Patomorfologia 30.03.2010r.

Przygotowanie materiału histopatologicznego do badań

1. Rodzaje materiału histopatologicznego do badań

• narządy (materiał histologiczny)

• wycinki tkankowe (materiał histologiczny)

• bioptaty (materiał histologiczny lub cytologiczny)

• płyny z jam ciała (materiał cytologiczny)

• komórki złuszczone z powierzchni zmienionych obszarów (materiał cytologiczny)

2. Zmiany chorobowe określa się na kilku poziomach

1. makroskopowym

• badanie materiały dostarczone do diagnostyki patomorfologicznej

• badanie pośmiertne…

mikroskopowym

• badania histologiczne i cytologiczne w mikroskopach: świetlnym/elektronowym/fluoresnecyjnym

3. Rodzaje badań

• badanie śródoperacyjne

• badanie pooperacyjne

• badanie biopsyjne

• biopsja aspiracyjna cienkoigłowa (BAC)

• biopsja gruboigłowa

• trepanobiopsja

• badanie cytologiczne

• badanie pośmiertne

4. Badanie śródoperacyjne ( intra/doraźne)

- wykonywane podczas trwania zabiegu operacyjnego

- najważniejsza jest szybkość wykonania ok. 15 - 20 min

- ważne dla dalszego postępowania chirurgicznego

- jest wstępem do szczegółowej diagnostyki histopatologicznej

Cel badania

- skrócenie czasu pomiędzy usunięciem guza, a wykonaniem radykalnego zabiegu

- ocena czystości onkologicznej wyciętych marginesów tkankowych

- ocena zaawansowania choroby nowotworowej

Wykonanie

Materiał dostarczony do laboratorium patomorfologicznego jest świeży (nieutrwalony)

• badanie rozpoczyna się od oceny makroskopowej

• pobranie reprezentatywnych fragmentów tkankowych

• materiał zamrozić (CO2, ciekły azot, z użyciem kriostatu)

• zabarwić: hematoksylina i eozyna (HE)

• wynik badań natychmiast przekazać na blok operacyjny (telefonicznie)

5. Badanie pooperacyjne

- przesyłany materiał umieszczony jest w utrwalaczu (10% formalina)

- badanie rozpoczyna się od oceny makroskopowej

- pobranie reprezentatywnych fragmentów tkanek

- przygotowanie bloczków histologicznych (zatopienie w parafinie, krojenie bloczków mikrotomie)

- wykonanie podstawowego barwienia H&E

- w razie potrzeby wykonanie dodatkowych badań ( immunohistochemiczne, immunochemiczne, biologii molekularnej)

6. Badanie biopsyjne

1. biopsja aspiracyjna cienkoigłowa (BAC)

badanie przy użyciu USG, szuka się dobrego miejsca. Znalezione miejsce nakłuwa się igłą i pobiera się komórki. Komórki umieszczane są na szkiełku i utrwala się (obecnie są już do tego używane specjalne aerozole). Igła wykorzystywane do tego rodzaju biopsji ma grubość 0,6 - 0,7 mm. Uzyskujemy materiał cytologiczny.

2. biopsja gruboigłowa

wskazana w przypadku wyczuwalnych guzów. Uzyskujemy materiał tkankowy. Igła o średnicy 1-2mm

3. trepanobiopsja

pobrany materiał (szpik kostny) pochodzi z kości ( najczęściej talerz kości biodrowej lub rzadziej z mostka). Wykorzystywana do diagnostyki chorób kości, zaburzeń hematologicznych toczących się w szpiku.

Uzyskujemy materiał tkankowy.

( biopsja wiertarkowa - rodzaj trepanobiopsji; już się nie wykonuje)

7. Badanie pośmiertne (sekcja zwłok)

Cel

- ustalenie bezpośredniej przyczyny zgonu

- opisanie zmian obecnych w chwili zgonu w celu uzupełnienia dokumentacji medycznej

- odszukanie cech skuteczności lub braku skuteczności prowadzonej terapii

Etapy

- ocena makroskopowa - ogólne oględziny zwłok, narządów, spisanie protokołu sekcyjnego

- pobranie fragmentów tkanek

- wykonanie preparatu mikroskopowego

8. Badanie cytologiczne

badanie cytologiczne

9. Utrwalanie materiału tkankowego zapewnia:

- zachowanie względnie mało zmienionej struktury komórek/tkanek [!]

- zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach/tkankach (zapobiega anabolizie (?) )

- niedopuszczenie do wypłukiwania i przemieszczania antygenów (białek)

- zachowanie właściwości antygenów do wiązania przeciwciał

- utwardzenie pobranego materiału

- ochronę przed niepożądanymi skutkami działania odczynników używanych w dalszych etapach procedury

- zachowanie dobrej jakości kwasów nukleinowych (badania molekularne)

10. Rodzaje i podziały substancji utrwalających

a) chemiczne utrwalacze:

• kwasy mineralne - kw. Pikrynowy, kw. trójchlorooctowy, kw. octowy, lodowaty

• kwasy<?> organiczne - aceton, metanol, etanol, formalina

• sole metali ciężkich - azotan srebra, dwuchromian potasu, sublimat (chlorek rtęci)

• szybko dyfundujące - formalina, metanol, etanol, kw. octowy

• wolno dyfundujące - kwas osmowy (7dni, podczas gdy formalina - 24 godziny)

b) utrwalacze proste i złożone

Utrwalacze PROSTE (jednoskładnikowe) i ZŁOŻONE (mieszanina 2 lub większej ilości prostych utrwalaczy lub niekiedy innych substancji).

np. utrwalacze złożone

- płyn Bouina <plemniki> (kw. pikrynowy + formalina)

- płyn Carnoya <jądra kom.> (etanol + chloroform + kw. octowy)

- płyn Zenkera <do cytologii> (sublimat + dwuchromian potasu + kw. octowy + siarczan sodu)

c) utrwalacze fizyczne:

• mikrofale

- skracają czas utrwalania w formalinie bez szkody dla morfologii tkanek i stabilności molekułu

- większa czułość reakcji immunohistochemicznej, z powodu mniej zmienionych determinant antygenowych

- utrwalanie przeprowadza się w kuchenkach mikrofalowych od kilku sekund do 1min., w roztworze utrwalacza

• ultradźwięki - utrwalanie bez odczynników

11.

Najpowszechniej używanym utrwalaczem jest

10% formalina buforowana

o pH 7,0 - 7,4

12. Przepis na 10% formalinę buforowaną:

- 40% formalina handlowa 250ml

- Na2HPO4 * H2O 6,5g

- NaHPO4 4,0g

- woda destylowana 750ml

Czasami rozpuszczalnikami są alkohole.

Utrwalacz wodny formalina

12. Chemiczne podstawy procesu utrwalania:

Utrwalacze aldehydowe - formaldehyd i glutaradehyd podczas tworzą wiązania krzyżowe z grupami funkcyjnymi białek (aminowa, sulfahydrolowe, guanidynowe, grupy OH fenoli) wytwarzając krzyżowe „usieciowanie„ białe.

Najkorzystniejsze utrwalacze tworzą największą ilość wiązań krzyżowych (np. glutaraldehyd jest najlepszy bo lepiej utrwala tkankę niż inne utrwalacze - tworzy najwięcej wiązań krzyżowych ale znacznie obniża immunoreaktywność tkanki, gdyż w pierwszej kolejności muszą zostać rozerwane właśnie te wiązania krzyżowe)

13. Czynniki, które wpływają na utrwalanie tkanek

a) czas

- zmiany biochemiczne w tkankach już po 10 min od ustania krążenia

- zmiany w molekularnej strukturze komórek/tkanek są spowodowane głownie działaniem takich enzymów jak nukleazy, proteazy

- czas utrwalania jest zmienny i zależy od:

• wł. chemicznych utrwalacza

• rodzaju materiału (tk. kostna, mięśniowa, chrzęstna)

• temperatury

• wielkość utrwalanego materiału

b) szybkość

małe próbki tkanek ( z biopsji igłowej) utrwalać przez kilka godzin (w dniu pobraniu materiału można rozpocząć zatapianie w parafinie

większe wycinki utrwalać od 12 - 24 godzin

tkanek, które przeznaczone są do diagnostyki nie powinno się utrwalać w formalinie dłużej niż 72godz. Jeżeli ten czas jest dłuższy to odczyn immunochemiczny może być nieprawidłowy

szybkość penetracji 10% formaliny w tkankach wynosi 1mm/h. Szybkość ta maleje wraz z głębokością tkanki.

Czas utrwalania nie powinien być przedłużany, może bowiem spowodować:

• pęcznienie tkanki

• kruchość materiału

• problemy z barwieniem

• rozpuszczanie niektórych substancji komórkowych

• powstawanie strontów imitujących pigment

• nieprawidłowy obraz wielu struktur komórkowych

• degradacja kwasów nukleinowych

c) pH

Utrwalanie tkanek w niskim pH zmniejsza wydajność izolacji kwasów nukleinowych. Stąd konieczność stosowania formaliny zbuforowanej w odpowiednio dużej objętości w stosunku do pobranego materiału.

W tkankach utrwalonych w formalinie o pH=3 stwierdzono zwiększoną ilość mutacji artefaktowych (stwierdzono, że niskie pH sprzyja usuwaniu pojedynczych zasad azotowych (gł. puryn) z łańcucha DNA i RNA)

Utrwalanie w formalinie o wysokim pH znacząco wzmacnia sygnał hybrydyzacji in situ, zarówno w przypadkach mRNA występującej w małej, jak i w dużej licznie kopii.

