Wykład 4
Mówiliśmy ostatnio o interferencji RNA, regulacji transkrypcji, mówiliśmy jak może być regulowany proces transkrypcji, mogą ten proces regulować specyficzne białka, które wiążą się z DNA ponieważ rozpoznają pewne sekwencje nukleotydów, to są tzw. sekwencje wzmacniające, wyciszające, do nich wiążą się aktywatory albo represory transkrypcji.
Mówiliśmy tez o epigenetycznej regulacji transkrypcji, czyli w jaki sposób struktura chromatyny decyduje o tym ze proces transkrypcji jest możliwy lub nie, ponieważ jeśli chromatyna ma zwarta strukturę to polimerazy RNA nie mogą się dostać i nie zachodzi proces transkrypcji. Żeby tą strukturę chromatyny zmienić potrzebne są enzymy modyfikujące histony. Mówiliśmy o efekcie interferencji RNA, tez powiedzieliśmy ze mikroRNA i siRNA mogą mieć wpływ na epigenetykę bo mogą mobilizować enzymy które metylują histony czy DNA.
Teraz wykład wiąże się z tym co już mówiliśmy o modyfikacji histonów, bo te modyfikacje histonów interesowały nas z punktu widzenia epigenetyki, ale modyfikacje białek są powszechnym zjawiskiem po zakończeniu translacji, czyli nie tylko histony ulegają modyfikacji. Dziś będziemy mówić o różnych metodach modyfikacji białek po translacji, przechodzimy od momentu kiedy powstaje łańcuch polipeptydowy, on wcale nie jest gotowy żeby pełnić swoja funkcje, musi nastąpić pewnego rodzaju modyfikacja łańcucha polipeptydowego, pierwsze najważniejsze zjawisko to fałdowanie białek z ang. folding, pewna historia sięga lat 60, badacz Anfinsen zajmował się badaniem procesów fałdowania białek, wiemy ze ten powstający łańcuch przyjmuje pewna określoną strukturę drugorzędową, on się zastanawiał jak to się dzieje, jak fragm. łańcucha polipeptydowego wiedzą gdzie ma być fragment beta harmonijki i gdzie fragmenty alfa helikalne. On robił taki eksperyment ze brał fragm. białka, ogrzewał roztwór, dochodziło do częściowej denaturacji a później renaturacji, doszedł do wniosku ze to białko wracało do swojej konformacji, doszedł do wniosku ze białko samo wie jak się sfałdować, za to odkrycie dostał Nobla, za badania nad fałdowaniem białek. Później okazało się ze jest grupa białek, jakieś 15% które do tego żeby się sfałdować, przyjąć strukturę 2 rzędową potrzebują białek opiekuńczych, czaperonów; chaperone - opiekunka, przyzwoitka więc dochodzimy do wniosku ze część białek potrzebuje białek opiekuńczych do przyjęcia odpowiedniej konformacji, w tym momencie jeżeli taki jest stan wiedzy to można powiedzieć ze niesłusznie dostał Nobla skoro jemu wyszło inaczej niż badania pokazują teraz, ale nie, on robił te badania wiele lat temu, o wielu rzeczach jakie maja miejsce w komórce nie miał pojęcia, używał roztworów białka o stężeniu 1mg/ml tymczasem jak powstaje łańcuch polipeptydowy to stężenie białka w pęcherzykach retikulum endoplazmatycznego bywa 200 razy większe, wiec w tym retikulum jest tłok, spływają tam różne łańcuchy polipeptydowe.
