ĆWICZENIE 12
OCENA TOKSYCZNOŚCI ZANIECZYSZCZEŃ WODY I GLEBY METODAMI BIOLOGICZNYMI
Zagadnienia szczegółowe:
ryzyko środowiskowe; narażenie środowiskowe; ksenobiotyki; toksyczność; toksyczność ostra i chroniczna; LC; NOEC; LOEC; EC; IC; działanie ogólnoustrojowe i chroniczne; rodzaje działania ksenobiotyków; wchłanianie i wewnątrzustrojowe przemiany ksenobiotyków; biologiczne działanie zanieczyszczeń pyłowych, gazowych, metali ciężkich; pierwiastków radioaktywnych i związków organicznych; toksyczne metabolity wewnątrzustrojowe; definicja biotestu; podział biotestów na letalne i fizjologiczne; warunki jakim powinien odpowiadać organizm testowy; testy krótko- i długoterminowe
Literatura zalecana:
Traczewska T.M. Biologiczne metody oceny skażenia środowiska. Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2011, Strony: 27-38, 70-72
Pawlaczyk-Szpilowa M. Biologia i ekologia. Oficyna Wydawnicza Politechniki
Wrocławskiej, Wrocław 1997, Strony: 351-374
Łebkowska M., Załęska-Radziwiłł M., Słomczyńska B. Toksykologia środowiska. Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa 1999, Strony: 6-9
Zadanie 1. Szybki test określający toksyczność związku rozpuszczonego w wodzie wobec
bakterii Pseudomonas fluorescens
- na podłożu mineralnym z dodatkiem glukozy posiać dywanowo/powierzchniowo bakterie
Pseudomonas fluorescens (tzn. pobrać sterylną końcówką pipety automatycznej 0,1 cm3 zawiesiny bakteryjnej i umieścić na powierzchni podłoża, następnie sterylną głaszczką, ostrożnie i dokładnie rozprowadzić zawiesinę po powierzchni pożywki stałej)
UWAGA: rozwiązanie alternatywne
Wprowadzić na podłoże mineralne z glukozą 1 cm3 zawiesiny bakterii Pseudomonas fluorescens, delikatnie przechylać szalkę Petriego, tak aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę po całej powierzchni. Następnie nadmiar ściągnąć sterylną końcówką przy pomocy pipety automatycznej.
- szalkę Petriego od spodu dna podzielić (pisząc markerem do szkła) na cztery części, jedną
pozostawić na kontrolę, pozostałe trzy opisać zgodnie z zastosowanymi w zadaniu
stężeniami substancji toksycznej:
K2Cr2O7: 1%; 0,1%; 0,01%
CuSO4: 10%; 1%; 0,1%; 0,01%
Pb(CH3COO)2: 1%; 0,1%; 0,01%
fenol: 1%; 0,1%; 0,01%
- na każdej ćwiartce położyć sterylny krążek bibułowy zamoczony wcześniej w roztworze
związku toksycznego zgodnie z opisem na ćwiartce szalki Petriego, w przypadku kontroli krążek zamoczyć w sterylnym roztworze fizjologicznym
- płytki inkubować 48 godzin w temperaturze 26oC
- po inkubacji odczytać wyniki: strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka,
świadczący o toksycznym wpływie badanego związku
- wyjaśnić przyczynę wystąpienia strefy zahamowania wzrostu wzorcowej bakterii
Zadanie 2. Test określający toksyczność ostrą na larwach ochotek
- przygotować rozcieńczenia związków toksycznych:
CuSO4: 50%, 25%, 10%, 5%
domestos: 50%, 25%, 10%, 5%
ACE: 50%, 25%, 10%, 5%
mydło dezynfekcyjne do mycia rąk: 50%, 25%, 10%, 5%
- przygotować szkiełka zegarowe w dwóch powtórzeniach dla kontroli i dla każdego
badanego rozcieńczenia wszystkich związków (podpisać szkiełka)
- na szkiełka zegarowe wprowadzić po 10 cm3 badanych roztworów, w przypadku kontroli
zastosować roztwór fizjologiczny
- odliczyć po 5 larw ochotek (możliwie porównywalnych wielkościowo i kondycyjnie-
ruchliwość) i przenieść kroplomierzem z hodowli matecznej do kontroli i przygotowanych
rozcieńczeń
- policzyć organizmy padłe (brak ruchu nawet po zastosowaniu bodźca mechanicznego np.
