Raport z ćwiczenia I

Grupa II

Temat: Skrining środowiskowy.

1. Wstęp teoretyczny

Skrining srodowiskowy jest to poszukiwanie mikroorganizmów (grzybów, promieniowców o znaczeniu biotechnologicznym). Obejmuje proces zabiegów mających na celu wykrycie i wyizolowanie spośród ogromnej liczby drobnoustrojów tych, które odpowiadają stawianym wymaganiom biotechnologicznym.

Przydatne biotechnologicznie mikroorganizmy powinny być:

-dostępne w postaci czystej kultury i łatwe do przechowywania przez dłuższy okres

czasu

-stabilne genetycznie i łatwo ulegać manipulacjom genetycznym

-proste w hodowli na dużą skale i na łatwo dostępnych podłożach przemysłowych

-mikroorganizm nie może być patogenny

Preparaty enzymatyczne należą do najlepiej rozwiniętego działu biotechnologii. Ich produkcja jest możliwa dzięki naturalnej zdolności mikroorganizmów do produkcji szerokiej gamy enzymów, np. lipazy i proteazy.

Technologia produkcji preparatów enzymatycznych obejmuje m. in. wybór mikroorganizmu, przygotowanie hodowli, zaszczepienie podłoża produkcyjnego, biosyntezę enzymu, wydzielenie i zagęszczenie preparatu enzymatycznego.

2. Materiały i metody

Selekcje szczepów bakteryjnych wykonano poprzez serie rozcieńczeń próbek pochodzących z różnych środowisk: woda, gleba, osad czynny, osad denny.

Z dwóch ostatnich rozcieńczeń danej próby wykonano wysiew tarty na pożywkę stałą. Pożywka do izolacji bakterii lipolitycznych zawierała trójbutrynę, a do izolacji bakterii proteolitycznych odtłuszczone mleko w proszku. Płytki z pożywkami inkubowano przez 7 dni w temperaturze 20°C. Następnie po upływie 7 dni zliczano kolonie bakterii oraz przenoszono 3 najbardziej aktywne szczepy lipolityczne i proteolityczne z każdego środowiska do pożywki płynnej. Próby inkubowano przez kolejne 7 dni w temperaturze 26°C.

Po upływie 7 dni oznaczano aktywność lipazy i aminopeptydazy w hodowlach. Użyto 2 substratów: MUF-butyrate do oznaczania lipazy i MCA-lecine do oznaczania aminopeptydazy.

Hodowle bakterii lipolitycznych i proteolitycznych poddano wirowaniu 10tys obrotów/min przez 10 minut w temperaturze 4°C aby oddzielić płyn pohodowlany zawierający dany enzym (lipazy lub aminopeptydazy) od biomasy komórek.

Następnie przygotowano mieszaninę reakcyjną w dwóch próbach dla każdego enzymu. W tym celu pobrano po 1ml płynu pohodowlanego i dodano do niego 0,125ml buforu fosforanowego i 0,125ml odpowiedniego substratu. Wykonano także próbę kontrolną nie zawierającą substratu.

Po wykonaniu prób mierzono ich aktywność.

1. Wyniki:

Strefy przejaśnienia wokół bakterii są charakterystyczne dla drobnoustrojów proteolitycznych i lipolitycznych dzięki czemu łatwiej odróżnić je od pozostałych.

T-pożywka z trójbutryną, M-pożywka z odtłuszczonym mlekiem

X=a*R/v

a-średnia ze zliczonych bakterii

R-rozcieńczenie

v-objętość

Nr.próby	Środowisko	Pożywka	Rozcieńczenie	Ilość bakterii	Średnia ilość bakterii	X
1	woda	T	10^3	8
2	woda	T	10^3	4	6	60000
3	woda	M	10^3	14
4	woda	M	10^3	7	10,5	105000
5	woda	T	10^2	26
6	woda	T	10^2	8	17	17000
7	woda	M	10^2	21
8	woda	M	10^2	20	20,5	20500

Nr.próby	Środowisko	Pożywka	Rozcieńczenie	Ilość bakterii	Średnia ilość bakterii	X
1	osad czynny	T	10^6	1
2	osad czynny	T	10^6	1	1	10.000000
3	osad czynny	M	10^6	1
4	osad czynny	M	10^6	0	0,5	5.000000
5	osad czynny	T	10^5	1
6	osad czynny	T	10^5	1	1	1.000000
7	osad czynny	M	10^5	2
8	osad czynny	M	10^5	1	1,5	1.500000

Nr.próby	Środowisko	Pożywka	Rozcieńczenie	Ilość bakterii	Średnia ilość bakterii	X
1	gleba	T	10^3	11
2	gleba	T	10^3	12	11,5	115000
3	gleba	M	10^3	0
4	gleba	M	10^3	0	0	0
5	gleba	T	10^4	2
6	gleba	T	10^4	3	2,5	250000
7	gleba	M	10^4	1
8	gleba	M	10^4	0	0,5	50000

Nr.próby	Środowisko	Pożywka	Rozcieńczenie	Ilość bakterii	Średnia ilość bakterii	X
1	osad denny	T	10^4	1
2	osad denny	T	10^4	0	0,5	50000
3	osad denny	M	10^4	16
4	osad denny	M	10^4	8	12	1200000
5	osad denny	T	10^5	0
6	osad denny	T	10^5	0	0	0
7	osad denny	M	10^5	0
8	osad denny	M	10^5	0	0	0

Pochodzenie szczepu	Aktywność lipazy μmol MUF/l/h, aktywność całkowita	Aktywność aminopeptydazy μmol MLA/l/h, aktywność całkowita
Gleba	2,305 3,908	2,410 3,346
Woda	2,264 5,228	1,026
Osad czynny	2,931 4,662	2,59 2,898
Osad denny	2,662	0 0

4) Wnioski: Szczepy występujące w glebie charakteryzują się wysoką aktywnością enzymów.

Brak jakiejkolwiek aktywności aminopeptydazy, w przypadku bakterii występujących w osadzie dennym, może świadczyć o nieobecności aminopeptydazy w podłożu bądź o źle zaszczepionych próbach.

---