Rysunek, wyobraźmy sobie ze to jest wnętrze retikulum endoplazmatycznego, niebieska nic to mRNA na matrycy tego mRNA te różowe kształty to rybosomy, czyli na powierzchni, szorstkiego retikulum zachodzi proces translacji, te powstające łańcuchy polipeptydowe nie pływają sobie jak chcą w cytoplazmie, one wchodzą do retikulum endoplazmatycznego, tu jest specjalny system dzięki któremu łańcuch polipeptydowy wsuwa się do wnętrzna retikulum, w tym samym czasie są tu cząsteczki różnych białek żeby to było możliwe to na n końcu białka istnieje cos takiego, jeśli mamy powstający łańcuch polipeptydowy, to jest N-koniec i pierwszych kilkanaście aminokwasów to sekwencja sygnałowa, jej funkcja polega na tym żeby skierować ten łańcuch do światła retikulum endoplazmatycznego. Jeżeli już tutaj przedostanie się łańcuch to teraz specjalny enzym peptydaza sygnałowa odcina te sekwencję sygnałową, ale całość siedzi już tu w retikulum endoplazmatycznym, dokładnie nie wiadomo w jaki sposób ta sekwencja sygnałowa jest rozpoznawano, bo nie ma reguł co zawiera sekwencja sygnałowa, to może być kilka, kilkanaście do 30 aminokwasów, w różnych białkach sekwencja sygnałowa jest różna, raczej wydaje się ze chodzi o jakąś strukturę 2rzędową, odkrywca sekwencji sygnałowej i tego jak ona jest odcinana przez peptydazę, dostał Nobla.
Co się dziej dalej, otóż tutaj stężenie tych łańcuchów polipeptydowych jest 200-300 mg/ml jest olbrzymie, dlatego musi istnieć mechanizm dzięki któremu te łańcuchy nie zaczną się ze sobą łączyć w przypadkowy sposób i nie tworzą agregatów, dlatego potrzebne są te białka opiekuńcze.
Powstaje łańcuch polipeptydowy i zaczyna się zwijać w trakcie tworzenia, czyli ta n końcowa część już się zaczyna zwijać dzięki opiece czaperonów, potem kończy się synteza i na tym końcowym etapie tworzy się ta struktura 2, 3 rzędowa tej części z c końcem, ponieważ większość białek znajduje się po syntezie w cytoplazmie czyli środowisku wodnym, wiec zasada jest taka ze w trakcie procesu fałdowania aminokwasy hydrofobowe wchodzą do wnętrza cząsteczek białka, a hydrofilowe na zewnątrz, w jakiś sposób czaperony rozpoznają te fragm. białek nad którymi pracują ,otóż czaperony wiążą się do regionów hydrofobowych i starają się je wepchnąć do środka tej tworzącej się 3wymiarowej struktury, dzięki czaperonom ten proces fałdowania ma bardzo wysoką wydajność blisko 100%, nie ma łańcuchów które się zmarnują, które utworzą agregaty, z drugiej strony kiedy odkryto te czaperony i to ze one pomagają w fałdowaniu, myślano ze wszystkie białka potrzebują czaperonów, naukowcy z jednej skrajności przeszli w drugą, istniał pogląd ze wszystkie białka ich potrzebują, teraz wiadomo ze tylko część ich wymaga ok. 15%, reszta radzi sobie sama, o tych białkach opiekuńczych już wam mówiłam kiedy mówiliśmy o białkach szoku cieplnego, czyli o takich białkach kiedy mówiłam o regulacji transkrypcji u bakterii i o specjalnych promotorach, genach szoku ciepła, one działają nie tylko kiedy powstają nowy łańcuch polipeptydowy , ale jeśli mamy podwyższoną temp. sięgającą blisko 40 to wówczas białka o labilnej strukturze są zagrożone, po prostu się rozpadają, zmieniają strukturę a to grozi utrata funkcji, w związku z tym jak rośnie temp. to zwiększa się produkcja białek czaperonowych, białek szoku cieplnego, żeby stabilizowały strukturę innych białek w podwyższonej temp., mamy rysuneczek na nim rybosom i wzdłuż łańcucha polipeptydowego układają się cząsteczki białka opiekuńczego, które się nazywają hsp70 Heat shock proteins, 70 oznacza masę cząsteczkową, bo są też białka te o różnej masie, np. hsp40. Czego potrzebują te białka ,otóż one wymagają ATP, to są powolnie działające ATPazy, muszą uwolnić energię żeby miały możliwość zmiany tej konformacji danego białka, jeśli trudno nam jest wyobrazić jak działają czaperony, to wyobraźmy sobie ze ćwiczymy jogę przed lustrem, tu mamy podręcznik do ćwiczenia jogi, no i zrobiliśmy skomplikowany układ i nie możemy się rozplątać to jest sytuacje białka