Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginianowej i alaninowej.

Wykonanie:

Celem ćwiczenia jest zapoznanie praktyczne ze spektrofotometryczną metodą oznaczania aktywności aminotransferazy asparaginianowej i alaninowej, mające podstawowe znaczenie przy przenoszeniu grup aminowych aminokwasów.

1. Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginianowej.

Otrzymany w kolbce roztwór uzupełniamy wodą destylowaną do kreski i dokładnie mieszamy. Do czterech 1,5 ml probówek Eppendorfa (2 próby pełne i 2 materiałowe) dodajemy 0,5 ml zbuforowanego roztworu L-asparaginianu i 2-oksoglutaranu, probówki wstawiamy do łaźni wodnej o temp. 30°C i po 5 minutach do prób pełnych odmierzamy 0,5 ml enzymu z kolbki. Zawartość szybko mieszamy i wstawiamy do łaźni wodnej na 30 minut. Po tym czasie do wszystkich probówek dodajemy po 0,5 ml 4% kwasu trichlorooctowego, a dodatkowo do prób materiałowych po 0,5 ml wyciągu z enzymu z kolbki. Zawartość każdej probówki mieszamy i odwirowujemy w wirówce przez 5 minut. Następnie z każdej probówki przenosimy po 0,5 ml klarownego płynu znad osadu do kolejnych czterech probówek Eppendorfa i dodajemy do każdej 1 ml roztworu NADH + H⁺ oraz 10 μl mieszaniny dehydrogenaz (jabłczanowej i L-mleczanowej). Po upływie 10 minut od momentu dodania enzymu odczytujemy absorbancję dla prób przy długości fali 340 nm w fotometrze wyzerowanym wobec wody destylowanej.

2. Oznaczanie aktywności aminotransferazy alaninowej.

Postępujemy podobnie jak w przypadku oznaczania aminotransferazy asparaginowej. Najpierw do czterech probówek Eppendorfa dodajemy 0,5 ml zbuforowanego roztworu L-alaniny i 2-oksoglutaranu, probówki wstawiamy do łaźni wodnej na 5 minut, dodajemy do prób pełnych wyciąg z enzymu, całość zostawiamy na 30 minut. Po tym czasie do prób materiałowych dodajemy 0,5 ml wyciągu z enzymu, wszystkie probówki mieszamy i wstawiamy do wirówki na 5 minut. Następnie przenosimy po 0,5 ml klarownego płynu znad osadu do czystych probówek Eppendorfa, dodajemy po 1 ml roztworu NADH + H⁺ oraz 10 μl dehydrogenazy L-mleczanowej. Po upływie 10 minut badamy absorbancję dla prób przy długości fali 340 nm.

Wyniki i obliczenia:

Dla aminotransferazy asparaginianowej:

Próba materiałowa I	Próba materiałowa II	Próba pełna I	Próba pełna II	Użyta różnica absorbancji
0,428	0,473	0,170	0,117	0,258

Dla aminotransferazy alaninowej:

Próba materiałowa I	Próba materiałowa II	Próba pełna I	Próba pełna II	Użyta różnica absorbancji
0,459	0,466	0,142	0,223	0,280

Obliczenia dla aminotransferazy asparaginianowej:

0,258 / 6,22 = 0,04148 μmoli produktów 2-oksokwasów

0,5 ml - 0,04148

1,5 ml - x

x = 0,12444 μmola szczawiooctanu

0,5 ml - 0,12444 μmola

10 ml - y

y = 2,4888 μmola szczawiooctanu

2 ml - 2,4888 μmola szczawiooctanu

1 ml - z

z = 1,2444

dla 1,5 g siewek 124,44 μmola szczawiooctanu

dla 1 g siewek, więc 82,96 μmola szczawiooctanu

po uwzględnieniu czasu reakcji 30 min aktywność aminotransferazy asparaginianowej:

2,77 μmola szczawiooctanu / min * g siewek

Obliczenia dla aminotransferazy alaninowej:

0,280 / 6,22 = 0,0450 μmoli produktów 2-oksokwasów

0,5 ml - 0,0450 μmol

1,5 ml - x

x = 0,135 μmola pirogronianu

0,5 ml - 0,135 μmola

10 ml - y

y = 2,7 μmola pirogronianu

2 ml - 2,7 μmola szczawiooctanu

1 ml - z

z = 1,35

dla 1,5 g siewek 135 μmola szczawiooctanu

dla 1 g siewek, więc 90 μmola szczawiooctanu

po uwzględnieniu czasu reakcji 30 min aktywność aminotransferazy asparaginianowej:

3 μmola szczawiooctanu / min * g siewek

2,77 / 3 = 0,923 (stosunek aktywności aminotransferazy asparaginianowej do alaninowej)

1

---