BARWIENIA I MIKROSKOPY
Opcje barwienia:
preparat natywny - nie barwione bakterie oglądane przyżyciowo
preparat barwiony
barwienie pozytywne
proste - z użyciem jednego barwnika, uwidacznia kształt bakterii
złożone - z użyciem kilku barwników, wykazuje różnice w barwliwości bakterii G(+) i G(-) lub struktury komórki bakteryjnej
barwienie pozytywno - negatywne - wybarwione tło i bakterie, stosowane do wykazywania obecności otoczek
negatywne - wybarwione tło, ale nie bakterie, uwidacznianie kształtu bakterii; zwykle barwniki czarne (nigrozyna) lub czerwone (czerwień Kongo)
barwienia specjalne - histopatologiczne (Giemzy, Wrighta, Wrighta - Giemzy, PAS)
Przygotowanie preparatu
Szkiełko podstawowe odtłuścić nacierając je kawałkiem mydła a następnie należy wytrzeć kawałkiem flanelki. Na szkiełko nałożyć ezą kroplę bulionowej hodowli bakterii lub kroplę soli fizjologicznej i wyżarzoną, ostudzoną, ezą dotknąć kolonii bakteryjnej na podłożu stałym (płytka). Następnie ezą zamieszać w kropli soli fizjologicznej. Ezę wyżarzyć i odstawić, a preparat pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu szkiełko ująć w szczypczyki i przeciągnąć trzykrotnie przez płomień palnika (utrwalenie). Szkiełko pozostawić do ostygnięcia, a następnie barwić.
Barwienie proste metodą Loefflera (błękitem Loefflera)
Utrwalony preparat zalać błękitem Loefflera na 5 - 10 min. Po tym czasie spłukać wodą, osuszyć w bibule i oglądać w mikroskopie świetlnym (obiektyw 100x + olejek imersyjny). W metodzie Loefflera wszystkie bakterie barwią się na kolor niebieski.
Złożona metoda barwienia Grama
Utrwalony preparat zalać fioletem krystalicznym na 3 min, a następnie barwnik spłukać wodą. Zlać wodę ze szkiełka.
Zalać płynem Lugola (bejca) na 1,5 min i ponownie spłukać wodą. Zlać wodę ze szkiełka.
Preparat odbarwić alkoholem przez 30 s i spłukać wodą. Zlać wodę ze szkiełka.
Podbarwić fuksyną zasadową przez 30 s i spłukać wodą. Zlać wodę ze szkiełka i osuszyć preparat w bibule. Oglądać przy powiększeniu 1000x (okular 10x, obiektyw 100x w układzie imersyjnym - na gotowy preparat nałożyć kroplę olejku imersyjnego i zanurzyć niej obiektyw).
Metoda Grama dzieli wszystkie eubakterie na G(+) fioletowe i G(-) czerwone. Różnice w barwliwości obu rodzajów bakterii wynikają z różnic w budowie ściany komórkowej - bakterie G(+) mają wiele warstw mureiny (peptydoglikanu), natomiast G(-) zasadniczo tylko jedną. Fiolet krystaliczny penetruje osłonki komórki bakteryjnej. Po dodaniu płynu Lugola następuje zastąpienie atomu chlory atomem jodu w cząsteczce barwnika i powstają wewnątrzkomórkowe duże agregaty fioletu krystalicznego. Etanol rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii G(+) oraz dwie błony (cytoplazmatyczną i zewnętrzną) bakterii G(-) i powoduje częściowe odwodnienie ściany, zmniejszając wymiary poryn w mureinie. Gruba mureiny bakterii G(+) zatrzymuje kompleks barwnika, natomiast przechodzi on przez cieniutką jej warstwę w ścianie bakterii G(-) - zostaje wypłukany. Fuksyna zabarwia pozostałość bakterii G(-) n kolor czerwony.
Mikroskopy:
świetlny - do oglądania preparatów barwionych i natywnych przy powiększeniach 400x (preparaty natywne) lub 1000x (preparaty barione)
z ciemnym polem widzenia - do oglądania przy powiększeniu 400x dużych obiektów, np. bakterii spiralnych, pasożytów - tylko w preparatach natywnych
fluorescencyjny - do oglądania przy powiększeniu 400x preparatów specjalnie barwionych - barwnikami fluoryzującymi (oranż akrydyny, auramina, rodamina, fluoresceina), np. preparaty prątków gruźlicy barwione oranżem akrydyny, które obserwuje się na ścianie prątków lub preparatów immunofluorescencyjnych, w których przeciwciało swoiste jest sprzężone z barwnikiem fluoryzującym.