które przyjęło niewłaściwą konformację i nie może sie teraz uwolnić ,nie może konformacji zmienić, z jednej strony energetycznie jest korzystna ale nieprawidłowa, wiec potrzebny jest instruktor jogi, w tym wypadku jest nim czaperon, dzięki uwolnionej z ATP energii jest w stanie tak wydobyć nasze białko z pułapki energetycznej, czyli jest w stanie zmienić konformacje białka, ze znowu jest nie stabilne energetycznie i ze może ono próbować przyjąć prawidłową konformację, jeśli np. w genie była mutacja, i w tym powstającym łańcuchu brakuje kilku albo jednego aminokwasu, albo jest za dużo, to jest problem wtedy, jest problem z fałdowaniem się białka, często białka kodowane przez zmutowane geny nie są w stanie się sfałdować w takich sytuacjach często dochodzi do chorób, noszą one nazwę chorób spowodowanych nieprawidłowym sfałdowaniem, protein missfolding diseases, czyli choroby spowodowane nieprawidłowym fałdowaniem, dlaczego te powstające agregaty są szkodliwe, bo często nie są usuwane z komórki, tworzą się złogi białkowe, albo wewnątrzkomórkowe albo w przestrzeniach międzykomórkowych , przykładem takich chorób jest alzheimer, parkinson, lista chorób związanych z nieprawidłowym fałdowanie białek jest duża, coraz dłuższa, dzięki diagnostyce molekularnej.
Czyli pierwsza zasadnicza rzecz tuz po zakończeniu translacji to proces fałdowania, następna ważna rzecz która dotyczy białek i ich modyfikacji to są tzw. modyfikacje kowalencyjne, troszkę już o nich wiemy, bo te modyfikacje były w przypadku histonów, te pierwsze 3 pozycje fosforylacja, metylacja, acetylacja.
Fosforylacja, w większości podawana jest definicja ze ulegają jej aminokwasy co maja grupę hydroksylową, seryna, treonina i tyrozyna, ale w ostatnich latach okazało się ze inne tez mogą być fosforylowane, tzn. do nich przyłącza się grupa fosforanowa, pierwszym taki aminokwasem jest histydyna, a następnie lizyna, w ich przypadku grupa fosforanowa przyłącza się w histydynie do atomu azotu, w lizynie to epsilon aminowa grupa bierze udział, tu dołącza sie grupa fosforanowa i tu tworzy się, wiązanie fosfoamidowe, w tych pierwszych 3 przypadkach tworzy się wiązanie fosfor tlen, dlaczego przez wiele lat nikt tego nie znalazł, bo w takich warunkach w jakich się często izoluje białka z materiału genetycznego to te wiązania są niestabilne, to wiązanie fosfoamidowe, przed wyizolowaniem jest to wiązanie, a po nim już nie, te modyfikacje są ważne, generalnie fosforylacja głównie enzymów ma duże znaczenie, bo jak jakiś enzym jest nieaktywny, to fosforylacja enzymów sprawia ze staje się aktywny, albo odwrotnie, wiec fosforylacja białek to jest sposób zmiany aktywności białka.
Gdybyśmy przeprowadzili analizę białek to ok. 30% będzie ufosforylowanych, a jeśli sprawdzimy to np. następnego dnia to tez będzie około 30% ale to nie koniecznie będą te same białka które były ufosforylowane wcześniej, bo ze względu na warunki w jakich żyje komórka, pula tych fosforylowanych białek w sensie jakościowym zmienia się, czyli białko jeśli wymaga fosforylacji ulega jej, jak białko spełni swoją funkcję to przychodzi enzym który ta grupę zabiera, białko ulega defosforylacji.
Fosforylację katalizują kinazy białkowe, natomiast grupę fosforanową może usunąć fosfataza białkowa. Jeżeli mamy długie białko, 300- 400 aminokwasów, to jest tu średnio 5 -10 reszt seryny, oczywiście nie wszystkie te aminokwasy ulegają fosforylacji, ulega ich 1, 2 ale są one w takich miejscach strategicznych że fosforylacja takiego aminokwasu w centrum aktywnym, albo jego pobliżu zmienia aktywność białka, jeżeli pule wszystkich białek nazywamy proteomem, to pule białek które są fosforylowane to mamy pulę fosfoproteomu
Kolejna grupa białek to białka które ulegają metylacji, a wiec do lizyny lub argininy dołączona jest grupa metylowa CH3, fosforylacja jest odwracalna, podobnie jest z metylacją, są enzymy co dodają metylowa grupę do lizyny i argininy, są to metylotransferazy, ale są też białka takie co usuwają tę grupę, są to demetylazy.
