Biotechnologia

1. integracja nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu zastosowania organizmów, komórek lub ich części oraz molekularnych analogów w celu pozyskania produktów i usług

Dyscyplina na pograniczu nauk

- biologicznych (genetyki, mikrobiologii, biochemii)

- chemicznych

- medycznych

- techniki

Wykorzystuje żywe komórki lub ich fragmenty do celów gospodarczych

- wytwarzanie substancji

- szybkie rozmnażanie organizmów

Procesy biotechnologiczne

1. Fermentacja z użyciem drożdży wykorzystywana w produkcji chleba, piwa, wina, przetworów mlecznych, kiszonych produktów roślinnych

2. Produkcja przemysłowa - kwasu mlekowego, kwasu cytrynowego, preparatów enzymatycznych, acetonu, butanolu, penicyliny

3. Inżynieria chemiczna:

- identyfikacja bioproduktów

- wydzielanie bioproduktów

- oczyszczanie bioproduktów

4. Wykorzystanie kultur in vitro do produkcji:

- szczepionek antywirusowych

- wtórnych metabolitów roślinnych

5. Biologia molekularna

- inżynieria genetyczna (wytwarzanie insuliny ludzkiej w komórkach bakteryjnych)

- zsekwencjonowanie genu (bakterii, drożdży, nicieni, muszki owocowej, rzodkiewnika pospolitego, 95% genomu człowieka)

- rośliny transgeniczne

Rośliny transgeniczne

Organizmy wyższe, którym wprowadzono gen przekazywany następnym pokoleniem zgodnie z podstawowymi prawami dziedziczenia.

• transgeniczna bawełna zawiera niewielką domieszkę poliestru

• transgeniczne pomidory maja przedłużona trwałość przechowywania

• transgeniczny tytoń odporny na herbicydy

• transgeniczne ziemniaki produkują białko odpowiedzialne za ciśnienie krwi ludzkiej.

Fuzja - połączenie komórek różnych roślin (mieszańce międzygatunkowe)

Transformacja - modyfikacja poprzez mutacje

Organogeneza - odtworzenie roślin - klonowanie.

Embriogeneza - namnażanie embrionów

Wartość rynku biotechnologicznego

1. produkty rolne i żywnościowe w UE w 2005 r. 175 mld euro

2. wprowadzenie apomiksji do ryżu (rozmarzanie bez zapłodnienia) 2,5mld $ rocznie

3. wzrost zawartości suchej masy w owocach pomidora o 0,5% w USA 35mld$ rocznie

4. straty powodowanie przez nicienie 100mld$ rocznie

Wartość odmianowa roślin GMO

1. predyspozycje genetyczne umożliwiające produkcję roślin w trudnym środowisku - bez jego zmian

2. rośliny odporne na choroby lub szkodniki - bez stosowanie zabiegów ochronnych

3. w ziarnie więcej białka - bez dodatku konserwantów

4. kwiaty barwne, wysmukłe i pachnące - bez chemikaliów.

Zagrożenia wynikające ze stosowania biotechnologii:

- manipulacja niebezpiecznym materiałem genetycznym (onkogeny, drobnoustroje chorobotwórcze, kultury komórkowe nowotworów)

- bioterroryzm (broń biologiczna np. wąglik)

- alergiczne działanie białka w kukurydzy Star Link (wprowadzono gen odpowiedzialny za produkcję toksyny bakteryjnej Bt, kukurydza ta może być wyłączeni składnikiem pasz zwierzęcych

- możliwość przenoszenia na konsumenta odporności na antybiotyki.

Ważne daty:

1839 - Schwann i Schleiden - teoria totipotencji komórki - komórkowa budowa wszystkich organizmów

1902 - Hanning - zasady hodowli komórek, tkanek i organów

1937 - Went i Thimann - wpływ IAA na rośliny

1948 - Skoog i Tsui - ustalenie stosunku auksyn do adeniny w pożywce do regeneracji pędów i korzeni z kalusa tytoniu

1952 - Morel i Martin - bezwirusowe dalie z kultur merystemów wierzchołkowych

1954 - Muir i inni - regeneracja pierwszej rośliny z pojedynczej komórki

1956 - Miller i Skoog i Okumara - oznaczenie kinetyny

1962 - Murashige-Skoog - skład uniwersalnej pożywki

1969 - Ericsson i Jonassen - izolacja protoplastu z kultury zawiesinowej

1973 - odkrycie plazmidu Ti u Agrobacterium tumefacjens

Czynniki wzrostu produkcji roślin uprawnych:

- postęp biologiczny

- ochrona roślin

- agrotechnika

Metody kultury in vitro

Cel stosowania kultury in vitro:

1. szybkie wprowadzenie na rynek nowych odmian

2. rozmnażanie genotypów trudno korzeniących się

3. uzyskanie zdrowego i juwenilnego materiału matecznego do dalszej reprodukcji

4. uzyskanie materiału matecznego, wyrównanego genotypowo i fenotypowo - wszystkie rośliny są takie same jak roślina mateczna

5. uzyskanie potomstwa wolnego od chorób wirusowych

6. hodowla twórcza nowych form roślin

7. banki genów (przechowalnie tkanek roślinnych przez długi czas w warunkach in vitro)

Etapy kultury in vitro:

1. uzyskanie sterylnej kultury

2. masowe namnażanie pędów

3. ukorzenienie in vitro

4. aklimatyzacja roślin w szklarni

Zdolność morfologiczna komórek roślinnych.

Totipotencja komórki - nieograniczona zdolność do dzielenia się oraz odtworzenia poszczególnych organów i całego organizmu

Wszystkie komórki rośliny zawierają taka sama informację genetyczną powielona z zygoty

Zróżnicowanie morfologiczne i funkcjonale komórki jest sterowane genetycznie i wynika z zablokowania niektórych genów.

Zdolność do podziałów i wzrostu w kulturze in vitro jest odwrotnie proporcjonalne do:

- stopnia zróżnicowania komórek

- specjalizacji komórek

Dyferencjacja - odróżnicowanie niezbędne do ponownego podjęcia podziałów komórkowych - uaktywnienia zablokowanych genów

Bodźce wyzwalające dyferencjację w kulturach in vitro

- odizolowanie komórek i tkanek od rośliny matecznej

- wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce

Redyferencjajca - powtórne różnicowanie 0dmłodzonych komórek - ponowne zablokowanie genów.

Komórki przydatne do kultur in vitro posiadają:

- żywotne jądro komórkowe

- nieuszkodzone błony plazmatyczne

- cienkie ściany

Eksplantaty najbardziej przydatne do kultur in vitro:

1. komórki merystemów wierzchołkowych, bocznych i interkalarnych

- wierzchołki korzenia i pędu

- zawiązki pędów bocznych

2. fragmenty roślin zawierające komórki kambialne

- perycykl - okolnica - zewnętrzna warstwa komórek walce osiowego w której powstają zawiązki korzeni bocznych

- promienie rdzeniowe - przewodzą i gromadzą substancje zapasowe

- wiązki przewodzące (sitowo naczyniowe)

3. tkanki zdolne do odróżnicowania

- komórki parenchymatyczne rdzenia (komórki miękiszowe)

- bulwy

- kora łodygowa i korzeniowa

- niektóre komórki skórki

Komórki nieprzydatne do kultur in vitro:

1. komórki zróżnicowane i wyspecjalizowane pod względem strukturalnym i fizjologicznym:

- komórki przyszparkowe

- cewki

- włókna

- komórki włośników wydzielniczych

- komórki sklerenchymy

Organogeneza in vitro:

• bezpośrednia

- na eksplantacje tworzą się korzenie, pędy i zarodki

• pośrednia

- organogenezę poprzedza powstanie kalusa

- w kalusie tworzą się centra komórek merystematycznych

Powstanie organów w kulturach in vitro:

1. z merystemów wierzchołkowych z eksplantatem

2. z tkanek zorganizowanych

- międzywęźla łodygowe

- blaszki liściowe

- liścienie

- strefa wydłużenia komórek w korzeniu

3. z tkanek niezorganizowanych

- z kallusa

Pochodzenie organu przybyszowego:

1. od jednej komórki merystematycznej

2. od grupy komórek działających w sposób skoordynowany

3. z grupy komórek odmiennych genetyczne - organ będzie chimerą

Zdolność rośliny do regeneracji in vitro:

1. rośliny okrytonasienne (wysoka)

- rośliny dwuliścienne (+++)

- rośliny jednoliścienne (++)

2. rośliny nagonasienne (niska)

1. gatunki o dużej zdolności morfologicznej (zielne) tytoń, begonia

2. gatunki słabo regenerujące - rośliny drzewiaste

Czynniki od których zależy zdolność roślin do regeneracji in vitro:

1. stan fizjologiczny rośliny wyjściowej

2. zdrowotność rośliny wyjściowej

3. położenie tkanek w roślinie - lepiej regeneruje górna część korzenia

Materiał roślinny do hodowli in vitro:

1. merystemy wierzchołkowe

2. merystemy z pędów przybyszowych, bocznych lub śpiących

3. fragmenty liści

4. fragmenty pędów kwiatostanowych

Składniki pożywki

1. makroelementy N, S, P, K, Mg, Ca, Cl

2. mikroelementy Fe, B, Cu, Mn, Mo, Zn

3. ultramikroelementy Ca, J, Al., Ni

4. Regulatory wzrostu

5. auksyny naturalne

- IAA kwas indolilo-3-octowy

- IBA kwas indolilo-3-masłowy

- PAA kwas fenylooctowy

6. auksyny syntetyczne:

- NAA kwas naftylo-1-octowy

- 2,4D kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy

- dicamba kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy

- picloram kwas 4-amino-3,5,6-trichloropikolinowy

7. auksyny naturalne:

- Zea - zeatyna

- 2iP 6(γγ-dinetyloalliloamino)puryna

8. cytokininy syntetyczne

- K kinetyka

- BA benzyloaminopuryna

- BPA tetrahydropiranylobenzyloadenina

- TDZ tidiazuron

1. gibereliny GA3

2. inhibitory wzrostu ABA

3. witaminy B1, B6, H, PP, C

4. aminokwasy - glicyna pepton

5. węglowodany - sacharoza, glukoza, fruktoza

6. inozytol

7. agar (0,6-1%) lub gerlite (0,2%)

8. węgiel aktywny (0,02-0,035)

9. naturalne substancje biologicznie czynne (mleczko kokosowe, drożdże, sok ananasowy, sok topoli, miękisz dojrzałych bananów, wyciąg z gotowanych ziemniaków)

10. odczyn pożywki powinien wynosić os pH 4,8 do 5,7

Ustalenie pH pożywki przed dodaniem agaru i sterylizacją w autoklawie za pomocą 1nNaOH 1nHCl

Pożywka Knudsona 1946

Ca(NO₃)₂ * 4H₂O 100mg*l^-1

(NH₄)₂SO₄ 500 mg*l^-1

MgSO₄ * 7H₂O 250 mg*l^-1

KH₂PO₄ 250 mg*l^-1

MnSO₄ * 4H₂O 7,5 mg*l^-1

FeSO₄ * 7H₂O 25 mg*l^-1

Sacharoza 20g*l^-1

Pożywka Murashige i Skooga 1962

KNO 1900 mg*l^-1

NH₄NO₃ 1650 mg*l^-1

MgSO₄ * 7H₂O 370 mg*l^-1

KH₂PO₄ 170 mg*l^-1

CaCl *2H₂O 440 mg*l^-1

KJ 0,83 mg*l^-1

H₃BO₄ 6,2 mg*l^-1

MnSO₄*4H₂O 22,3 mg*l^-1

ZnSO4 * 7H₂O 8,6 mg*l^-1

NaMoO * 2H₂O 0,25 mg*l^-1

FeSO₄*7H₂O 27,8 mg*l^-1

Na2EDTA 37,2 mg*l^-1

CuSO₄*5H₂O 0,025 mg*l^-1

CoCl * 6H₂O 0,025 mg*l^-1

Sacharoza30 g*l^-1

Mioinozytol 10 g*l^-1

Kwas nikotynowy PP 0,5 g*l^-1

B6 0,5 g*l^-1

B1 0,1 g*l^-1

MAKROELEMENTY

Azot N

Wchodzi w skład:

- białek w tym enzymów

- aminokwasów

- kwasów nukleinowych

Formy azotu dodawane do pożywek:

* nieorganiczna

- azotanowa KNO

- amonowa NH₄NO₃

* organiczna

- aminokwasy

- peptony

-białko

Siarka S

Wchodzi w skład:

- aminokwasów (cystyna cysteina)

- peptydów i białek

- witamin (biotyna -H, tiamina-B1)

- koenzym A

- olejków eterycznych (cebula czosnek)

-penicyliny

Formy siarki dodawane do pożywek:

* nieorganiczna - siarczanowa MgSO₄ * 7H₂O

* organiczna - aminokwasy, witaminy, preparaty białkowe

Fosfor P

Wchodzi w skład:

- cukrowców

- nukleotydów

- kwasów nukleinowych

- fosfolipidów

- koenzymów

Formy fosforu dodawane do pożywek:

* nieorganiczna - fosforany KH₂PO₄

* organiczna

Chlor Cl

Wchodzi w skład:

- w procesie fotosyntezy (aktywuje transport elektronów między cytochromami)

- w transporcie asymilantów

- w syntezie białka

Formy chloru dodawane do pożywek:

* nieorganiczna - chlorki CaCl₂ CoCl₂

Potas K

Występuje w komórkach w formie jonowej

Bierze udział:

- w regulacji gospodarki wodnej

- aktywuje 40 enzymów

- utrzymuje plazmę w stanie optymalnej hydratacji

Formy potasu dodawane do pożywek:

* nieorganiczna - azotany KNO₃, chlorki KCl, fosforany KH₂PO₄

Wapń Ca

Bierze udział:

- w formowaniu membran w organellach i ścianach komórkowych

- utrzymuje selektywność w transporcie jonów przez błony cytoplazmatyczne

- w polarnym transporcie auksyn

- aktywuje α-amylazę

Formy wapnia dodawane do pożywek:

* nieorganiczna - chlorek wapnia CaCl₂

MIKROELEMENTY

Żelazo Fe

Bierze udział:

- w procesie oksydacyjno - redukcyjnym

- występuje w mitochondriach i chloroplastach

- tworzy związki chylatowe o zmiennej wartości Fe

Formy żelaza dodawane do pożywek:

- kompleks żelaza z kwasem etylenodwuaminoczterooctowym (EDTA) Fe-EDTA

- sól sodowo-żelazowa kwasu EDTA NAFe-NDTA

Bor B

Bierze udział:

- w procesach wzrostu i rozwoju komórek

- w budowie ścian komórkowych i metabolizmie kwasów nukleinowych

- w przemianie węglowodanów i ich transporcie z chloroplastów

Formy boru dodawane do pożywek:

- kwas borowy H₃BO₄

Miedź Cu

Bierze udział:

- w fotosyntetycznym łańcuchu transportu elektronów (występują w wielu enzymach, jest wbudowana w plastocyjaninę)

- w przemianie tłuszczów i innych procesach cycowych roślin

Formy miedzi dodawane do pożywek:

- siarczan miedzi CuSO₄*5H₂O

Molibden Mo

Bierze udział:

- w przemianie azotu

> wiązania N cząsteczkowego, redukcja enzymów

> synteza i działanie kwasu askorbinowego

> metabolizm kwasu fosforowego

- w przemianie tłuszczów i innych procesach cycowych roślin

Formy molibdenu dodawane do pożywek:

- molibdenian sodu NaMoO * 2H₂O

Mangan Mn²⁺

Bierze udział:

- w utrzymaniu równowagi układu oksydacyjno - redukcyjnego formy 2- i 3-wartościowe

- aktywator fotolizy wody

- działa wymiennie z magnezem

Formy manganu dodawane do pożywek:

- siarczan manganu MnSO₄*4H₂O

ULTRAMIKROELEMENTY

Jod J

Bierze udział:

- rola nie jest dokładnie znana

Wchodzi w skład:

- białek

Formy jodu dodawane do pożywek:

- jodek potasu KJ

Nikiel Ni

Bierze udział:

- aktywuje enzymy cyklu cytrynianowego

Wchodzi w skład:

- transfosforylazy

Formy niklu dodawane do pożywek:

- chlorek niklu NiCl * 6 H₂O

Glin Al.

Bierze udział:

- aktywuje wzrost i rozwój roślin wyższych

- poprawia pęcznienie cytoplazmy

- aktywuje oksydazę askorbinową

Wchodzi w skład: herbaty (2,5g/dm³) paproci, skrzypów

Formy glinu dodawane do pożywek:

- chlorek gliny AlCl₃

WITAMINY

Proste związki organiczne występujące w roślinach w niskim stężeniu.

Funkcja:

- regulująca

- biokatalityczna

Podział witamin:

- rozpuszczalne w tłuszczach A, D, E, K

- rozpuszczalne w wodzie C, B, PP H, kwas foliowy, inozytol

Tiamina (B1, aneuryna)

Bierze udział:

- w procesie oddychania i fotosyntezy

- w przemianie węglowodanów

Wchodzi w skład: koenzymu pirofosforanu tiaminy

Formy dodawane do pożywek:

- chlorowodorek aneuryny 0,1-10 mg/ dm³

Ryboflawina (B6, G)

Bierze udział:

- w przemianie glukozy i aminokwasów w komórkowym procesie utleniania

Wchodzi w skład:

- monomukleotydy flawinowego FMN

- dwunokleotydu flawinoadeninowego FAD

Formy dodawane do pożywek:

- ryboflawina 0,1-10 mg/ dm³

Kwas pantotenowy (B3, B5)

Bierze udział:

- w reakcjach metabolizmu węglowodanów, tłuszczów i białek

- w przemianie energii

Wchodzi w skład: koenzymu A

Formy dodawane do pożywek:

- pantotenian wapnia 0,1-2,5 mg/ dm³

Pirydoksyna (B6, adermina)

Bierze udział:

- w syntezie fosforanu pirydoksalu - koenzymu biorącego udział w reakcjach enzymatycznej transaminacji i dekarboksylacji aminokwasów do amin

Formy dodawane do pożywek: chlorowodorek aderminy

Biotyna H

Bierze udział:

- w asymilacji CO₂

- karboksylacji acetylokoenzymu A - pierwszy etap syntezy kwasów tłuszczowych

Wchodzi w skład: koenzymu karboksybiotyny

Formy dodawane do pożywek: biotyna 0,01-10 mg/ dm³

Kwas nikotynowy (PP, niacyna = amid kwasu nikotynowego)

Bierze udział:

- w reakcjach odwodorowania jako akceptor i dawca wodoru

Wchodzi w skład:

- koenzymu NAD

- koenzymu NADP

Formy dodawane do pożywek: kwas nikotynowy 0,25-10 mg/ dm³

Kwas askorbinowy C

Bierze udział:

- w reakcjach utleniania komórkowego szczególnie tyrozyny

- w opóźnianiu starzenia się tkanek i jej brunatnieniu

- hydroksylacji proliny (aminokwasu)

Formy dodawane do pożywek: kwas askorbinowy 1-100 mg/ dm³

FITOHORMONY występują w bardzo niskich stężeniach i regulują:

- procesy syntezy enzymów na poziomie komórki

- wzrost roślin

- podziały i różnicowanie komórek

- występowanie tropizmów

- rozwój, dojrzewanie i starzenie się tkanek

AUKSYNY

IAA

Funkcja:

- indukuje szybki wzrost tkanki kalusowej zwłaszcza przy współudziale kinetyny (10-25 mg/ dm³, niektóre zboża 100 mg/ dm³

- indukuje ukorzenianie pędów 1-10 mg/ dm³

NAA

Funkcja:

- silnie stymuluje powstawanie i wzrost tkanki kalusowej, zwłaszcza przy współudziale BA i 2iP

- indukuje ukorzenianie pędów 0,01-10 mg/ dm³

IBA

Funkcja:

- syntetyczna auksyna stosowana do pobudzenia tkanki kalusowej do organogenezy

- indukuje ukorzenianie pędów 1-10 mg/ dm³

2,4D

Funkcja:

- syntetyczna auksyna o najsilniejszym działaniu

- indukuje szybkie rozmnażanie komórek kallusa i największy przyrost tkanki kalusowej

GIBERELINY tworzą się w wierzchołkach korzeniu i pędów, najmłodszych liściach, kwiatach, niedojrzałych nasionach, kiełkujących zarodkach. Znanych jest 99 związków.

Funkcja:

- wydłużanie pędów

- stymulacja wydłużenia i podziału komórek

- zwiększają aktywność kambium

CYTOKININY - pochodne adeniny syntetyzowane głównie w korzeniach i transportowane do pędów. Działają antagonistycznie do auksyn, zmniejszając dominację wierzchołkową i sprzyjają wzrostowi pędów bocznych.

Funkcja: wpływają na podziały komórkowe

2iP - stymuluje regeneracje paków przybyszowych

Kinetyna - stymuluje podziały komórkowe, aktywuje syntezę kwasów nukleinowych, stymuluję organogenezę tkanki kalusowej, pobudza tkanki dojrzałe.

BAP - stymuluje przyrost masy komórkowej

PBA - stymuluje regenerację tkanki kalusowej.

Przygotowanie pożywki:

• stężone roztwory macierzyste

- 50x, 100x, 200x, 1000x

• nie tworzą związków chemicznych

- wytrącających się

- inaktywujących się

Rozpuszczanie auksyn

• 10mg auksyny

• 1nNaOH lub KOH - 0,3ml

• 10ml H₂O

Rozpuszczanie cytokinin

• 10mg cytokininy

• 1nHCl- 0,3ml

• 10ml H₂O

Rozpuszczanie giberelin

• 10mg gibereliny

• 1nNaOH

• 10ml H₂O w temp 70^oC

Sporządzanie pożywki:

Każdy kolejny składnik dodaje się po całkowitym rozpuszczeniu poprzedniego

Wyjaławianie pożywki

* sterylizacja termiczna w autoklawie

- temp 121^oC

- nadciśnienie 1 atm

- 20 min.

---