SPRAWOZDANIE
„Aktywność enzymatyczna”
Zadanie 1. β-amylaza z nasion zbożowych
Materiały:
Wyciąg z nasion
płyn Lugola
0,5% r-r skrobi
odczynnik Benedicta
Metody wykorzystane w doświadczeniu:
Próba Benedicta - reakcja chemiczna, która służy do wykrywania cukrów redukujących. Odczynnik Benedicta dodaje się do roztworu i doprowadza do wrzenia. Duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu tlenku miedzi (I), mniejsze żółtego osadu. Odczynnik Benedicta to mieszanina siarczanu (VI) miedzi (II) i przesączonej mieszaniny uwodnionego cytrynianu sodu z uwodnionym węglanem sodu.
Próba Lugola - płyn Lugola to wodny roztwór jodu z jodkiem potasu, który służy do wykrywania skrobi. Dodany do płynów zawierających skrobię zmienia ich barwę na fioletowoczarną, przy niewielkich stężeniach na niebieskofioletową.
Wykonanie:
Do 6 ponumerowanych probówek wlać po 0,7 ml wody i 1 ml r-ru skrobi.
Do probówki nr 1 dodać 0,3 ml zagotowanego i oziębionego wyciągu z nasion.
Do pozostałych dodać po 0,3 ml niezagotowanego wyciągu z nasion i wymieszać.
Probówki nr 2 nie inkubować od razu wstawić( do wrzącej łaźni wodnej na ok 5 minut)
Pozostałe probówki wstawić do łaźni o temp. 37ºC na czas podany w tabelce.
Następnie wszystkie probówki zagotować we wrzącej łaźni wodnej (ok 5 minut).
Oziębić, zawartość każdej z probówek i podzielić na 2 równe części.
W jednej przeprowadzić próbę Benedicta, a w drugiej próbę Lugola.
Wyniki:
| Numer próby | Czas inkubacji (min) | Próba Benedicta | Próba Lugola |
|---|---|---|---|
| 1 | 60 | Lazurowy roztwór | fioletowe zabarwienie |
| 2 | 0 | Powstała mała ilość ceglasto-czerwonego osadu | jasnoniebieskie zabarwienie |
| 3 | 10 | Ceglasto-czerwony osad | jasnoniebieskie zabarwienie |
| 4 | 20 | Ceglasto-czerwony osad | jasnoniebieskie zabarwienie |
| 5 | 40 | Ceglasto-czerwony osad | jasnoniebieskie zabarwienie |
| 6 | 60 | Ceglasto-czerwony osad | jasnoniebieskie zabarwienie |
Wnioski:
Próbę Lugola wykonujemy w tym doświadczeniu, aby zbadać zawartość skrobi, natomiast próbę Benedicta, aby sprawdzić obecność cukrów redukujących w roztworze, pochodzących z rozkładu skrobi.
W wynikach działaniem odczynnika Benedicta wraz z długością ogrzewania, barwa roztworów stawała się ciemniejsza i tworzyło się więcej ciemnoczerwonego osadu, gdyż w kolejnych próbówkach (2-6) dłużej działała amylaza.
Działanie odczynnikiem Lugola- im dłużej trzymaliśmy próbówki w łaźni wodnej tym bardziej roztwór się odbarwił - jest to dowód na zmniejszanie się stężenia skrobi (płyn Lugola wykrywa skrobię) pod wpływem dłuższego działania enzymu, który ją rozkłada.
W próbówce nr 1 negatywna próba Benedicta świadczy o braku cukrów redukujących, natomiast pozytywna próba Lugola świadczy o obecności skrobi.
Próbą kontrolną był roztwór w próbówce 1.
Substratem była skrobia.
Zadanie 2. Próba benzydynowa
Materiały:
Wyciąg z ziemniaków
Odczynnik benzydynowy
Metody wykorzystane w doświadczeniu:
Próba benzydynowa – próba służąca do wykrywania enzymu peroksydazy, która jest katalizatorem utleniania nadtlenkiem wodoru różnych substratów (tu odczynnika benzydynowego, który pod działaniem utleniaczy daje błękitny wielocząsteczkowy produkt o złożonej budowie). W obecności peroksydaz utlenianie przebiega bardzo szybko.