3 rodzaj modyfikacji to acetylacja, czym się różni od metylacji? w metylacji grupa metylowa jest dołączona, a w acetylacji grupa acetylowa, czyli reszta kwasu octowego i tutaj mamy znowu albo to jest acetylacja lizyny, albo do n końca białka, czyli jak mamy na n końcu białka grupę aminową to zamiast jednego z tych atomów H przyłącza się grupa acetylowa. I Właściwie to są te 3 rodzaje modyfikacji które są odwracalne, czyli są enzymy co je przyłączają i takie co je usuwają.
Kolejne modyfikacje kowalencyjne są nieodwracalne, te grupy jak zostaną przyłączone to nie mogą być odłączone, usunięte z białka, taka najbardziej istotna jest glikozylacja, czyli przyłączenie cukru, jeżeli chodzi o role biologiczna metylacji, acetylacji i fosforylacji to najlepszym przykładem są histony, bo wiemy ze te modyfikacje zmieniają strukturę histonów i chromatyny i wiemy jakie to jest ważne, a po co jest ta glikozylacja, co to jest? Jest to przyłączenie reszty cukrowej ale nie jest to 1 reszta, tylko łańcuszek reszt cukrowych
Na rys to szare to jest białko, gdzieś w środku jest asparagina która ma w łańcuchu bocznym grupę amidową , i teraz zamiast jednego z tych H dołączany jest łańcuch kilkunastu monomerów cukrowych, jest to N-glikozylacja tego atomu azotu, istnieje tez O-glikozylacja, gdy łańcuch cukrowy przyłączone jest do treoniny, do atomu tlenu, wiec jeśli jest przyłączony do azotu to jest to n glikozylacja, a jak tlenu to o glikozylacja, jak widzicie ten łańcuch cukrowy składa się z kilkunastu monomerów, mamy 3 jednostki glukozy, 9 mannozy i 2 jednostki N-acetyloglukozaminy, czyli jest ich 14, to stosunkowo długi łańcuch, ale jego skład nie zawsze jest taki sam, w jaki sposób zachodzi synteza takiej reszty glikozylowej, to nie jest tak ze kolejne enzymy dołączają po jednym cukrze, cala ta jednostka cukrowa jest syntezowana niezależnie od białka, i jak jest już gotowy to jest przenoszony na asparaginę. Lata 60. 70. 80. to był intensywny okres badan nad glikozylacja, wtedy się okazało ze w komórkach prawidłowych jest inny skład tego łańcucha niż w komórkach nowotworowych, wtedy było dużo szumu wokół tego zjawiska, mówiło sie ze w ten sposób można odróżnić komórki, ale okazało się ze to nie jest proste, bo takie łańcuchy jak występują w komórkach zdrowych wątroby występują w chorych komórkach śledziony, wiec nie dało się znaleźć wyraźnej prawidłowości co by umożliwiało identyfikację komórek nowotworowych.
