Wybrane odmiany techniki PCR

•Hot Start PCR w reakcji PCR tempreatura jest głównym czynnikiem warunkującym specyficzność reakcji. W reakcji HotStart PCR przynajmniej jeden z substratów (Polimeraza, Mg+2, lub dNTP) jest nieobecny w mieszaninie reakcyjnej i dopiero po osiągnięciu wysokiej temperatury brak ten jest uzupełniany . Opóźnienie reakcji można osiągnąć różnymi drogami. np. przez dodanie polimerazy do reakcji pod koniec początkowej denaturacji inaktywacji polimerazy przez blokowanie jej centrum aktywnego przeciwciałami lub innymi ligandami. Ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej w czasie wstępnej denaturacji powoduje uwolnienie polimerazy.

•Asymetryczny PCR w reakcji używany jest jeden starter lub dwa w nierównych stężeniach amplifikacji ulega tylko jedna nić .Stosowany np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania DNA

•Multipleksowy PCR Metoda ta polega na amplifikacji kilku regionów DNA w czasie jednej reakcji PCR. Reakcja ta wymaga użycia kilku par starterów o podobnej temperaturze topnienia tak by można było użyć jeden profil temperaturowy reakcji. Multipleksowy PCR jest wykorzystywany np. do diagnostyki osobników, gatunków czy chorób genetycznych. '

•Real-Time PCR Reakcja PCR z wykrywaniem produktów w czasie rzeczywistym. Intensywność świecenia jest skorelowana z ilością odłączanego znacznika a zatem ilością powstającego produktu. W reakcji można wykorzystywać kilka sond wyznakowanych różnymi fluorochromami, co umożliwia obserwację amplifikacji różnych fragmentów DNA.

•Nested PCR – wewnętrzny (zagnieżdżony) PCR Reakcja Nested PCR lub Semi-Nested PCR jest sposobem na zwiększenie czułości i specyficzności reakcji PCR. Polega ona na dwóch następujących po sobie reakcjach PCR. W pierwszej reakcji amplifikowany jest większy fragment DNA. Startery drugiej reakcji są zlokalizowane wewnątrz pierwszego produktu PCR (Nested) lub też jeden ze starterów jest taki jak w pierwszym PCR a drugi jest zlokalizowany wewnątrz pierwszego produktu (Semi-Nested). Ze względu na zastosowanie dwóch reakcji PCR ze specyficznymi starterami końcowy produkt reakcji jest wysoce swoisty. Podwójna amplifikacja fragmentu DNA sprawia, że reakcja jest bardzo czuła i możliwa jest detekcja bardzo małej ilości matrycy.

•Kolonijny PCR – matrycowe DNA pochodzi bezpośrednio z kolonii bakteryjnej, tkanki (bez etapu izolacji) •Zdegenerowany PCR – startery do reakcji amplifikacji fragmentu DNA projektujemy na podstawie sekwencji jego produktu białkowego – czyli uwzględniamy właściwość kodu genetycznego jaka jest jego degeneracja.

Warunki

Typowy schemat reakcji PCR jest więc szeregiem powtarzanych cykli złożonych z następujących etapów: •denaturacji DNA (30 sek.-5 min.; 94-96°C)•przyłączania - hybrydyzacji (annealing) starterów (15 sek.-1 min.; 50-65°C) •wydłużania (elongacji) starterów (syntezy DNA) (68-75°C).

Temperatura i czas trwania wydłużania - elongacji startera •zależy od używanej polimerazy - zwykle optymalna temperatura wynosi 72-75°C (szybkość przyłączania nowych nukleotydów 100 nt/s)•przyjmuje się jednak, że do syntezy fragmentów o wielkości 1 kpz wymagany czas elongacji wynosi 1 min.

Parametry dobrego startera

•powinien być wysoko specyficzny dla danej sekwencji. Przy amplifikacji z użyciem całkowitego DNA nietrudno sobie wyobrazić, że starter przyłączy się tylko do jednego miejsca. Ze względu na wielkość genomów teoretycznie niemożliwe jest występowanie dwóch takich starterów w genomie. •obecność na 3’ końcu startera nieunikalnych sekwencji o długości 6-7 ntobjawia się występowaniem niespecyficznych produktów w reakcji PCR. Pracując z DNA ssaków trzeba zawsze sprawdzać czy projektowany starter nie wykazuje homologii z sekwencjami powtórzonymi typu Alu lub innymi sekwencjami repetetywnymi. Należy również unikać homooligomerów (jak –AAAAAA-) i dwunukleotydowych powtórzeń typu np. –ATATAT -. starter powinien zawierać około 50% par GC. Ilość GC wpływa na temperaturę topnienia starterów, która nie może być większa niż optymalna temperatura działania polimerazy• wymóg co do proporcji GC/AT nie jest bezwarunkowy, gdyż np. dla genomów o dużej zawartości par GC, czy miejsc bogatych w AT niemożliwe jest jego spełnienie• przyjmuje się że startery powinny zawierać ilość GC/AT podobną lub wyższą niż amplifikowana matryca •nie powinny tworzyć struktur typu szpilki do włosów•nie powinny zawierać w części 3’ końcowej sekwencji komplementarnych do samych siebie oraz do drugiego startera •odległość między starterami w amplifikacji powinna wynosić od 0.1 do kilku kpz.