Wykonanie:
Do dwóch ponumerowanych probówek wlać po 1 ml wyciągu z ziemniaka.
Jedną probówkę włożyć do łaźni wodnej i zagotować wyciąg z ziemniaka, później go schłodzić.
Do wyciągu z ziemniaka w każdej probówce dodać kilka kropel świeżo przygotowanego odczynnika benzydynowego.
Wyniki:
Wyciąg z ziemniaka, który nie był uprzednio zagotowany, po dodaniu odczynnika benzydynowego zmienia barwę na granatowo – niebieską. Wyciąg z ziemniaka, który był wcześniej zagotowany i następnie schłodzony nie zmienia barwy po dodaniu odczynnika benzydynowego.
Wnioski:
W probówce z wywarem ziemniaka, który nie został wcześniej zagotowany, próba benzydynowa dała pozytywny wynik, r-r zabarwił się na niebiesko. Oznacza to, że w r-rze znajdują się enzymy peroksydazy.
W probówce z zagotowanym wcześniej wywarem ziemniaka, enzymy te uległy denaturacji – zostały zniszczone. Dlatego też próba benzydynowa dała negatywny wynik – enzymy peroksydazy nie znajdują się w r-rze.
Zadanie 3.
Materiały:
Wyciąg z ziemniaków
0,1 M bufor fosforanowy (pH=7,4)
0.3% r-r pirokatechiny
Wykonanie:
Do 4 ponumerowanych probówek dodać po 3 ml wyciągu z ziemniaka.
Próbkę nr 3 wstawić na 5 min. do wrzącej łaźni wodnej, a następnie oziębić.
Do wszystkich probówek odmierzyć podane w tabeli ilości buforu fosforanowego i roztworu pirokatechiny lub wody.
Zawartość wszystkich probówek zmieszać i pozostawić na 30 minut.
Co kilka minut probówki nr 1-3 mocno wstrząsnąć, próbę nr 4 pozostawić bez wstrząsania.
Wyniki:
| Numer próby | Wyciąg z ziemniaka (ml) | Woda (ml) | Bufor fosforanowy (ml) | Pirokatechina (ml) |
Wynik |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 0 | 0,5 | 1 | brązowe zabarwienie w całym roztworze |
| 2 | 3 | 1 | 0,5 | 0 | Odbarwienie roztworu |
| 3 | 3 | 0 | 0,5 | 1 | Odbarwienie roztworu |
| 4 | 3 | 0 | 0,5 | 1 | brązowe zabarwienie roztworu (ciemniejsze zabarwienie do góry) |
Wnioski:
Substratem tej reakcji jest pirokatechina, która jest trawiona przez enzymy pochodzące z wyciągu z ziemniaka. Świadczy o tym wykonana próba nr 1 i uzyskane jej brązowe zabarwienie w całym roztworze. W probówce 2 znajdowała się próba kontrolna (bez pirokatechiny czyli substratu). W tej próbie, więc nie został rozłożony substrat a roztwór się odbarwił. Odbarwienie roztworu obserwujemy także w próbie nr 2, czyli wynika z próby kontrolnej, że substrat tu też nie jest strawiony, mimo że enzym miał czas zadziałać. Jednak zamiast pirokatechiny dodaliśmy tu wodę. Wykonana próba miała na celu pokazać, która substancja jest substratem. Natomiast próba nr 4 pokazuje wpływ dostępu tlenu na wydajność reakcji. Próba ta zawiera substrat, czyli pirokatechinę i nastąpiło zabarwienie roztworu na brązowo, ale ciemniejsze zabarwienie roztworu było do góry, gdzie bez wstrząsania (ograniczania dostępu tlenu) mógł dojść tlen. Czyli reakcja ta z tlenem jest wydajniejsza.
Zadanie 4. Inwertaza z drożdży
Materiały:
R-r inwertazy
Bufor octanowy (pH=4,4)
R-r skrobi
R-r sacharozy
Odczynnik Benedicta
Metody wykorzystane w doświadczeniu:
Próba Benedicta - reakcja chemiczna, która służy do wykrywania cukrów redukujących. Odczynnik Benedicta dodaje się do roztworu i doprowadza do wrzenia. Duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu tlenku miedzi (I), mniejsze żółtego osadu. Odczynnik Benedicta to mieszanina siarczanu (VI) miedzi (II) i przesączonej mieszaniny uwodnionego cytrynianu sodu z uwodnionym węglanem sodu.