Po co są potrzebne te łańcuchy cukrowe, wyobraźmy sobie komórkę, tu mamy białko membranowe które tkwi w błonie komórkowej, tu jest przestrzeń zewnątrzkomórkowa i tu łańcuch cukrowy, jeśli wyobrazimy sobie ze na powierzchni komórki, w błonie jest wiele rożnych białek, w różny sposób glikozylowanych to w ten sposób możemy powiedzieć ze te białka z tymi łańcuchami cukrowymi to jest rodzaj antygenu, czyli taki czynnik który pozwala odróżniać jeden typ komórki od innych, bardzo często te łańcuchy cukrowe znajdują się w białkach membranowych, dzięki temu większa jest różnorodność komórek, np. znane grupy krwi, wynikają z tego ze na powierzchni erytrocytów posiadacz grupy krwi A ma inne białka glikozylowane niż posiadacz grupy krwi B, co zrobić żeby się pozbyć problemów różnych grup krwi, wiec co zrobić żeby wszyscy mieli grupę krwi O, zastosować glikozydazy które by poobcinały te łańcuchy, dzięki obecności tych łańcuchów matka natura zwiększa różnorodność białek, czyli mamy za sobą glikozylację, otóż jaka jest jeszcze funkcja łańcuchów cukrowych, otóż często jest tak ze te białka które występują w retikulum endoplazmatycznym maja łańcuch cukrowy i często występuje tam glukoza i obecności tych łańcuchów jest informacja dla czaperonów ze to białko jest nie sfałdowane, one tak długo pracują nad fałdowaniem dopóki nie przyjmie właściwej konformacji, a jak przyjmie to odpowiednia glikozydazy usuwa glukozę, i jeżeli białko nie ma glukozy na końcu łańcucha cukrowego to czaperony dają spokój bo uznają je za sfałdowane, także łańcuchy cukrowe w retikulum endoplazmatycznym są sygnałem dla czaperonów, czyli maja znaczenie dla fałdowania, jeżeli spotkamy się z określeniem ze białko ma 3 miejsca glikozylacji, 1 n glikozylacja, 2 o glikozylacja, to znaczy ze w tym białku jedna asparagina ma łańcuch cukrowy i 2 treoniny maja swoje łańcuchy cukrowe.
Jeśli jakieś białko powstało w procesie translacji, dostało się do retikulum endoplazmatycznego i musi dotrzeć do błony jakoś do tej błony komórkowej musi się dostać i tam zakotwiczyć, takim sposobem zakotwiczenia jest właśnie przyłączenie do tego białka grupy lipidowej, wiadomo ze błona komórkowa ma charakter fosfolipidowy, to jest dwuwarstwa lipidowa, wiec jeśli białko ma charakter hydrofilowy to samo z siebie w tej błonie siedzieć nie będzie, wiec ta modyfikacja grupą lipidowa pozwala to białko zakotwiczyć w błonie komórkowej, mówimy ze te grupy lipidowe to rodzaj kotwicy, na rys widać białko które sobie siedzi spokojnie w cytoplazmie, a to szare to błona, czerwona sprężynka to jest lipid, łańcuch węglowodorowy kwasu tłuszczowego i to białko dzięki tej lipidowej kotwicy jest zakotwiczone w membranie, chociaż tak naprawdę siedzi tuz pod nią, a hydrofilowa cześć siedzi w cytoplazmie ,a kotwica jest lipidowa i dzięki temu białko to jest unieruchomione, to jest duża grupa białek która uczestniczy w procesach rozpoznawania zewnętrznych sygnałów, do komórki docierają różne sygnały , te sygnały to różnego rodzaju cząsteczki chemiczne, jeśli ta komórka ma prawidłowo funkcjonować to na jej powierzchni muszą się znajdować receptory, czyli takie antenki które odbierają sygnał, są to białka które musza być unieruchomione w błonie komórkowej, często te białka tzw. membranowe, żeby były stabilnie przymocowane mają lipidowe kotwice, te kotwice mogą być różne, jedna z nich jest mirystylacja, wiec jeśli mamy białko to to niebieskie to n koniec, powiedzmy tu mamy glicynę, to czerwone co tu jest to już lipid, reszta kwasy tłuszczowego, 13 węglowego, to jest reszta kwasy mirystynowego, może być dłuższy łańcuch węglowodorowy i teraz mamy palmitylację, czyli to jest reszta kwasu palmitynowego przyłączona do cysteiny. Jest jeszcze jeden bardzo ciekawy rodzaj modyfikacji grupą lipidową, ona się nazywa prenylacja, ale ten termin jest takim uogólnieniem bo istnieją dwa rodzaje, jeden się nazywa farnezylacja, co to znaczy, tu tez jest przyłączenie węglowodorowego łańcucha ale to nie jest reszta kwasu tłuszczowego, bo gdyby to był jakikolwiek kwas tłuszczowy to na tym końcu powinien mieć grupę karboksylową, a tu tego nie ma tu jest siarka cysteiny i zaraz kolejny atom węgla, dlatego to nie jest kwas tłuszczowy, to jest nienasycony łańcuch węglowodorowy tzw. łańcuch farnezylowy, tu jest 15 atomów węgla i tu są 3 takie wiązania podwójne, jest jeszcze drugi rodzaj bardzo podobny ale do siarki w cysteinie przyłączony jest łańcuch 20 węglowy, czyli jeszcze dłuższy i to jest tzw. łańcuch geranylo-geranylowy. Jeżeli będziemy pamiętać ze jest cos takiego jak prenylacja i ze to jest przyłączenie długiego łańcucha węglowodorowego do siarki w cysteinie i ze to zwiększa właściwości hydrofobowe białka i to białko siedzi w błonie komórkowej to to wystarczy. Te modyfikacje często występują w białkach membranowych. Jeśli takiej modyfikacji by nie było, to białko nie może się zakotwiczyć w sposób trwały w błonie kom, czyli nie będzie mogło pełnić swojej funkcji.