trącenia bagietką) po 20, 40 i 60 minutach
- uzyskane, dla wszystkich badanych związków i ich rozieńczeń, wyniki porównać z kontrolą
- wyniki zestawić w tabeli do obliczenia LC50 metodą Reeda
- wyznaczyć LC50 dla trzech czasów
Zadanie 3. Test określający toksyczność chroniczną
a). z wykorzystaniem glonów
- przygotować rozcieńczeń związków toksycznych:
K2Cr2O7: 1%; 0,1%; 0,01%
CuSO4: 10%; 1%; 0,1%; 0,01%
Pb(CH3COO)2: 1%; 0,1%; 0,01%
fenol: 1%; 0,1%; 0,01%
- opisać probówki dla kontroli i każdego badanego rozcieńczenia
- do probówek wprowadzić po 10 cm3 badanych roztworów, w przypadku kontroli
zastosować roztwór fizjologiczny
- do probówek wprowadzić 0,5 cm3 zawiesiny glonów
- inkubować 7 dni w temperaturze pokojowej z dostępem do światła
- odczytać wyniki poprzez wizualne sprawdzenie intensywności zielonego zabarwienia
roztworu (co świadczy o rozwoju glonów) w porównaniu do kontroli
b). z wykorzystaniem rzęsy Lemna minor
- przygotować rozcieńczeń związków toksycznych:
K2Cr2O7: 1%; 0,1%; 0,01%
CuSO4: 10%; 1%; 0,1%; 0,01%
Pb(CH3COO)2: 1%; 0,1%; 0,01%
fenol: 1%; 0,1%; 0,01%
- przygotować 6 dołkową płytkę podpisując dołki dla kontroli i każdego rozcieńczenia
(najmniejsze stężenie w jednym powtórzeniu, dwa kolejne w dwóch powtórzeniach)
- do odpowiednich dołków wprowadzić po 10-20 cm3 badanych roztworów, w przypadku
kontroli zastosować roztwór fizjologiczny
- odliczyć po 5 roślinek Lemna minor (możliwie porównywalnych wielkościowo i stanem
fizjologicznym np. intensywnością zabarwienia liści) i przenieść do dołków z płytki zawierającymi badane roztwory
- hodowle umieścić na 7 dni w temperaturze pokojowej z dostępem do światła
- odczytać wyniki poprzez zmiany morfologiczne roślin np. wielkość i kształt liści, ich barwa
(chloroza), długość korzonków
Zadanie 4*. Test określający toksyczność chroniczną z wykorzystaniem dżdżownic
- do czterech zamykanych pojemników wprowadzić po 50g gleby
- jeden pojemnik z glebą stanowi kontrolę, do której należy wprowadzić 2 cm3 roztworu
fizjologicznego
- do pozostałych trzech pojemników wprowadzić po 2 cm3 badanych roztworów związków
toksycznych w różnych stężeniach
Pb(CH3COO)2: 50%, 25%, 10%, 5%
domestos: 50%, 25%, 10%, 5%
ACE: 50%, 25%, 10%, 5%
mydło dezynfekcyjne do mycia rąk: 50%, 25%, 10%, 5%
- do każdego pojemnika z glebą wprowadzić po 5 dżdżownic (możliwie porównywalnych
wielkościowo i stanem ruchliwości)
- zamknąć pojemnik wieczkiem tak, aby organizmy testowe się nie wydostały
- inkubować 7 dni w ciemności w temperaturze pokojowej
- odczytać wyniki poprzez sprawdzenie ilości żywych organizmów testowych oraz ich stanu
fizjologicznego (np. reakcja na bodźce mechaniczne)
* zadania fakultatywne