Konieczna jest odpowiednia ilość utrwalacza

1:20

(1- tkanka, 20-utrwalacz)

d) temperatura utrwalania:

~ 25^oC - ma niekorzystny wpływ na strukturę kwasów nukleinowych

4 ^oC - zapewnia lepszą ochronę DNA i RNA i nie wpływa ujemnie na morfologię tkanki.

e) ponadto:

- niewielkie wycinki materiału są gwarancją dobrego utrwalenie tkanki (grubość max. 5mm)

- stosunek ilościowy tkanki do utrwalacza 1:20 (lub 1:5 ; 1:8)

- utrwalacz zużywa się podczas procesu utrwalania [!]

- niebezpieczeństwo zmiany pH przy małej ilości utrwalacza [!]

- naczynie z materiałem musi być na tyle duże by można bez problemu było wyjąć utrwalany fragment

- TissueSAFE maszyna, która pakuje świeży materiał w próżni, taka próbka trafia do lodówki i następnie do badania

14. FORMALINA

Zalety:

- szybko przenika przez tkanki

szybkość penetracji 10% formaliny w tkankach wynosi 1mm/h. Szybkość ta maleje wraz z głębokością tkanki.

- dobrze zachowuje białka i lipidy

- wycinki utrwalone w formalinie można zatapiać w parafinie/celoidynie, żelatynie oraz żywicach akrylowych

- preparaty utrwalone w formalinie można przechowywać przez bardzo długi okres czasu

Wady:

- długotrwałe utrwalanie powoduje pęcznienie i wytrącanie aldehydów (pigmenty)-

- parowanie formaliny podczas pracy uszkadza naskórek oraz błonę śluzową

- powoduje uszkadzanie niektórych substancji kom. (glikogen, kwas moczowy, Ca, Fe)

15. KWAS OSMOWY <czterotlenek osmu>

- bardzo dobrze zachowuje wszystkie struktury plazmatyczne (lipidy - mikr. elektronowy)

- występuje jako utrwalacz złożony (zawsze w mieszaninie z formaliną)

- wysoka cena

- szkodliwy dla dróg oddechowych

- bardzo wolno przenika przez tkankę ( proces utrwalania ok. 7 dni)

16. KWAS TRÓJCHLOROOCTOWY

- szybko przenika (szybciej niż formalina)

- dobrze utrwala

- po utrwaleniu tkanki należy wypłukać w alkoholu preparat

- posiada właściwości odwadniające

- można go używać do odwadniania tkanki kostnej

- składnik płynów utrwalających

- zawsze w mieszaninie

Wszystkie utrwalacze stanowiące mieszaninę alkoholi (bez wody) szybciej przenikają przez tkankę niż utrwalacze wodne.

(ogólnie: utrwalacze alkoholowe dużo szybciej przenikają tkankę niż utrwalacze wodne)

17. KWAS PIKRYNOWY

- komórka dobrze zachowuje elementy plazmatyczne

- strukturę kom. utrwalanych z użyciem niniejszego związku charakteryzuje duży kontrast, co sprawia, że bardzo dobrze uwidacznia się elementy plazmatyczne

18. ETANOL

- jako alkohol 95% (do utrwalania)

- szeroko używany do odwadniania tkanek (usuwanie wody - zastępowanie jej alkoholem; alkohol absolutny 99,8% i niższe)

- służy jako utrwalacz materiału cytologicznego

- przedłużenie czasu utrwalania nie powoduje poważniejszych uszkodzeń w budowie komórki

- rozpuszcza tłuszcz i lipidy ( minus tego związku)

- wysoka cena

19. ACETON

- utrwalacz i odwadniacz

- dobrze miesza się z wodą i alkoholem

- występuje zawsze w mieszaninie (ale nie utrwalaczy wodnych) z etanolem

- nigdy nie jest składnikiem utrwalaczy wodnych

20. PŁYN BOUIN

Skład: kw. pikrynowy + formalina

- szczególnie zalecany do utrwalania gruczołów, plemników

21. PŁYN DIBOSQA - BRAZILA

Skład: kw. pikrynowy + formalina + kw. octowy

- zalecany szczególnie przy wykrywaniu glikogenu i mucyny

- zalecany również gdy zachodzi konieczność szybkiego wykonania preparatu (np. podczas badania śródoperacyjnego)

cytologia aspiracyjna (BAC)

cytologia złuszczeniowa

- ginekologiczna (materiał pochodzi z szyjki macicy)

- nieginekologiczna (mocz/plwocina/płyn mózgowo-rdzeniowy/inne płyny pochodzące z jam ciała)

---