Czyli znamy już dwa rodzaje modyfikacji białek potranslacyjnej, fałdowanie czyli utworzenie określonej konformacji łańcucha i drugi rodzaj czyli modyfikacje chemiczne czyli przyłączenie określonej grupy chemicznej malej lub dużej i pomiędzy aminokwasem a ta grupa modyfikującą tworzy się wiązanie kowalencyjne.
Trzeci rodzaj to rozszczepienie proteolityczne, z pewnością spotkaliśmy się już z takimi enzymami jak trypsyna, pepsyna, chymotrypsyna i wiemy że ich prekursorami jest trypsynogen, pepsynogen, chymotrypsynogen, czyli są to nieaktywne formy i żeby stały się aktywne pewien fragment łańcucha musi być odcięty, czyli to jest to rozszczepienie proteolityczne, czyli białko które powstaje w procesie translacji jest nieaktywne a dopiero potrzeba jakiejś specyficznej proteazy żeby fragment łańcucha polipeptydowego został odcięty, w ten sposób jakoś się odsłania centrum aktywne i to białko staje się aktywną proteazą, a najczęściej to rozszczepienie dotyczy proteaz, dlatego ze gdyby te proteazy nie były kontrolowane to mogłyby zdegradować białka wewnątrz komórki, wiec musi być jakiś system kontroli i dopiero w specjalnych warunkach następują rozszczepienie proteolityczne i aktywacja danej proteazy, klasycznym przykładem proteaz które są uaktywniane w ściśle określonych warunkach są kaspazy, enzymy biorące udział w procesie apoptozy, apoptoza to samobójcza śmierć komórki, wiec jeśli jakaś komórka jest niepotrzebna albo poważnie uszkodzona, to wówczas docierają do niej informacje o samobójstwie, uruchamiana jest kaskada enzymów które zaczynają ja degradować od środka, i te enzymy które ją degradują to są kaspazy, czyli cały czas siedzą nieaktywne w komórce i dopiero kiedy z jakiegoś powodu komórka dostaje sygnał zabij się wtedy następuje rozszczepienie proteolityczne kaspaz, one jak są nieaktywne to się nazywają prokaspazy, pro oznacza ze są nieaktywne, dopóki wszystko jest ok. w komórce, dopóty istnieją w cytoplazmie prokaspazy, nieaktywne a jak z komórką dzieje się cos złego, mówi się ze apoptoza jest przykładem obywatelskiej postawy komórki w stosunku do całego organizmu, ginie komórka dla dobra organizmu, wiec jak zaczyna się proces samobójczej śmierci kom to następuje rozszczepienie proteolityczne prokaspaz one się uaktywniają i zaczynają totalna degradacje białek wewnątrzkomórkowych. Istnieje jeszcze jeden bardzo ciekawy proces który tez uważa się za rodzaj modyfikacji potranslacyjnej, nazywa się splicing białek albo wycięcie inteiny, wiemy już co to splicing bo spotkaliśmy się z tym procesem w trakcie dojrzewania RNA gdzie mieliśmy do czynienia z eksonami i intronami, wtedy kiedy mówiliśmy o splicingu RNA było cos takiego ze były 2 eksony pomiędzy nimi intron i slicing polegał na wycięciu się intronów, w latach 90 wykryto zjawisko splicingu w białkach, czyli wyobraźmy sobie ze