Deoksynukleotydy (dNTP)

•stosowany mix dNTP powinien zawierać równe ilości czterech nukleotydów dATP, dTTP, dCTP i dGTP •końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów w mieszaninie reakcyjnej wynosi zwykle od 200 do 250mM (w objętości 50ml jest to ilość dNTP wystarczająca do syntezy ok. 6-6,5 mg DNA) •Wysokie stężenie dNTP (>4 mM) hamuje reakcję PCR prawdopodobnie poprzez wiązanie jonów Mg+2 •Przy amplifikacji krótkich fragmentów DNA (do 1 kpz) można używać mniejszych ilości nukleotydów (0,5 pM-20 mM)Deoksynukleotydy (dNTP)plifikowanym DNA powinna wynosić od 0.1 do kilku kpz.

Temperatura etapu przyłączania - hybrydyzacji (annealingu) starterów •jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na skuteczność i specyficzność reakcji PCR •czas trwania tego etapu jest zależny od wielkości starterów, ale zwykle nie przekracza 1 min •temperatura przyłączania starterów powinna być o 5°C niższa niż obliczona temperatura topnienia starterów (Tm). Zbyt niska temperatura powoduje, że startery przyłączają się w niespecyficznych miejscach (na zasadzieniepełnej komplementarności.

Termostabilne Polimerazy DNA

•termostabilna polimeraza Taq wyizolowana z Thermus aquaticus (obecnie dostępna jako rekombinowana)•polimeraza Taq i jej pochodne nie posiadają aktywności egzonukleazy 3’®5’ (tzw. sprawdzającej) - ilość błędnie wstawianych nukleotydów jest dość wysoka (większa niż w procesie replikacji DNA) i wynosi 2 x 10-4 do 2 x 10-5•Produkty amplifikacji z użyciem polimerazy Taq mają charakterystyczne zakończenia •Polimeraza Pfu (Pyrococcus furiosus)•charakteryzuje się bardzo niską częstość wstawiania błędnych nukleotydów (1.6x10-6-7x10-7) •ze względu na aktywność sprawdzającą wymaga ona dłuższego czasu działania (ok. 1.5-2 min/kpz). Optymalna temperatura działania to ok. 75°C. Polimeraza Pfu zachowuje 95% aktywności po godzinnej inkubacji w 98°C•produkt PCR amplifikowany polimerazą Pfu posiada tępe końce

•Polimeraza Tth (Thermus thermophilus)•posiada zdolność odwrotnej transkrypcji tj. przepisywania cząsteczek RNA o długości do 1000 nukleotydów na DNA, w obecności jonów Mn+2. W obecności jonów Mg+2 jest polimerazą DNA i amplifikuje cząsteczki DNA w reakcji PCR. •Aktywność odwrotnej transkryptazy (RT) w podwyższonej temperaturze jest bardzo pożyteczna, gdyż pozwala uniknąć problemów związanych ze skomplikowaną budową przestrzenną cząsteczek np. RNA •Obecnie dostępna w postaci rTth (rekombinowanej) oraz rTth DNA Polymerase, XL [XL (eXtra Long) PCR], która może przepisywać DNA lub RNA długości powyżej 5 kpz

Deep Vent jest wyjątkowo stabilnym enzymem zarówno w wysokiej (480 min. w temp. 100°C) jak i niskiej temperaturze. Ma zdolność do amplifikowania długich fragmentów DNA (do 14 kpz) – dużą procesywność Posiada aktywność sprawdzającą egzonukleazy. Amplifikacja fragmentów o długości powyżej 2 kpz wymaga zawsze większej ilości jonów magnezowych (powyżej 2mM). •Polimerazy popełniające niską ilość błędów (ang. High Fidelity) mają niestety tendencję do degradowania jednoniciowego DNA np. starterów. Taka degradacja może wpływać na zmianę warunków temperaturowych reakcji PCR oraz jej specyficzność. •

•Long PCR Enzyme Mix Mieszanki różnych polimeraz, np. Taq i Deep Vent, w óżnych proporcjach, tak aby zoptymalizować amplifikację długich fragmentów (do 200 kpz!!!)