Wykonanie:
Do 4 ponumerowanych probówek odmierzyć podane w tabeli ilości enzymu, wody, buforu octanowego, r-ru skrobi, r-ru sacharozy.
Probówkę nr 4 z roztworem enzymu zagotować przed dodaniem pozostałych składników.
Probówki z próbami inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
Po tym czasie zawartość probówek zobojętnić roztworem węglanu sodu (sprawdzając odczyn papierkiem lakmusowym).
Na zobojętnionych próbach wykonać próbę Benedicta.
Wyniki:
| Numer próby | Enzym (ml) | Woda (ml) | Bufor (ml) | Skrobia (ml) | Sacharoza (ml) | Próba Benedicta |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | Lazurowe zabarwienie |
| 2 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 | niebieskie zabarwienie |
| 3 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | ceglastoczerwone zabarwienie, osad |
| 4 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | Lazurowe zabarwienie |
Wnioski:
W probówce nr 3 próba Benedicta dała pozytywny wynik, dając ceglasty osad, czyli znajdują się w niej cukry redukujące. Doszło więc do rozkładu sacharozy na glukozę i fruktozę. W probówkach 1 i 2 nie znajdowała się sacharoza, a skrobia, na którą inwertaza nie działa. Natomiast probówka nr 4 została zagotowana, enzym uległ zniszczeniu. Stąd negatywne wyniki próby Benedicta w probówkach 1, 2 i 4.
Zadanie 5. Enzymatyczna hydroliza skrobi przez α-amylazę śliny
Materiały:
1% roztwór skrobi
Odczynnik Benedicta
Ślina
Płyn Lugola
Metody wykorzystane w doświadczeniu:
Próba Benedicta - reakcja chemiczna, która służy do wykrywania cukrów redukujących. Odczynnik Benedicta dodaje się do roztworu i doprowadza do wrzenia. Duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu tlenku miedzi (I), mniejsze żółtego osadu. Odczynnik Benedicta to mieszanina siarczanu (VI) miedzi (II) i przesączonej mieszaniny uwodnionego cytrynianu sodu z uwodnionym węglanem sodu.
Próba Lugola - płyn Lugola to wodny roztwór jodu z jodkiem potasu, który służy do wykrywania skrobi. Dodany do płynów zawierających skrobię zmienia ich barwę na fioletowoczarną, przy niewielkich stężeniach na niebieskofioletowy.
Wykonanie:
Do 2 probówek dodać 3 ml roztworu skrobi i 1ml śliny, zamieszać.
Po czasie 10 min wykonać próbę Benedicta na pierwszej próbie, a na drugiej próbę Lugola.
2 probówki z 1 ml śliny włożyć do łaźni wodnej i zagotować. Następnie dodać do każdej z nich po 3 ml roztworu skrobi. Zamieszać.
Po czasie 10 min wykonać próbę Benedicta na pierwszej próbie, a na drugiej próbę Lugola.
Wyniki:
Próbki ze śliną niezagotowaną:
Próba Lugola – wynik ujemny, białe zabarwienie próby,
Próba Benedicta – wynik dodatni, ceglastoczerwone zabarwienie próby.
Próbki ze śliną zagotowaną:
Próba Lugola – wynik dodatni, granatowe zabarwienie próby,
Próba Benedicta – wynik ujemny, lazurowe zabarwienie próby.
Wnioski:
W probówkach ze śliną niezagotowaną: wynik próby Lugola wyszedł negatywny, ponieważ α–amylaza rozłożyła skrobię do cukrów redukujących, i płyn Lugola nie wykrył zawartości skrobi. Wynik próby Benedicta był pozytywny, ponieważ wykrył zawartość cukrów redukujących w r-rze.
W probówkach ze śliną zagotowaną: wynik próby Lugola wyszedł pozytywny, ponieważ enzym α–amylaza został zniszczony w wysokiej temperaturze. Tak więc, zawarta w r-rze skrobia zabarwiła płyn na granatowo. Próba Benedicta natomiast dała negatywny wynik, ponieważ w r-rze nie znajdowały się cukry redukujące powstałe z rozkładu skrobi.