mamy RNA które zawiera introny i eksony, ale ktoś czegoś nie dopatrzył i nastąpiła translacja całego takiego RNA, ale na poziomie białka mamy ciągle taki fragment, który odpowiada eksonowi i cos co odpowiada intronowi, wiec jak byśmy to nazywali, jak to był ekson to na poziomie białka mamy eksteinę, a teraz ten fragment co odpowiada intronowi to mamy inteinę. Teraz odbywa się wycięcie inteiny, ona wycina się sama, dlatego jest różnica miedzy rozszczepieniem proteolitycznym i wycięciem się inteiny, bo w przypadku rozszczepienia proteolitycznego musi być jakiś dodatkowy enzym, dodatkowa proteza, która w tym proenzymie usunie fragment łańcucha peptydowego, czyli jest katalizowane przez enzym, a inteina sama się wycina, tak jak wycinał się intron, na końcach inteiny tez są specyficzne sekwencje aminokwasów, tak jak to było w przypadku intronu gdzie tu była sekwencja GU a tu AG, nie będę wam podawać tych sekwencji aminokwasów, bo ten proces wycięcia inteiny jak do tej pory występuje znacznie rzadziej niż splicing na poziomie RNA, do tej pory zidentyfikowano ten splicing u białek drożdży, generalnie u niższych eukariontów i niektórych bakterii, ale nie myślcie sobie ze ta inteina nie jest już do niczego potrzebna, w momencie kiedy siedzi sobie w łańcuchu i zamierza się wyciąć z połączeniem tych dwóch ekstein tak ze one tworzą końcowy łańcuch polipeptydowy, kiedy jeszcze tam siedzi to jest endopeptydazą, a jak się wytnie to staje się enzymem o zupełnie innej aktywność endonukleazy, pamiętamy co to są endonukleazy? Ich substratem jest DNA, co więc ona robi, załóżmy że mamy cos takiego, mamy dwa allele genu, jeden to jest allel nie zawierający genu endonukleazy, a drugi go zawiera, teraz ta endonukleaza wyszukuje DNA pozbawione jej genu, rozcina w ściśle określonym miejscu, ta sekwencja co jest rozpoznawana liczy ok. 20 nukleotydów, rozcina to DNA i wtedy odpowiednie enzymy naprawcze na matrycy tego 2 allelu naprawiają ten pierwszy, to znaczy ze wbudowują ten gen kodujący endonukleazę, po co?
Organizm który by jej nie miał by coś stracił? Nie, bo ta endonukleza służy tylko żeby czuwać nad własnym genem żeby on nie zanikł w procesie ewolucji , w latach 70 ukazała się taka książka samolubne dna, teza autora była taka ze tak naprawdę organizmy które istnieją na ziemi stanowią tylko formę otoczki dla dna, to wszystko co robimy, służy tylko temu żeby następowała replikacja dna, i w zasadzie ten przykład pokazuje ze autor tej książki w pewnym stopniu miał racje, bo tu ta inteina wycina się na poziomi białka, staje się endonukleaza która dba żeby cząsteczka dna pozbawiona genu tej endonukleazy została naprawiona w taki sposób żeby ten gen się pojawił czyli nie ma szansy żeby organizm zgubił ten gen. Właściwie to są 4 sposoby, grupy mechanizmów modyfikacji potranslacyjnej, jest jeszcze jeden.
