależności obliczyliśmy stężenia pobranych wcześniej próbek o nieznanym stężeniu i sporządziliśmy wykresy przedstawiające zależność stężenia uwalnianej substancji od czasu dla każdej z 3 komór pomiarowych.

Próbka 1: roztwór wodny i membrana celulozowa

L.p.	t [min]	Δt [min]	A	ΔA	Cm [μM]	ΔCm [μM]
1	0	0,004	0,056	0,001	2,421053	0,03
2	7		0,061		2,684211
3	14		0,066		2,947368
4	21		0,076		3,473684
5	28		0,106		5,052632
6	35		0,110		5,263158
7	42		0,130		6,315789
8	49		0,140		6,842105

Tabela 2. Opracowane wyniki dla probki 1.

• Obliczenia:

niepewności pomiarowe:

• dla czasu

Δt =Δstopera + Δreakcji człowieka

Δt= 0,01 [s]+ 0,2 [s] = 0,21 [s] = 0,004 [min]

• dla st

ΔCm = ΔC + ΔB + Δt + ΔA = 0,008 + 0,01 + 0,004 + 0,001 = 0,03

ΔC, ΔB – błędy krzywej kalibracyjnej

Cm=(0,098±0,002)t+(1,973±0,001)

• próbka 2 roztwór wodny, membrana poliwęglanowa

tabela 3, próbka 2

t [min]	Δt [min]	A	ΔA	Cm [μM]	ΔCm [μM]
0	0,004	0,036	0,001	1,368421	0,03
7		0,042		1,684211
14		0,08		3,684211
21		0,111		5,315789
28		0,132		6,421053
35		0,167		8,263158
42		0,177		8,789474
49		0,203		10,15789

Cm=(0,19±0,002)t+(1,15±0,02)

• próbka 3 roztwór zżelowany, membrana celulozowa

tabela 4- próbka 3

t [min]	Δt [min]	A	ΔA	Cm [μM]	ΔCm [μM]
0	0,004	0,068	0,001	3,052632	0,03
7		0,041		1,631579
14		0,053		2,263158
21		0,054		2,315789
28		0,055		2,368421
35		0,055		2,368421
42		0,085		3,947368
49		0,071		3,210526

Cm=(0,03±0,001)t+(1,58±0,02)

• Czas po jakim uwolni się całość substancji jest to czas po którym stężenie w zlewce będzie wynosiło 25 μM

1 próbka: t_k=3,92 h

2 próbka: t_k=2,1 h

3 próbka: t_k=13,01 h

przykład obliczeń: dla próbki 2 t_k=(25-1,048)/0,19=126,06 [min]=2,1 h

• Strumien dyfuzji : J=n/S*t

S=3,14cm^2

próbka 1: J=0,52 μmol/m^2*s

próbka 2: J=1,01 μmol/m^2*s

próbka 3: J=0,16 μmol/m^2*s

przykład obliczeń dla próbki 1:

dla t=1 Cm=2,071μM n=0,2071*10^(-6)

dla t=2 Cm = 2,169μM n=0,2169*10^(-6)

J=((0,2169-0,2071)*10^(-6))/0,000314*60=0,52*10^(-6) mol/m^2*s

1. Wnioski.

Doświadczenie wykazało, że:

Dcpip uwalnia się szybciej z roztworu wodnego niż zżelowanego.

Membrana poliwęglanowa przepuszcza szybciej niż membrana celulozowa.

Dcpip uwalnia się najszybciej z roztworu wodnego przykrytego membraną celulozową (strumień dyfuzji dla tej próbki jest największy, prognozowany czas uwolnienia całęj substancji najkrótszy, natomiast kąt nachylenia prostej na wykresie stężenia od czasu jest największy-stężenie w tej próbce rosło najszybciej)

Wyniki tego doświadczenia są obarczone dużym błędem, wynikającym z niedokładności sprzętu oraz samego wykonania pomiaru. Jeżeli chodzi o sprzęt, to należy uwzględnić niedokładność stopera, spektroskopu, pipet, zlewek i falkonów. niedokładność ludzkiej reakcji. Natomiast błędy jakie zostały popełnione podczas wykonywania pomiaru to np. zbyt powolne pobieranie (pobranie próbek powinno trwać jak najkrócej natomiast w rzeczywistości trwało ok. 4s). Poza tym na wykresie dla roztworu zżelowanego 2 punkty odbiegają od normy, ich absorbancja jest zbyt wysoka. Prawdopodobnie wynika to z tego, że po pobraniu poprzedniej próbki która miała większe stężenie nie wypłukaliśmy dokładnie pipety, dlatego absorbancja w tych punktach jest tak nienaturalnie duża.

Poza tym nie można do końca ufać wynikom pomiaru absorbancji. Kuweta w spektrofotometrze ma pojemność 2 ml Najodpowiedniejsza ilością substancji która należało wlać jest 1,8 ml Nasze próbki miały tylko ok. 1 ml, ponieważ zabrakło nam czasu i nie zdążyliśmy ich rozcieńczyć aby uzyskać wymaganą ilość. Ten fakt miał duże znaczenie przy pomiarze absorbancji, ponieważ kuweta tylko do połowy była wypełniona substancją, drugą połowę stanowiło powietrze. A wiadomo, że powietrze przepuszcza więcej światła niż badany roztwór. przez co absorbancja badanych próbek wyszła inna niż powinna.

1. Bibliografia.

[1] - http://www.biofiz.am.wroc.pl/bfstr65.html

[2] – http://wikipedia.pl