Jest system degradacji białek wewnątrzkomórkowych -5 rodzaj modyfikacji potranslacyjnej, nie wszyscy uznają ten mechanizm degradacji za modyfikacje potranslacyjną, bo co to za modyfikacja skoro białko przestaje istnieć, otóż o co chodzi, jeśli mamy białko w komórce, to każde z nich ma określony okres półtrwania, białka strukturalne maja najdłuższy okres półtrwania kilkadziesiąt dni, białka enzymatyczne kilka dni, po czym musza być zastąpione przez nowe cząsteczki, białka regulatorowe, np. czynniki transkrypcji istnieją w komórce kilkanaście minut, czy godzinę, w komórce istnieje system degradacji białek, ale ta degradacja nie jest przypadkowa, ten system rozróżnia białka, wie z jakim substratem ma do czynienia, niektórym białkom pozwala istnieć godzinę, innym da parę dni, ten system działa bardzo precyzyjnie, można by zaryzykować stwierdzenie ze najlepszym sposobem modyfikacji białek jest jego degradacja, powiedzieliśmy sobie ze fosforylacja jest po to żeby białko aktywować lub inaktywować, wiec degradacja jest takim drastycznym sposobem inaktywacji, ten system został odkryty w latach 80, polega na tym ze dane białko ulega najpierw wyznakowaniu, czyli jest do niego w sposób kowalencyjny przyłączony jakiś marker, kiedy będzie on przyłączony to białko trafia do komórkowej niszczarki białek i jest tam degradowane do peptydów, ta komórkowa niszczarka to proteasom, czasem spotyka się nazwę proteosom, wiec jest to kompleks proteaz, ale nie mylmy go z kaspazami, nie są to kaspazy, możemy nazwać ten kompleks komórkową niszczarka białek i teraz interesuje nas co jest markerem znakującym te białka, i w jaki spsoć ten marker rozpoznaje te białka co maja być degradowane, ten proces został odkryty w latach 80 i ten system nazywa się systemem ubikwityny-proteasomu, ubikwityna jest markerem, do białka co ma ulec degradacji przyłącza się ubikwityna, teraz ono wpada do proteasomu i ulega degradacji. W 2004 rok za odkrycie tego systemu dostali nobla 3 badacze, dostali ja w dziedzinie chemii, Ciechanover i Hershko pracują w izraelskim instytucie technologii, Rose - to Stany Zjednoczone uniwersytet kalifornijski, nobel za te odkrycia, za odkrycie tego zależnego od ubikwityny systemu degradacji białek należał się jeszcze jednemu czwartemu badaczowi, Aleksandrowi Warszawskiemu, miał bardzo znaczący udział w odkryciu, a nagroda nobla jest tylko dla 3 badaczy. Powiedziałam wam ze jeśli są źle sfałdowane białka to one tworzą agregaty w komórce i to jest jedna z przyczyn parkinsona, alzheimera i innych chorób tzw. neurodegeneracyjnych czyli choroby które się ujawniają z wiekiem, teraz nasuwa się pytanie wiec jeżeli istnieje system niszczenia białek to dlaczego on nie niszczy tych agregatów, dlatego właśnie ci badacze dostali nobla tak późno, mimo ze te odkrycia zrobiono wcześniej, ubikwityna odkryta była w 75 roku, w latach 70. 80. badacze nie zdawali sobie sprawy jaki jest związek miedzy systemem ubikwityny i proteasomu a chorobami neurodegradacyjnymi, ponieważ w latach 90 badania nad alzheimerem i parkinsonem posunęły się do przodu, dopiero wtedy uświadomiono sobie jak duże znaczenie ma to odkrycie tych badaczy. Opowiem wam później o hipotezie która tłumaczy dlaczego z wiekiem ten system szwankuje.
System ups system ubikwityny i proteasomu. Co to jest ubikwityna, jest białkiem występującym u wszystkich eukariontów, składa się z 76 aminokwasów, to białko ma na swoim c końcu, jako 76 aminokwas glicynę, ta glicyna ma wolna grupę karboksylowa, powiedzieliśmy sobie ze ona się musi przyłączyć kowalencyjnie do białka które ma być zdegradowane, ta ubikwityna za pośrednictwem odpowiednich enzymów które ten proces katalizują dołącza się kowalencyjnie przez ta swoją glicynę do lizyny znajdującej się w łańcuchu polipeptydowym białka, tworzy się wiązanie kowalencyjne, to wiązanie nazywane jest wiązaniem izopeptydowym bo łączy się z węglem w pozycji epsilon a nie alfa, ponieważ ubikwityna jest małym białkiem, taka jedna reszta nie wystarcza do dobrego wyznakowania, musi się zrobić łańcuszek, ubikwityna tez ma w cząsteczce lizynę, szczególnie ważna jest lizyna 48, do niej dołącza się kolejna cząsteczka ubikwityny i tak dalej, w ten spsoć powstaje łańcuszek ubikwityn co najmniej 4. proteasom odkryto dopiero w 88 i jest to kompleks proteaz zależnych od ATP, łączna masa cząsteczkowa to 2 mln daltonów, olbrzymi kompleks mniejszy niż rybosom, jest on odpowiedzialny za degradacje białek wyznakowanych przez ubikwitynę.